一种bsa单抗制备方法
阅读说明：本技术 一种bsa单抗制备方法 (Preparation method of BSA (bovine serum albumin) monoclonal antibody ) 是由 韩之波 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种BSA单抗制备方法,所述制备方法为：制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽,并取其中5mg多肽与KLH偶联；动物免疫：选取五只小白鼠,首先进行初次免疫,接着进行第二次免疫,并重复第二次免疫步骤对小白鼠进行第三次免疫,接着进行第四次免疫；细胞融合；筛选：选择阳性值高且单克隆的孔；培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞；得到纯化的单克隆抗体。本发明能够制备出大量的单克隆抗体,将制备的抗体分装后在-20℃温度下保存,短期内使用在2-8℃存放,使用时,仅需按所需浓度将此溶液进行稀释,现配现用,大大提高了抗体的生产量,并通过检验发现单克隆抗体抗体能够与BSA结合,不能够与HAS结合,为未来医学发展奠定了基础。(The invention provides a preparation method of a BSA (bovine serum albumin) monoclonal antibody, which comprises the following steps: preparing polypeptide: firstly, 10mg of polypeptide with the purity of 90% is prepared, and 5mg of polypeptide is coupled with KLH; animal immunization: selecting five mice, firstly carrying out primary immunization, then carrying out secondary immunization, repeating the step of the secondary immunization, carrying out third immunization on the mice, and then carrying out fourth immunization; fusing cells; screening: selecting a hole with a high positive value and a single clone; culturing and amplifying the selected monoclonal hybridoma cells and freezing and storing the cells; obtaining the purified monoclonal antibody. The invention can prepare a large amount of monoclonal antibodies, the prepared antibodies are stored at the temperature of 20 ℃ below zero after being subpackaged, and are stored at the temperature of 2 ℃ to 8 ℃ in a short time, when in use, the solution is diluted according to the required concentration, and is prepared for use, so that the production of the antibodies is greatly improved, and the monoclonal antibodies can be combined with BSA and cannot be combined with HAS through detection, thereby laying the foundation for the future medical development.)
技术领域
本发明属于单抗制备方法领域，尤其涉及一种BSA单抗制备方法。
背景技术
单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
单抗制备的过程主要是：1.免疫动物：免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程，一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
2.细胞融合：采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平器皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3.选择性培养：选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡，未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
5.单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
(1)体内诱生法：取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法：将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限，各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种BSA单抗制备方法，所述BSA单抗制备方法为：
S1：制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽，其中多肽的肽序为KEACFAVEGPKLVVSTQT，取其中5mg多肽与KLH偶联；
S2：动物免疫：选取五只小白鼠，首先进行初次免疫，将KLH偶联多肽与等体积福氏完全佐剂混合，等到乳化后对小白鼠进行皮下免疫，为每只小白鼠皮下注射400ul乳化液；接着进行第二次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，并重复第二次免疫步骤对小白鼠进行第三次免疫，进行第三次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第三次免疫后小白鼠的血清保存；接着进行第四次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，第四次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第四次免疫后小白鼠的血清保存；
S3：细胞融合：复苏和培养小白鼠骨髓瘤细胞，取四次免疫后终免的小白鼠脾脏并用培养基制备成单个细胞悬液，按1：5的比例混合小白鼠的骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，加入PEG进行细胞融合，制成融合细胞液，将100ul/孔的2×HAT完全培养基铺入96孔板中，在每个孔内加入100ul融合细胞液，在融合细胞培养过程中用1×HAT进行半量换液；
S4：筛选：用Balb/c健康小鼠制备饲养细胞，有限稀释选好的融合孔细胞，用1×HAT培养液稀释细胞，将细胞悬液分别加入含饲养细胞的96孔中，浓度分别为100ul/孔，孔中分别含有0.75、1.5和3个饲养细胞，并加入含有质量分数为5％的CO2，在37℃的温度下对饲养细胞进行培养；10天后在显微镜下观察饲养细胞克隆生长情况，用ELISA检测细胞克隆孔，选择阳性值高且单克隆的孔，且筛选出来的抗体能够与BSA结合，不能够与HAS结合；
S5：细胞扩增：培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞；
S6：抗体生产纯化：将小白鼠用石蜡致敏后，向小白鼠的腹腔内注射杂交瘤细胞；观察7-10天后小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水；进行预处理后的腹水使用Protein G柱子进行孵育，洗脱，最终得到纯化的单克隆抗体；
S7：单克隆杂交瘤细胞样本检验：首先利用Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，再使用SMART Race技术将样品RNA反转录成cDNA；利用TransFastPfuFly DNAPolymerase试剂盒扩增并获得重链和轻链可变区；使用T4连接酶将目标片段连接至pUC57载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，后挑取单克隆进行测序，最后使用IMGT/V-QUEST数据库进行测序结果比对做进一步分析，并得到检验结果。
优选的，所述ELISA检测步骤为：
(1)抗原包被量为100ng/孔，其中抗原为HAS、BSA标准品，每孔浓度为100ul，利用PBS进行稀释，在4℃温度下保存17-19h；
(2)倒掉上清液，每孔加入200ul的无蛋白封闭剂，在37℃温度下，震荡2h；
(3)倒掉上清液，拍干液体，在-20℃温度下冻存备用；
(4)冻存后取出包被好的板子放至室温，每孔加入100ul的血清稀释液，在37℃温度下放置1h。
(5)用0.1％的PBST洗板3次；
(6)用辣根酶标记山羊抗小鼠，并用浓度为1ul、体积10ml的PBS稀释，在37℃温度下放置45min；
(7)用PBST洗板3次；
(8)在每个孔中加入100ul的TMB，在37℃温度下放置15min；
(9)加入2M盐酸终止液终止反应，并利用450nm波长测OD值。
优选的，所述ELISA检测细胞克隆孔过程中，若检测不确定是单克隆，则需要进行第二次有限稀释。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过制备多肽、动物免疫、细胞融合、筛选、细胞扩增、抗体生产纯化以及对单克隆杂交瘤细胞样本检验七个步骤进行单抗制备，能够制备出大量的单克隆抗体，将制备的抗体分装后在-20℃温度下保存，短期内使用2-8℃存放，使用时，仅需按所需浓度将此溶液进行稀释，现配现用，大大提高了抗体的生产量，并通过检验发现单克隆抗体抗体能够与BSA结合，不能够与HAS结合，为未来医学发展奠定了基础。
附图说明
图1是本发明的第三次免疫后和第四次免疫后小鼠血清效价比较图；
图2是本发明的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合长出克隆后整板ELISA检测结果图；
图3是本发明的阳性融合孔复测结果图；
图4是本发明的有限稀释阳性孔复测结果图；
图5是本发明的第二次有限稀释克隆孔及上一级扩增细胞检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下对本发明做进一步描述：
实施例：
一种BSA单抗制备方法，所述BSA单抗制备方法为：
(1)制备多肽：首先制备10mg纯度为90％的多肽，其中多肽的肽序为KEACFAVEGPKLVVSTQT，并取其中5mg多肽与KLH偶联；
(2)动物免疫：选取五只小白鼠，首先进行初次免疫，将KLH偶联多肽与等体积福氏完全佐剂混合，等到乳化后对小白鼠进行皮下免疫，为每只小白鼠皮下注射400ul乳化液；接着进行第二次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，并重复第二次免疫步骤对小白鼠进行第三次免疫，进行第三次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第三次免疫后小白鼠的血清保存；接着进行第四次免疫，将1mg/ml的KLH抗原与等体积福氏不完全佐剂进行1:1的混合并乳化，并向每只小白鼠的腹腔注射200ul乳化液，第四次免疫的10天后，分别在每只小白鼠的眼静脉取血，并进行离心处理，取血清进行ELISA检测，并将第四次免疫后小白鼠的血清保存，如附图1所示，将第三次免疫后和第四次免疫后小鼠血清进行效价比较，其中所述ELISA检测步骤为：
1.抗原包被量为100ng/孔，其中抗原为HSA和BSA标准品，每孔浓度为100ul，利用PBS进行稀释，在4℃温度下保存17-19h；
2.倒掉上清液，每孔加入200ul的无蛋白封闭剂，在37℃温度下，震荡2h；
3.倒掉上清液，拍干液体，在-20℃温度下冻存备用；
4.冻存后取出包被好的板子放至室温，每孔加入100ul的血清稀释液，在37℃温度下放置1h。
5.用0.1％的PBST洗板3次；
6.用辣根酶标记山羊抗小鼠，并用浓度为1ul、体积10ml的PBS稀释，在37℃温度下放置45min；
7.用PBST洗板3次；
8.在每个孔中加入100ul的TMB，在37℃温度下放置15min；
9.加入2M盐酸终止液终止反应，并利用450nm波长测OD值；
(3)细胞融合：复苏和培养小白鼠骨髓瘤细胞，取四次免疫后终免的小白鼠脾脏并用培养基制备成单个细胞悬液，按1：5的比例混合小白鼠的骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，加入PEG进行细胞融合，制成融合细胞液，将100ul/孔的2×HAT完全培养基铺入96孔板中，在每个孔内加入100ul融合细胞液，在融合细胞培养过程中用1×HAT进行半量换液；
(4)筛选：如附图2所示，对融合克隆孔利用ELISA方法进行检测，根据图2的结果选取选择1#1A4，1#3G2，1#3F4进行有限稀释，如附图3所示，对阳性融合孔使用BSA、HSA标准品进行复测，复测后用Balb/c健康小鼠制备饲养细胞，有限稀释选好的融合孔细胞，用1×HAT培养液稀释细胞，将细胞悬液分别加入含饲养细胞的96孔中，浓度分别为100ul/孔，孔中分别含有0.75、1.5和3个饲养细胞，并加入含有质量分数为5％的CO2，在37℃的温度下对饲养细胞进行培养；10天后在显微镜下观察饲养细胞克隆生长情况，用ELISA检测细胞克隆孔，选择阳性值高且单克隆的孔，如附图4所示，若检测不确定是单克隆，需要进行第二次有限稀释，并如附图5所示，利用ELISA方法对第二次有限稀释克隆孔检测，结果显示都为阳性值，可以挑选阳性值高且细胞状态好的细胞株进行扩增，且筛选出来的抗体能够与BSA结合，不能够与HAS结合；
(5)细胞扩增：培养扩增所选择的单克隆杂交瘤细胞并冻存细胞，得到的冻存细细胞株为：JN-1033-1N-F3F4-D6-E5，JN-1033-1N-F3F4-D6-C8，JN-1033-1N-F3G2-B5-B5；
(6)抗体生产纯化：将小白鼠用石蜡致敏后，向小白鼠的腹腔内注射杂交瘤细胞；观察7-10天后小鼠腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水；进行预处理后的腹水使用Protein G柱子进行孵育，洗脱，最终得到纯化的单克隆抗体。
(7)如附图2所示，单克隆杂交瘤细胞样本检验：首先利用Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，再使用SMART Race技术将样品RNA反转录成cDNA；利用TransFastPfuFly DNA Polymerase试剂盒扩增并获得重链和轻链可变区；使用T4连接酶将目标片段连接至pUC57载体，并将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，后挑取单克隆进行测序，最后使用IMGT/V-QUEST数据库进行测序结果比对做进一步分析。
具体的，重链和轻链可变区的测序结果为：
重链可变区碱基序列：
GATGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATATATTAGTACTGACAGTAGTTTGATCTACTATGGAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTCTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGATTCTTTCTGCGTTCCGGGTTTGCTGATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGATGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCGGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTTAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGTCAGGCTCCAGAGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCATATATTAGTACTGACAGTAGTTTGATCTACTATGGAGACACAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATCCCAAGAACACCCTCTTCCTGCAAATGACCAGTCTAAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGATTCTTTCTGCGTTCCGGGTTTGCTGATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA；
重链可变区氨基酸序列：
DVQLVESGGDLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISTDSSLIYYGDTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARFFLRSGFADWGQGTLVTVSADVQLVESGGDLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISTDSSLIYYGDTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARFFLRSGFADWGQGTLVTVSA；
轻链可变区碱基序列：
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGaAATCTCCTAAGCCCCTGATCTATCGTGCAAAAAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGCGTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAGACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGCAAGGCGAGTCAGGACATTAATAGCTATTTAAGTTGGTTCCAGCAGAAACCAGGGAAATCTCCTAAGCCCCTGATCTATCGTGCAAAAAGATTGGTAGATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTCTACAGTATGATGCGTTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA；
轻链可变区氨基酸序列：
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKPLIYRAKRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDAFPLTFGAGTKLELKDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKPLIYRAKRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDAFPLTFGAGTKLELK。
需要说明的是，在本文中，而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
一种BSA单抗制备方法
申请人：天津昂赛细胞基因工程有限公司
重链可变区碱基序列：
gatgtgcagttggtggagtctgggggagacttagtgcagcctggagggtcccggaaactctcctgtgcagcctctggattcacttttagtagctttggaatgcactgggttcgtcaggctccagagaaggggctggagtgggtcgcatatattagtactgacagtagtttgatctactatggagacacagtgaagggccgattcaccatctccagagacaatcccaagaacaccctcttcctgcaaatgaccagtctaaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagattctttctgcgttccgggtttgctgattggggccaagggactctggtcactgtctctgcagatgtgcagttggtggagtctgggggagacttagtgcagcctggagggtcccggaaactctcctgtgcagcctctggattcacttttagtagctttggaatgcactgggttcgtcaggctccagagaaggggctggagtgggtcgcatatattagtactgacagtagtttgatctactatggagacacagtgaagggccgattcaccatctccagagacaatcccaagaacaccctcttcctgcaaatgaccagtctaaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagattctttctgcgttccgggtttgctgattggggccaagggactctggtcactgtctctgca；
重链可变区氨基酸序列：
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轻链可变区碱基序列：
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轻链可变区氨基酸序列：
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