抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段及应用
阅读说明：本技术 抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段及应用 (anti-Siglec-15 antibody or antigen binding fragment thereof and application ) 是由 赵永浩 史新震 张崇骞 李虹侠 汤春 宗超 张楠 张媛媛 马赛 闫成海 张晓霞 于 2021-01-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供了抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段,特别是Siglec-15人源化单克隆抗体,该抗体包括重链和轻链并以高亲和力特异性结合于Siglec-15。本发明还提供了编码本发明抗体的核酸序列、克隆或表达载体、宿主细胞以及在体外实验中抗肿瘤效果。本发明进一步提供了抗Siglec-15抗体治疗各种癌症的用途。(The invention provides antibodies or antigen-binding fragments thereof against Siglec-15, particularly Siglec-15 humanized monoclonal antibodies that include a heavy chain and a light chain and specifically bind to Siglec-15 with high affinity. The invention also provides a nucleic acid sequence encoding the antibody, a cloning or expression vector, a host cell and an anti-tumor effect in an in vitro experiment. The invention further provides the use of anti-Siglec-15 antibodies for the treatment of various cancers.)
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及抗体技术领域及免疫领域，更具体的涉及抗Siglec-15的抗体的制 备及其应用，特别是通过调节肿瘤微环境中Siglec-15介导的免疫抑制，尤其是抑制T细胞增殖，来治疗 实体瘤。
背景技术
Siglec唾液酸结合性Ig样凝集素家族是Ig超家族的成员，表达于各种白细胞上，能识别细胞表面表 达的糖蛋白唾液酸结构，介导信号转导。Siglec家族是已知最大的一组识别唾液酸化聚糖的脊椎动物凝集 素(Varki andAngata 2006；Crocker et al.2007)。在免疫系统中表达的大多数哺乳动物Siglecs在胞浆结构 域中具有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，已证明这些Siglecs对表达它们的细胞具有负调控作用(Otipoby et al.1996；Sato et al.1996；Nitschke et al.1997；Mingari et al.2001；Ulyanova et al.2001；Nutku et al.2003； von Gunten et al.2005)。最近发现的Siglecs与信号衔接分子DNAX活化蛋白DAP12相关，该蛋白具有基 于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)并参与免疫细胞活化(Takamiya等人，糖生物学，23(2):178-87(2013))， 这揭示了Siglecs亚组具有激活信号通路的潜力(Angata et al.2006；Blasius et al.2006)。
Siglec-15又称CD33L3，是Siglec家族中新发现的成员。Siglec-15是一种I型跨膜蛋白，具有244个 氨基酸的胞外域，包括Ig样V型结构域和Ig样C2型结构域。Siglec-15在免疫系统的细胞上表达，可以 识别唾液酸化配体，并可以通过跨膜结构域中的赖氨酸残基与信号衔接分子DNAX活化蛋白DAP12和 DAP10相互作用。Siglec-15是脊椎动物进化过程中保守的免疫系统Siglec(TakashiAngata等。糖生物学， 2007)。之前的几项研究表明，Siglec-15在破骨细胞分化中发挥重要作用(Yoshiharu Hiruma et al.生物化学 和生物物理研究通信2011；Norihiro Ishida-Kitagawa et al.生物化学杂志，2012)。破骨细胞前体上的Siglec-15 识别相邻破骨细胞前体上的CD44，并通过DAP12-Syk途径转导信号，与RANK-TRAF6途径交叉对话并 增强下游信号(例如ERK和PI3K-AKT)。
Siglec-15还参与免疫细胞和肿瘤微环境的调节。研究显示Siglec-15优先结合唾液酸 -Tn(Neu5Acα2–6GalNAcα1)结构，在几种肿瘤相关抗原如MUC-1中发现该结构，其高表达与不良预后相 关(TakashiAngata et al.糖生物学，2007；Jennifer Munkley，国际分子科学杂志，2016)。Siglec-15在各种 人类肿瘤组织的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)上表达，其在巨噬细胞集落刺激因子诱导的M2样巨噬细胞 中表达显著升高，与阴性细胞相比，Siglec-15对sTn阳性细胞产生更多的转化生长因子-β(TGF-β)，这表明 Siglec-15识别肿瘤sTn抗原并转导TAMs中TGF-β分泌增强的信号。陈列平近期的研究(Jun Wang et al. 自然医学，2019)表明，Siglec-15可能是一个重要的免疫检查点，仅在表达PD-L1的肿瘤细胞上表达，并 与T细胞上表达的未知受体相互作用，负调控T细胞增殖。在小鼠肿瘤模型中，抗Siglec-15的抗体在体 外T细胞增殖挽救实验中显示具有抗肿瘤疗效。
发明内容
本发明提供了抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，特别是Siglec-15人源化单克隆抗体，该抗体 包括重链和轻链并以高亲和力特异性结合于Siglec-15。本发明还提供了编码该抗体的核酸序列、克隆或 表达载体、宿主细胞以及在体外实验中抗肿瘤效果。本发明进一步提供了Siglec-15抗体治疗各种癌症的 用途。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包括：重链可变区VH 序列，所述VH序列与选自包括以下序列的组中的氨基酸序列具有至少95％的一致性：SEQ ID NO：1， SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：12， SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO： 23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO： 43，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：47；轻链可变区VL序列，所述VL序列与选自包括以下序列的组中 的氨基酸序列具有至少95％的一致性：SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQID NO： 8，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：19，SEQID NO：20，SEQID NO：21，SEQ ID NO： 22，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO： 34，SEQ ID NO：38，SEQID NO：42，SEQ IDNO：44，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：48。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包括：VH/VL序列对， 所述的VH/VL序列对与选自包括以下序列对的组中的VH和VL氨基酸序列对具有至少95％的一致性： SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，SEQID NO：5和SEQ ID NO：6， SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：8，SEQID NO：10和SEQ ID NO： 8，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：16和SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：17和 SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19，SEQ ID NO： 18和SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：18和SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：22，SEQID NO：15和SEQ ID NO：22， SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：18和SEQ ID NO： 22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25和SEQID NO：26，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：32和 SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34，SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：33，SEQ ID NO： 32和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：40和SEQ IDNO：38，SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42， SEQ IDNO：43和SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45和SEQID NO：46，SEQ ID NO：47和SEQ ID NO： 48。
序列如下表所示：
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包含选自以下的一个或 多个重链互补决定区HCDR的序列:(1)HCDR1，其包含与选自SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:61，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:74，SEQ IDNO:77，SEQ ID NO:90的氨基酸序列 具有至少95％同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(2)HCDR2，其包含与选自SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:70，SEQ ID NO:75，SEQ ID NO:78，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83， SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:87，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:97，SEQ ID NO:98的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(3)HCDR3，其包含与选自 SEQ IDNO:51，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:71的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨 基酸序列或由以上序列组成；(4)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的上述 (1)、(2)和(3)的HCDR。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包含选自以下的一个或 多个轻链互补决定区LCDR的序列:(1)LCDR1，其包含与选自SEQ ID NO：52，SEQ IDNO：58，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO:81，SEQ ID NO：100，SEQ IDNO：93，SEQ ID NO：99 的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(2)LCDR2，其包含与选自SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:73，SEQ ID NO:76，SEQID NO:79，SEQ ID NO:82，SEQ ID NO:84， SEQ ID NO:88的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(3)LCDR3，其包 含与选自SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:94，SEQ ID NO:96的氨基酸序列 具有至少95％同一性的氨基酸序列或由以上序列组成；(4)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸 取代、缺失或插入的上述(1)、(2)和(3)的LCDR。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包含HCDR1/HCDR2/HCDR3组合和/或LCDR1/LCDR2/LCDR3组合：(1)HCDR1/HCDR2/HCDR3组合包含选自以下的一组或多组重链互补决定区HCDR的序列：HCDR1/HCDR2/HCDR3选自为SEQ IDNO: 49/SEQ ID NO:50/SEQ ID NO:51，SEQ ID NO:55/SEQ ID NO:56/SEQ ID NO:57，SEQID NO:61/SEQ ID NO:62/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:68/SEQ ID NO:63，SEQID NO:69/SEQ ID NO:70/SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:75/SEQ ID NO:63，SEQID NO:77/SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:63， SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:80/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:83/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:85/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:/SEQ ID NO:78/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:87/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:90/SEQ ID NO:85/SEQ IDNO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:91/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:92/SEQ IDNO:63， SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:95/SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:97/SEQID NO:63，SEQ ID NO:74/SEQ ID NO:98/SEQ ID NO:63；(2)LCDR1/LCDR2/LCDR3组合包含选自以下的一组或多组轻链 互补决定区LCDR的序列:LCDR1/LCDR2/LCDR3选自为SEQ IDNO:52/SEQ ID NO:53/SEQ ID NO:54， SEQ ID NO:58/SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:60，SEQID NO:64/SEQ ID NO:65/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO: 72/SEQ ID NO:73/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:76/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:79/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:81/SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:84/SEQ IDNO:66，SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:82/SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:64/SEQ ID NO:88/SEQ IDNO:66， SEQ ID NO:100/SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:93/SEQ ID NO:88/SEQID NO:94，SEQ ID NO:93/SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:96，SEQ ID NO:99/SEQ ID NO:88/SEQID NO:89，SEQ ID NO: 99/SEQ ID NO:88/SEQ ID NO:96；(3)含有一处或多处不超过5个氨基酸的对上述CDRs的氨基酸序列 的取代、缺失或插入。
序列如下表所示：
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，包括：人恒定结构域， 所述人恒定结构域为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM结构域。
在一些实施方案中，人IgG恒定结构域为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4结构域。
在一些实施方案中，所述抗Siglec-15的抗体是鼠源单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化抗体、单 链抗体，其轻链恒定区任选人抗体κ链或λ链恒定区，重链恒定区任选人抗体IgG1或IgG4的恒定区，以 及IgG1或IgG4的恒定区的突变体。
在一些实施方案中，所述抗体包括单特异性抗体、双特异性抗体或融合蛋白、三特异性抗体或融合 蛋白或多特异性抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了双特异性抗体或双特异性融合蛋白，双特异性抗体或双特异性融 合蛋白的另一端靶向肿瘤细胞的肿瘤相关抗原或者靶向免疫细胞的免疫检验靶点，包含EGFR，HER2， CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3 等。
在一些实施方案中，本发明提供了三特异性抗体或三特异性融合蛋白，三特异性抗体或三特异性融 合蛋白的另两端靶向肿瘤细胞的肿瘤相关抗原或者靶向免疫细胞的免疫检验靶点，包含EGFR，HER2， CD47，PD-1，PD-L1，CTLA4，TGFβ，VEGF，HER3，TIGIT，CLAUDIN18.2，CD3，TIM3，LAG3 等。
在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸序列，其编码上述的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片 段。
优选地，本发明所提供的一种核酸序列，包含SEQ ID NO:101、SEQ ID NO：102、SEQID NO：103、 SEQ ID NO:104序列。如下表所示：
在一些实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含上述核酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述表达载体，优选所述宿主细胞选自哺 乳动物细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，包括上述抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段 (也包括双特异性抗体或融合蛋白、三特异性抗体或融合蛋白)，和药学上任选的药用载体。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段在表达或过度表达 Siglec-15癌症细胞、巨噬细胞或癌症上有治疗活性。
在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段，可抑制破骨细胞生成并 用于治疗骨质疏松症。
在一些实施案例中，本发明提供了抑制破骨细胞生成的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量 的上述的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本发明提供了抗Siglec-15的抗体、其抗原结合片段、双特异性抗体、双特异性 融合蛋白、三特异性抗体、三特异性融合蛋白，和药学上任选的药用载体，在制备治疗肿瘤的药物中的 应用，所述肿瘤选自黑素瘤、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部 或颈部癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌和直肠癌。
此外，在一些实施方案中，本发明所提供的抗Siglec-15的抗体或其抗原结合片段能够增强免疫应答、 阻碍或防止肿瘤生长、抑制肿瘤介导的免疫抑制、消除肿瘤、消耗或阻断肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的 活性以便改变其活性、降低TAM介导的免疫抑制、减少或逆转T细胞抑制；可增强细胞因子为IFNγ、 TNF-α分泌，以及对CD4+T细胞或CD+T细胞的激活；可增加Siglec-15与其配体的结合和/或增加或增 强Siglec-15介导的信号转导。抗体经修饰后，还将表现出削弱、增强的或无Fc受体(FcR)结合活性以及 增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
本发明的有益效果如下：
该发明的抗Siglec15抗体从抗原设计与合成、小鼠免疫、细胞融合、杂交瘤筛选、亚克隆鉴定以及 体外蛋白结合实验、亲和力鉴定、表位鉴定、与人/小鼠/食蟹猴的细胞结合实验、及T细胞相关的功能 实验、抗体人源化、抗体亲和力成熟、破骨细胞分化实验等一系列技术路线筛选得到了具有良好生物活 性的鼠源抗体(11H5E6、48B5B1及69C4D8)及一系列人源化及亲和力成熟的抗体分子，L2H1-58-PTM、 14-58-2等抗体分子在细胞结合实验中显示出优于对照抗体5G12的亲和力，且在体外T细胞增殖等实验 中展示了优良的活性。与对照抗体结合表位及序列具有明显差异。在癌症及疏松领域中具有较大的应用 前景。
附图说明
图1显示BPSL15-C蛋白的SDS-PAGE实验鉴定结果。
图2a显示小鼠血清与人Siglec-15蛋白结合的ELISA实验检测抗体滴度的结果；图2b显示小鼠血 清与人Siglec-15蛋白结合的FACS实验检测抗体滴度的结果。
图3显示通过抗原结合ELISA筛选后，选择的克隆与表达人siglec-15的CHOS细胞结合的FACS 实验鉴定的结果。
图4a和图4b显示对亚克隆成功的杂交瘤细胞株，进行空白CHOS细胞和表达人siglc-15的CHOS 细胞FACS对比筛选结果。
图5a、图5b、图5c和图5d分别显示将通过鉴定的26个亚克隆细胞株进行抗体表达，表达上清液 分别与空白CHOS细胞、表达人Siglec-15的CHOS细胞、表达食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞和表达 小鼠Siglec-15的CHOS细胞分别进行细胞结合鉴定的实验结果。
图6显示26个杂交瘤细胞株所产生的抗体上清与4个血细胞供体的恢复CD4/CD8 T细胞增殖实验 结果。
图7a和图7b显示26个杂交瘤细胞上清纯化的抗体进行破骨细胞分化实验。
图8显示11H5E6、48B5B1及69C4D8三个抗体通过Fortebio测定的亲和力结果。
图9a、图9b、图9c显示11H5E6、48B5B1及69C4D8三个嵌抗体抗体分别与表达人Siglec-15的 CHOS细胞、表达食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞和表达小鼠Siglec-15的CHOS细胞分别进行FACS细 胞结合的实验结果。
图10a和图10b显示30C2B12嵌合抗体及阴性对照抗体T细胞增殖实验结果。
图11显示通过BLI技术(ForteBio)检测候选抗体与5G12的相对结合表位的实验结果。
图12a、图12b、图12c显示通过熔解曲线进行热稳定性实验的结果。
图13显示人源化抗体通过Fortebio测定的亲和力结果。
图14显示人源化抗体与表达人Siglec-15的CHOS细胞进行FACS亲和力的实验结果。
图15显示人源化抗体在恢复T细胞增殖实验结果。
图16显示亲和力成熟抗体与表达人Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图17显示亲和力成熟抗体与表达鼠Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图18显示亲和力成熟抗体与表达食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图19显示亲和力成熟抗体抗体通过Fortebio测定的亲和力结果
图20显示设计优化过的抗体与表达人Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图21显示设计优化过的抗体与表达食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图22显示设计优化过的抗体与表达小鼠Siglec-15的CHOS细胞进行FACS细胞结合的实验结果。
图23、图24、图25显示L2H1-58-PTM、14-58-2抗体分子恢复T细胞增殖实验结果。
具体实施方式
在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些 可以变化调整。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围， 其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中 普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
术语定义：
术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克 隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。 “抗体”(或“Abs”)和“免疫球蛋白”(或“Igs”)是具有相同结构特征的糖蛋白，抗体通常将包 含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可 仅包含重链。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接(也称为“VH/VL对”)，每条重链和轻链也具有 规则排列的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链的一 端有一个可变结构域(VL)，另一端有一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐， 并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
术语“单克隆抗体”是指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，不涉及其制备的方法。单克隆 抗体或其免疫活性片段可以通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术等或其它本领域已 知的生产技术来产生，本发明中涉及单克隆抗体制备的方法包括杂交瘤细胞体外培养制备或通过DNA重 组技术制备。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定 簇。
术语“可变”是指这样的事实，即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化程度较高，并用于每种 特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，变异性不均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在 轻链和重链可变区中的三个区段，被称为互补决定区(CDRs)或高变区。可变域中更高度保守的部分被 称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，两条轻链和重链可变区从N-末端到 C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。大部分FR区采用β-折叠构型， 通过三个CDRs连接，形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过 FR区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的CDRs一起促成抗体的抗原结合位点的形成。请参考，例如， Kabat等人，免疫学的蛋白质序列，第五版，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种生物学效应功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补 体杀伤途径(CDC)等。
根据抗体重链恒定区的氨基酸序列进行区分，将抗体可以分为5类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM， 并且这些类别中的几种同种型别可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。 对应于不同种类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。根据抗体轻链恒定区(CL)的不 同可以划分κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接， 且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。
“抗原结合片段片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分能够结合完 整抗体结合的抗原。其中该部分不含完整抗体的Fc区中的恒定重链结构域(即CH2，CH3和CH4，取 决于抗体同种型)。抗体免疫活性片段的实例包括Fab，Fab′，Fab′-SH，F(ab′)2，ScFv和Fv片段。Fab 片段包括重链/轻链可变区和轻链的恒定结构域及重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段 的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱 氨酸。F(ab′)2抗体片段最初是作为Fab′片段对产生的，在Fab′片段之间具有铰链半胱氨酸的。Fv 片段是IgG和IgM类型抗体通过酶法分析后产物中最小的片段。Fv片段抗原结合区，其由VH和VC区域 组成，但是他们缺少CH1和CL区域。VH和VL通过非共价键在Fv片段里结合在一起。ScFv是Fv类型片 段，其包括了通过易弯曲多肽链接在一起的VH和VL区域。
本发明所述的术语“嵌合抗体”指重链和/或轻链的一部分(一般指可变区)衍生自特定物种或属于 特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分(一般指恒定区)衍生自另一物 种的抗体或属于另一种抗体类别或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它 们表现出期望的生物学活性。在本发明中涉及的嵌合抗体如来自鼠源Siglec-15抗体的重链/轻链可变区 通过抗体工程技术嫁接到人源抗体的重链/轻链的恒定区，其表现出相似的生物活性。
术语“人源化抗体”是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在 一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上 所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的序列，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的序列。 本发明中人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部 分氨基酸序列(主要包括恒定区及FR区)为人源序列取代，CDR区采取不改变或少量突变，基本保留亲 本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，降低在人体中引起的免疫原性。
术语“双特异性抗体”是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞) 之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。双抗体可以是二价的或双特异 性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404，097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)； 和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。
术语“三特异性抗体”是含有3种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞) 之间架起桥梁应，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种。三抗体可以是三价的或三特异 性的。
术语“表位”是指与抗体的互补位结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学 活性表面基团组成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“载体”在本文中使用时是指能够通过转化扩增与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包 括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指 导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”是指引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。并能够表达外源核酸于细胞内 或细胞膜或释放至胞外。
术语“癌症”是指由细胞异常不受控制的生长产生的赘生物或肿瘤。如本文所用，癌症明确包括白 血病和淋巴瘤。术语“癌症”是指涉及具有转移至远端位点的潜力并且表现出与非癌细胞不同的表型性 状的细胞的疾病，所述表型性状为例如在三维基质诸如软琼脂中形成集落或者在三维基底膜或细胞外基 质制剂中形成管状网络或网状基质。非癌细胞不会在软琼脂中形成集落，而是在三维基底膜或细胞外基 质制剂中形成不同的球状结构。
术语“免疫性”、“免疫学”或“免疫”应答是针对受体患者中的肽发展有益的体液(抗体介导的) 和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答。此类应答可以是通过施用免疫原诱导的主 动应答或通过施用抗体或初免T细胞诱导的被动应答。通过与I类或II类MHC分子有关联的多肽表位 的呈递以激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，来引发细胞免疫应答。该应 答还可能涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、 嗜酸性粒细胞的激活，嗜中性粒细胞或先天免疫的其它组分的激活或募集。可以通过增殖测定(CD4+T 细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定细胞介导的免疫应答的存在。体液应答和细胞应答对 免疫原的保护或治疗效应的相对贡献可以通过单独从经免疫的同系动物中分离抗体和T细胞并测量在第二受试者中的保护或治疗效应来进行区分。
术语“变体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保持基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体 在氨基酸序列方面与另一参考多肽不同。通常，差异是有限的，使得参考多肽和变体的序列总体上非常 相似，并且在许多区域中是相同的。变体和参考多肽可以在氨基酸序列方面因一个或多个修饰(例如， 取代、添加和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残 基。多肽的变体可以是天然存在的，诸如等位基因变体，或者可以是不知道会天然存在的变体。
在进行此类改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。在本领域中通常理解氨基酸亲水指数在赋予多肽 相互作用生物功能方面的重要性。已知某些氨基酸可以取代具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸，并 且仍然产生具有相似生物活性的多肽。已经基于其疏水性和电荷特征，而为每种氨基酸指定了亲水指数。 那些指数为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)； 甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨 酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰 胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
据信氨基酸的相对亲水特性决定了所得多肽的二级结构，多肽的二级结构又限定了多肽与其它分子 诸如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅因子的相互作用。本领域已知氨基酸可以被具有相似亲水指数的 另一种氨基酸取代，并仍然获得功能等同的多肽。在此类改变中，优选取代亲水指数在±2内的氨基酸， 特别优选在±1内的那些氨基酸，甚至更特别优选在±0.5内的那些氨基酸。
类似氨基酸的取代也可以基于亲水性进行，特别是在由此产生的生物功能等同的多肽或肽旨在用于 免疫学实施方案的情况下。已经为氨基酸残基指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬 氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯 氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬 氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当 理解，氨基酸可以取代具有相似亲水性值的另一种氨基酸，并仍然可以获得生物学等同的，特别是免疫 学上等同的多肽。在此类改变中，优选取代亲水性值在±2内的氨基酸，特别优选在±1内的那些氨基酸取代，甚至更特别优选在±0.5内的那些氨基酸。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、 大小等。考虑到各种前述特征的示例性取代是本领域技术人员公知的并且包括(原残基：示例性取代)： (Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln、His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、 (Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、 (Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)和(Val：Ile、Leu)。因此，本公开的实施 方案考虑了如上所述的抗体序列的功能等同物或生物等同物。具体而言，大的实施方案可包括与抗体序 列具有约95％或更多序列同一性的变体。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例
实施例1.先导抗Siglec-15抗体的产生
1.1抗原设计与合成：在Uniprot数据库查找人Siglec-15蛋白胞外结构域(氨基酸20-263， https://www.uniprot.org/blast/？about＝Q6ZMC9[20-263]&key＝Topological％20domain)，序列如下： “FVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVSAEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEP YAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDR YESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVRSPREGHGHLV TAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGAST”。合称编码上述氨基酸序列的DNA，与 编码骆驼FC的DNA连接，将合成的该基因构建到PCDNA3.4载体。质粒转化大肠杆菌TOP10，挑取 单克隆后于含1‰氨苄霉素的LB培养基中扩大过夜培养。10000G离心10分钟后，碱裂解法(Biomiga， PD1511)抽提质粒。
在采用人Fc与Siglec15胞外域相连的抗原进行动物免疫时，抗原表达产率不高，且动物血清不容 易转阳。为了克服单独采用蛋白免疫在免疫过程中的局限性，及转阳效率问题，采用骆驼Fc与Siglec15 胞外域连接，同时针对Siglec15蛋白创造性地设计了NH2-CTFTHPHRHYDGPLT-CONH2， NH2-CRVEFAGDVHDRYESR-CONH2NH2-CWRAGEPYAGPQV-CONH2三条线性免疫肽与KLH蛋白 偶联，以及一条环肽NH2-CTFTHPHRHYDGPLTC-CONH2，进行辅助加强免疫，以突破免疫屏障。
使用thermo Expi293TM Expression System Kit(A14635)生产抗原。复苏Expi293细胞，使用该试剂 盒推荐方法进行质粒转染，细胞培养。收取培养液，5000G离心10分钟去除细胞及细胞碎片。使用蛋白 A/G(各50％，1:1混合，苏州博进生物科技；protein A:18-0010-02，protein G:16-0010-025)微球纯化抗 原。即将微球颠倒混匀后1ml装柱，经10倍柱体积平衡缓冲液(0.15M氯化钠，0.02M PB，pH7.0)清 洗。加入离心后的培养上清缓慢加入吸附柱，依托重力流穿，重复两遍。使用10倍柱体积平衡缓冲液冲 洗后，加入洗脱缓冲液(0.15M氯化钠，0.1M甘氨酸，0.02M PB，pH3.0)。使用考马斯亮蓝(10μl每 孔，96孔板)连续检测是否有蛋白洗出，即每孔加入10μl。当考马斯亮蓝明显变蓝时，收集洗脱成分至 无蓝色。层析柱经10倍柱体积洗脱液以及10倍柱体积的平衡液流穿后，于20％乙醇保存。洗脱的蛋白 经制剂缓冲液(25毫摩尔柠檬酸钠，50毫摩尔氯化钠，100毫摩尔精氨酸，5％蔗糖)透析换液，BCA 法检测蛋白浓度(4.55mg/ml)，经SDS-PAGE(图1)及考马斯亮蓝染色检测蛋白纯度，保存于-20℃待 用，命名为BPSL15-C。图1中SDS-PAGE条带显示抗原蛋白分子量为70Kd，符合蛋白分子量预期。
1.2小鼠免疫与融合：将6只6-8周龄雌性Balb/c小鼠分为2组：A组和B组，每组3只。A组：15C-FA-1/15 C-FA-2/15C-FA-3，B组：15C-SGZ-1/15C-SGZ-2/15C-SGZ-3。小鼠背部皮下注射100μg抗原(BPSL15-C)。 A组小鼠在首次免疫时使用弗氏完全佐剂。在第二次和第三次免疫时使用弗氏不完全佐剂。B组小鼠在 首次免疫时使用弗氏完全佐剂。在第二次和第三次免疫时使用溶解度增强佐剂PAP-1(由SGE Biotech， 20181129)。第3次免疫后7天，从尾静脉提取血清，通过人siglec-15结合ELISA和FACS检测抗体滴 度。选择15C-SGZ-2和15C-SGZ-3并对其进一步加强免疫(每只小鼠50μg)，加强免疫三天后进行杂 交瘤融合。电融合法将15C-SGZ-2和15C-SGZ-3的脾细胞与SP2/0细胞融合(脾细胞：SP2/0＝1：1)， 融合后的细胞在5％CO2培养箱中培养(100个96孔板，20％FBS HAT培养基)，通过HAT(次黄嘌呤氨喋呤胸苷)培养基筛选。
小鼠血清与人Siglec-15结合ELISA实验检测抗体滴度：取1μg/ml人Siglec-15his蛋白(ACRO SG5-H52H3)于PBS中过铺ELISA板过夜。次日吸去抗原溶液，经PBST(0.5‰)清洗三次后，200μl 封闭液(1％BSA溶于PBS，BSA：Biorfoxx，4240GR100)室温封闭2小时。吸去封闭液后，经PBST (0.5‰)清洗三次后加入100μl使用封闭液梯度稀释的各小鼠血清。小鼠血清以1‰为初始浓度，4倍 稀释8个点。样品室温孵育1小时后，经PBST(0.5‰)清洗三次后，加入100μl溶于封闭液的两万分 之一的偶联辣根过氧化物酶抗鼠FC二抗(Abcam，ab97040)，室温孵育1小时。经PBST(0.5‰)清 洗三次后，加入100μl TMB显色液(Solabio，PR1200)，室温显色10分钟，加入50μl终止液(Solabio， C1058)终止反应，多功能酶标仪检测OD450吸光值(图2a)。图2a显示小鼠血清与人Siglec-15蛋白 结合的ELISA实验检测抗体滴度的结果，其中15C-SGZ-2和15C-SGZ-3的titer最高。
1.3小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验检测抗体滴度：构建过表达人Siglec-15全长CHOS细胞。 将合成的编码人Siglec-15全长 (MEKSIWLLACLAWVLPTGSFVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVSAEAGDAAVLPCTF THPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLAL ADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGP ALGNSLAAVRSPREGHGHLVTAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGASTVALLLGA LGFKALLLLGVLAARAARRRPEHLDTPDTPPRSQAQESNYENLSQMNPRSPPATMCSP)的核酸序列构 建至PCHO1.0质粒的ORF1，经质粒抽提(方法同抗原表达)，NRUI限制性内切酶(NEB，R0192S) 按推荐方法过夜线性化质粒(共100μg)。复苏CHOS细胞，使用CD-forti CHO(Gibco，A1148301) +8毫摩尔谷氨酰胺(Gibco，25030081)+抗结团剂(Gibco，0010057AE)120rpm/37℃/5％CO2摇床培养。 与使用线性化后的质粒及Freestyle MAX试剂(thermo，16447100)按指定方法转染对数期CHOS细胞 (50μg质粒/50μlFreestyle MAX，1*10^6/ml30ml CHOS细胞，100纳摩尔MTX(SIGMA，A6770-100MG) /10μg/ml嘌呤霉素(Gibco，A1113803)筛选稳定细胞，即转染48小时后的细胞更换含上述筛选压力的 新鲜培养基，调整细胞密度至1*10^6/ml，120rpm/37℃/5％CO2摇床培养。一周后，隔日检测细胞活率/ 密度。维持活细胞密度小于2.0*10^6/ml，以0.5*10^6/ml传代细胞，待细胞活率达到95％以上时冻存部 分细胞(生长培养基+10％DMSO)。剩余细胞继续加压筛选至活率大于99％时再次冻存细胞。小鼠血清 与人Siglec-15结合FACS：使用PBS 1：500稀释小鼠血清，100μl稀释的血清与200000个过表达人 Siglec-15的CHOS细胞4℃孵育30分钟。PBS清洗三次后，细胞与1：200稀释于PBS的抗鼠FC荧光 二抗(eBioscience，17-4010-82)4℃避光孵育30分钟，PBS清洗三次后，FACS检测APC荧光通道mean-FI 数值(图2b)。图2b显示15C-SGZ-1，15C-SGZ-2和15C-SGZ-3与CHOS细胞结合效果较好。
实施例2.亚克隆筛选及鉴定
通过抗原结合ELISA筛选后，选择138个克隆对表达人siglec-15的CHOS细胞进行FACS结合实 验鉴定(图3)。对46个FACS阳性克隆进行亚克隆，30个克隆成功获得亚克隆，并通过表达CHOS 细胞和空白CHOS细胞的人siglc-15进行筛选(筛选结果见图4a和4b)。选择26个亚克隆用于抗体生 产。通过蛋白G纯化杂交瘤的上清液。通过空白CHOS细胞(图5a)、表达人Siglec-15的CHOS细胞 (图5b)、表达Cyno Siglec-15的CHOS细胞(图5c)和表达小鼠Siglec-15(图5d)的CHOS细胞分 别做FACS结合实验，之后通过T细胞增殖实验(图6)、破骨细胞分化实验(图7a和7b)，Fortebio 亲和力实验(图8)，筛选得到3个先导候鼠源抗Siglec-15抗体(11H5E6、30C2B12和48B5B1)进行 序列鉴定和进一步表征。
2.1杂交瘤的ELISA、FACS鉴定：杂交瘤细胞融合铺板后10天，使用抗原结合ELISA鉴定阳性克隆。 样品为杂交瘤上清经5000g离心10分钟后的上清液。方法参照小鼠血清人Siglec-15结合ELISA，抗原 铺板浓度改为0.5μg/ml。ELISA信号大于阴性对照信号三倍的克隆共138个，将此138个克隆的上清液 做人Siglec-15的FACS结合实验，方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验。FACS结合实验 样品为100μl上清液。图3显示共46个信号较高的克隆被挑选为FACS阳性，进行下一步的亚克隆。克 隆编号分别为：8H6、11E3、11H5、14H4、15D1、16A4、17A3、17F5、23E8、27G3、30C2、32A2、 37E11、40A5、46A2、47C9、48A12、48B5、48D1、52G11、54E10、55E8、56H8、57F6、58H9、69C4、 69F2、70E6、74D4、75G4、76A10、84F2、87A9、89F4、89G3、89G6、90H7、91B3、92H7、93B5、 96B2、96C6、97B6、97H1、98H9、99F4。
2.2阳性细胞株亚克隆：挑选的上述46个克隆孔进行一次亚克隆。吹打混匀阳性孔中细胞，计数板计数 活细胞数量。以0.5个每孔的密度，每个克隆亚克隆铺板1块96孔板，培养基为1640+10％FBS+HT (Hypoxanthine、Thymidine)。亚克隆14天后，进行亚克隆上清ELISA检测。46个母克隆共30个亚 克隆成功。
2.3亚克隆的流式细胞术鉴定：每个母克隆挑选2-3个信号较强的亚克隆进行FACS检测，包括空细胞及 过表达人SIGEC-15的CHOS细胞。方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验。。图4a、图4b 的对比筛选结果显示，共26个亚克隆与过表达人SIGEC-15的CHOS细胞有较好的结合活性。
2.4亚克隆培养上清的生产纯化、流式细胞术结合功能验证：扩大培养筛选出来的26个亚克隆细胞株， 培养至有相当数量的细胞开始死亡时，离心搜集培养上清。使用蛋白G纯化上清中的抗体，方法参照抗 原合成。构建过表达鼠、食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞，方法参照过表达人Siglec-15 CHOS细胞的构 建方法。使用纯化的鼠抗体进行空CHOS细胞、过表达人Siglec-15的CHOS、过表达鼠Siglec-15的CHOS、 过表达食蟹猴Siglec-15的CHOS流式细胞术结合功能验证，方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS， 样品改为梯度稀释的纯化抗体。图5a、图5b、图5c、图5d显示26个亚克隆细胞株中的部分细胞株所 产生的抗体上清与过表达鼠、食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞有较好结合。基于此，将结合后续的T细 胞增殖实验进行综合筛选。
2.5杂交瘤上清纯化抗体T细胞增殖实验：26个杂交瘤细胞上清纯化的抗体均进行T细胞增殖实验的检 测。发现克隆30C2B12可在多个不同血细胞供体的实验中稳定恢复Siglec-15抑制的T细胞增殖(图6)。 该实验方法如下：
(1)通过在37℃水浴中快速摇晃试管，从液氮中解冻冷冻的PBMC(ALLCELLS，PB004F)。
(2)将细胞加入10mL预热T细胞培养基(AIM-V+5％人AB血清；AIM-V：Gibco，12055091)中。 人AB血清：GEMINI，100-512)，400G/10min。用含0.01％DNA酶Ⅰ的15mL T细胞培养基(Invitrogen， 18047019)重悬细胞，将细胞置于T75培养瓶中，在37℃下孵育2小时。
(3)收集未粘附细胞并计数。离心(400g/10min)细胞并在PBS(10M/ml)中重悬，在37℃下用5μM CFSE(Invitrogen，C34554)标记10min。然后用PBS+10％BSA洗涤2次。离心(400g/10min)细胞， 重悬于T细胞培养基(1.5M/ml)中，加入抗CD3包被(50ng/mL)。4℃过夜，PBS洗2次。96孔板 (200μL/孔)。
(4)向孔中加入5μg/mL Siglec-15(ACRO，SG5-H5253)。然后将抗Siglec-15抗体以45μg/mL加入 孔中。在37℃下培养细胞72h。
(5)72小时后，将细胞转移至圆底平板中进行FACS分析。
(6)Fc受体被TruStain-Fcx(Biolegend，422302，2μL/孔)阻断，然后用APC-CyTM7小鼠抗人CD3(BD， 557832)/BV421小鼠抗人CD4(BD，562842)/APC小鼠抗人CD8(BD，555369)染色。
(7)通过CFSE标记和CD3/CD4/CD8设门分析CD4和CD8 T细胞的增殖率。
2.6破骨细胞分化实验：26个杂交瘤细胞上清纯化的抗体均进行破骨细胞分化实验。图7a、图7b显示发 现克隆11H5E6/48B5B1及69C4D8可减少上清中TRAP酶活力及减少破骨细胞的分化，克隆48B5B1较 明显但与阳性对照相比较弱。实验方法参考Next cure公司发表专利：WO2018057735。该实验方法如下： 从液氮复苏PBMC于新鲜培养基，按照试剂盒(美天旎，130-096-537)推荐方法纯化单核细胞。按照 10万个细胞每孔的密度铺板于96孔平底细胞培养板，共三个平行孔。细胞培养基为α-MEM培养基(Gibco， 32571-036)，10％FBS，1毫摩尔丙酮酸钠，25ng/ml人M-CSF(美天旎，103-096-491)，30ng/ml人 RANKL(美天旎，130-093-988)。37℃培养3小时贴壁后，加入终浓度为50μg/ml的抗人Siglec-15的 抗体(包含阳性对照抗体25E9，来自Alethia公司专利US8741289)。培养三天后，更换含刺激因子的 新鲜培养基。培养七天后，转移上清并离心去除细胞。贴壁的单核/破骨细胞按照试剂盒推荐方法TRAP 染色(B-Bridge，PMC-AK04F-COS，图7b)及上清中TRAP酶活力检测(图7a)。使用显微镜拍套相 机进行拍照染色照片，使用多功能酶标仪检测OD540吸光值。
2.7抗体亲和力测定：通过BLI技术(Fortebio或Gator)检测不同筛选状态下候选抗体的亲和力。将100 nM候选抗体加载到能够捕获其FC(小鼠或人)的AHC或AMC生物传感器上，然后在溶液中将Siglec-15 与100nM his标签(Kactus，SIG-HM415)相互作用。检测缔合和解离速率，并通过拟合信号曲线计算 K-on/K-off和KD。图8显示11H5E6/48B5B1及69C4D8抗体均与抗原具有较高的亲和力。
2.8先导嵌合抗体的分子表位鉴定：通过BLI技术(Fortebio)检测候选抗体与5G12的相对结合。例如， 将100nM 5G12-IgG4抗体上样至AHC传感器上；Siglec-15his蛋白(Kactus，SIG-HM415)与5G12抗 体相关。然后，传感器被含有蛋白的人Fc阻断，另一种抗体与他的抗原相关。如果二抗能与抗原结合， 则二抗在另一个箱子上。如果不是，将两个抗体放在同一个箱子上。图11结果显示，三个抗体分子11H5E6、 30C2B12、48B5B1与5G12不在同一个表位，11H5E6和30C2B12具有相同的表位
2.9先导嵌合抗体的热稳定性实验：材料和方法：使用罗氏光循环仪480实时PCR仪检测熔解曲线。简 言之，向PCR管(或平板)中加入45μL 5μM蛋白，一式三份。在选择的缓冲液中制备新鲜的200×SYPRO 橙色溶液(从5000×储备液，5000×浓度的DMSO溶液；LifeTechnologies S-6650)。向各样品中加入5μL 200×SYPRO橙色溶液，混匀。将样品在25℃下保持30s，读取读数；升高0.5℃，从25℃升高至99℃， 然后返回至25℃。使用熔解曲线测量Tm(图12a、图12b、图12c)，3个嵌合抗体Tm1分别为：11H5E6 为60.5℃，30C2B12为62.5℃，48B5B1为62℃，热稳定性良好。
实施例3.抗Siglec-15抗体的基因克隆、嵌合抗体构建表达纯化、人源化改造、亲和力成熟、工程化改造
3.1先导抗Siglec-15抗体的基因克隆、嵌合抗体构建、表达、纯化
3.1.1基因克隆：使用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得抗体重链/轻链的序列。具体为：(1)扩 增杂交瘤细胞至80％从培养瓶中吹下，1500rpm离心5分钟，200μl PBS重悬细胞。(2)加入800μl Trizol 裂解液，剧烈震荡，4℃静置10分钟。(3)加入250μl三氯甲烷后剧烈震荡5分钟，4℃静置5分钟。 (4)样品12000rpm/4℃离心15分钟，上清加入600μl异丙醇中，上下轻柔混匀，4℃静置10分钟。(5) 12000rpm/4℃离心10分钟后，小心倒掉上清。加入800μl预冷的75％乙醇清洗，倒掉乙醇后，72℃烘干。 (6)使用反转录试剂盒得到cDNA。(7)cDNA与钓取重链可变区或轻链可变区的简并引物PCR扩增。 (8)PCR扩增产物构建T载体并转化TOP10感受态细胞，挑取单克隆测序。共测序三个单克隆： 11H5E6/30C2B12/48B5B1，得到相应的VH和VL序列。
3.1.2嵌合抗体构建：优化并合成上述重链可变区的DNA序列，将该序列通过PCR，酶切，连接至包含 IgG4重链恒定区序列的PCDNA3.4载体中，构建完整重链。优化并合成上述轻链可变区的DNA序列， 将该序列通过PCR，酶切，连接至包含KAPPA轻链恒定区的PCDNA3.4载体中，构建完整轻链。转化 上述两种质粒至TOP10感受态细胞，大量抽提质粒(方法参考抗原合成)。
3.1.3表达：将上述大量抽提的种轻链质粒电转染CHOS细胞，加补料培养至7天。
3.1.4纯化：搜集上述培养的细胞，使用蛋白A纯化相应抗体,SEC/SDS-PAGE检测纯度(方法参考抗原 合成)。
3.1.5嵌合抗体流式细胞术体外结合活性鉴定：取上述嵌合抗体及阴性对照抗体做与过表达人/食蟹猴/小 鼠Siglec-15的CHOS细胞的结合实验，方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验，结果见图9a、 图9b、图9c，结果显示11H5E6、48B5B1及69C4D8三个嵌抗体抗体分别与表达人Siglec-15的CHOS 细胞、表达食蟹猴Siglec-15的CHOS细胞和表达小鼠Siglec-15的CHOS细胞具有较高的结合活性。3.1.6 嵌合抗体的T细胞增殖实验：取上述嵌合抗体及阴性对照抗体做T细胞增殖实验，方法参考杂交瘤上清 纯化抗体T细胞增殖实验，结果见图10a、10b，显示30C2B12嵌合抗体在恢复T细胞增殖实验中在不 同供体中的效价优于对照5G12。
3.2先导抗Siglec-15抗体的人源化改造
3.2.1分子设计：
先导候选物30C2B12的人源化使用CDR移植和回复突变。应用CDRs编号规则定义FRs和CDRs 区域。根据抗体序列数据库，分别对30C2B12序列的VL和VH进行IGBLAST检索。根据检索结果， 选择IGHV1-46*01作为VH的模板，IGKV7-3*01、IGKV4-B3或IGKV4-39*01作为VL的模板。将小 鼠来源的30C2B12序列的CDRs分别移植到VL和VH模板，通过Modeller开源程序进行同源建模。将 3D模型30C2B123D模型的小鼠源序列进行比对，选择的模型作为Grafted 3D模型。
通过NAMD开源程序将移植的3D模型能量最小化，并根据三维结构、理化性质和能量最小化的规 则，将少数残基突变回小鼠来源的残基。根据等电点、PTMs、聚集性、可展开性、免疫原性等对上述模 型的序列进行了优化。
3.2.2抗体表达纯化：将以上设计的人源化改造分子构建至IgG4-S228P/κ恒定区，按照expi-293转染系统 (Gibco，A14635)推荐方法表达纯化人源化分子(30ml)，蛋白A亲和吸附纯化抗体(参考抗原合成)。
3.2.3抗体表征：使用fortebio检测人源化分子的亲和力，图13显示人源化后抗体均能与鼠源分子保持一 致的结合活性。
3.2.4人源化抗体的流式细胞术体外结合活性鉴定：取上述纯化的抗体及阴性对照抗体做与过表达人 Siglec-15的CHOS细胞的结合实验，方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验，结果见图14。 显示人源化后抗体均能与鼠源抗体分子在与过表达人Siglec-15的CHOS细胞结合实验中，保持一致的结 合活性。
3.2.5人源化抗体的T细胞增殖实验：取上述纯化的抗体及阴性对照抗体做T细胞增殖实验，方法参考杂 交瘤上清纯化抗体T细胞增殖实验，结果见图15，大多数子分子显示出与母分子30C2B12相当的功能 活性。
3.3人源化抗Siglec-15抗体的亲和力成熟
3.3.1以L2H1为母分子，利用噬菌体展示技术进行抗体亲和力成熟：(1)材料准备：即抗原抗体的检 测(ELISA/SDS-PAGE)。(2)基因合成：基于仓鼠密码子优化序列，设计引物插入表达载体。(3) 母本验证：验证构建的母本的序列及Fab抗体的活性ELISA。(4)抗体工程库构建：通过单点饱和突 变的方法，分别通过LCDR1+LCDR3+HCDR3/LCDR2+HCDR1+HCDR2/LCDR3/HCDR3四种突变方案 及两种框架构建8个突变库并验证库的质量及抗体多样性分析。(5)抗体海选:即通过基于免疫管的多 轮淘选方法筛选能与结合于免疫管上的抗体结合的噬菌体，并通过噬菌体ELISA及原核表达上清ELISA 检测其亲和特性。经测序获得亲和活性较好的克隆共有38个。(6)根据初筛ELISA信号及原核表达上 清ELSIA EC50以及序列是否有PTM位点，更优选8个克隆构建到IgG4 S228P恒定区成为全场抗体。 该8个克隆质粒转染CHOS细胞，经蛋白A纯化得到抗体。
3.3.2亲和力成熟后抗体的流式细胞术体外结合活性鉴定：取上述纯化的抗体及阴性对照抗体做与过表达 人/食蟹猴/小鼠Siglec-15的CHOS细胞的结合实验，方法参照小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验， 结果见图16、图17、图18。结果显示，亲和力成熟抗体在与过表达人/食蟹猴/小鼠Siglec-15的CHOS 细胞结合实验中，表现出较好的结合活性。
3.3.3抗体表征：使用fortebio检测亲和力成熟分子的亲和力，使用过表达人Siglec-15的CHOS细胞检测 亲和力成熟分子的结合，图19结果显示亲和力成熟后的抗体分子与抗原结合水平得到了大幅提升。
实施例4.候选抗体的基因克隆构建及表达纯化
4.1克隆构建：分别将编号
为5G12/30C2B12/L2H1/L2H1-58/L2H1-58-PTM/14-58-1/14-58-2/16-58-1的抗体VH区DNA经PCR/限制 性酶切/连接至含IgG1的CH区的PCDNA3.4质粒组成完整重链，并将这些克隆的VL区连接至含 IgG1-Kappa CL区的PCDNA3.4质粒组成完整轻链。
4.2表达纯化：上述质粒经转化TOP10感受态细胞大量抽提质粒，按照试剂盒推荐方法转染expi-293细 胞并培养发酵。使用蛋白A吸附柱纯化抗体。
实施例5.优化后抗体的活性鉴定及功能实验
5.1优化后抗体的流式细胞术体外结合活性鉴定：取上述纯化的抗体及阴性对照抗体做与过表达人/食蟹 猴/小鼠Siglec-15的CHOS细胞的结合实验。抗体以100nM为初始浓度，3倍稀释12个点。(方法参照 小鼠血清与人Siglec-15结合FACS实验)。图20、图21、图22结果显示亲和力成熟后的抗体分子在与 过表达人/食蟹猴/小鼠Siglec-15的CHOS细胞的结合实验中具有比在未亲和力成熟前有较高的亲和力， 甚至已经超越了阳性对照抗体5G12分子。
5.2优化后抗体的T细胞增殖实验：取上述纯化的抗体及阴性对照抗体做T细胞增殖实验(方法参考杂 交瘤上清纯化抗体T细胞增殖实验)。共使用三个不同供体的PBMC进行实验。其中，blank为空白对 照即无CD3刺激组；CD3组即加入CD3包板作为阳性对照；CD3+Siglec-15组为加CD3包板刺激同时 加入Siglec-15蛋白抑制T细胞增殖。5G12-IgG1为阳性对照，无关IgG1为阴性对照，检测候选抗体 L2H1-58-PTM及14-58-2的功能，结果见图23、图24、图25，显示出L2H1-58-PTM、14-58-2分子具有 较高的体外功能活性。
序列表
<110> 倍而达药业（苏州）有限公司
<120> Siglec-15单克隆抗体或其抗原结合片段及应用
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
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Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Gly Thr Trp Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
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Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Pro Gln Leu Leu Phe Tyr His Met Ser Lys Phe Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
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Leu Glu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Tyr Thr Ser Thr Asp Tyr Tyr Ile
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His Trp Val Met Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp
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Ile Ser Pro Glu Asn Phe Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
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Asp His Gly Ser Ser Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
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Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Gly Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asn Tyr Pro Tyr Phe Pro Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
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Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Phe Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
20 25 30
Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
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Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
85 90 95
Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
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Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
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Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro
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Pro Val Glu Ala Asn Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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Ser Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Gln Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
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Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
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Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn
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Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Pro Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Ala Gln Lys Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
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Gly Met Ile His Pro Ser Ser Ser Glu Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gly Met Ile His Pro Ser Ser Ser Glu Thr Arg Leu Ala Gln Lys Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser
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Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
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Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
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Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
85 90 95
Gly Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser
20 25 30
Gly Ile Ser Tyr Met Asp Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ile
85 90 95
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100 105 110
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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65 70 75 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr
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<211> 118
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
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<212> PRT
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<400> 51
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<400> 52
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1 5 10
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
His Met Ser
1
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
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<400> 56
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
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1 5 10
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 59
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
Tyr Thr Ser
1
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Arg Thr
1 5
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
Asn Tyr Pro Tyr Phe Pro Met Asp Phe
1 5
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Tyr Met Asp
1 5 10 15
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
Gln Gln Ser Ile Gly Asp Pro Trp Thr
1 5
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg
1 5
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
Ala Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr
1 5
<210> 71
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
Ala Arg Asn Tyr Pro Tyr Phe Pro Met Asp Phe
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
Gln Ser Val Asp Tyr Asn Gly Ile Ser Tyr
1 5 10
<210> 73
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
Ala Ala Ser
1
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
Ser Ile His Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Arg
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
Ala Ala Ser Asn Leu Glu His
1 5
<210> 77
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Val Asn
1 5 10
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Arg
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Pro
1 5
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
Ser Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg
1 5 10
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Tyr Asn Gly Ile Ser Tyr Met Asp
1 5 10 15
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Ala Ile His Pro Ser Asp Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210> 85
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Met Ile His Pro Ser Asp Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 86
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Val
1 5 10
<210> 87
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Met Ile His Pro Ser Ser Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
His Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Gln Gln Ser Ile Gly Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Ala Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr Trp Met Asn
1 5 10
<210> 91
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Met Ile His Pro Ser Ser Ser Glu Thr Arg
1 5 10
<210> 92
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Met Ile His Pro Ser Glu Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gln Gly Ile Ser Tyr Met Asp
1 5 10 15
<210> 94
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Gln Gln Ser Ile Gly Glu Pro Trp Thr
1 5
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Met Ile His Pro Ser Asn Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 96
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Gln Gln Ser Ile Gly Asn Pro Trp Thr
1 5
<210> 97
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Met Ile His Pro Ser Thr Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Met Ile His Pro Ser Gly Ser Phe Thr Arg
1 5 10
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Ile Ser Tyr Met Asp
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser Gly Ile Ser Tyr Met Asp
1 5 10 15
<210> 101
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
atgaccaggc tgacagtgct ggctctgctg gccggactgc tggcttcttc tagagctcag 60
gtgcagctgg tgcagtcagg agcagaagtg aagaagcccg gagccagcgt gaaagtgtct 120
tgcaaggcca gcggctacac cttcatcagc tactggatga attgggtccg gcaggctcca 180
ggacagggac tcgagtggat tggcatgatc caccccagct caagcttcac aaggctgaac 240
cagaagttca aggacaaggc caccctgacc gtggacaaga gcaccagcac cgtgtacatg 300
gagctgagca gcctgaggag cgaggatacc gccgtgtact attgcgcccg gaactacccc 360
tacttcccca tggacttttg gggccaggga acaagcgtga ccgtgtctag cgctagcacc 420
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 102
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
atgaccaggc tgacagtgct ggctctgctg gccggactgc tggcttcttc tagagctgac 60
atccagatga cccagagccc cagctctctg agcgcttcag tgggccagag agtgacaatc 120
acttgcagag ccagccagag cgtggactac agcggcatca gctacatgga ttggtaccag 180
cagaagccag gcaaggctcc taagctgctg atctaccacg cctctaacct ggagagcgga 240
gtgcctagca gattcagcgg cagcggaagc ggaaccgact tcaccctgac catcagctct 300
ctgcagccag aggacttcgc cacctactac tgccagcaga gcatcggcac tccttggaca 360
ttcggcggcg gcacaaagct ggagatcaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 103
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
atgggctgga cttggatctt catcctgatc ctgagcgtga ccaccggagt gcattctcag 60
gtgcagctgg tgcagccagg agcagaagtg aagaagcccg gcgccagcgt gaaagtgtct 120
tgcaaggcca gcgcctacag cttcatcagc tactggatga attgggtccg gcaggctcca 180
ggacagggcc tcgagtggat gggtatgatt cacccttctg acagcttcac aagactggcc 240
cagaagttcc agggcagggc taccctgaca gtggacaaga gcaccagcac cgcctacatg 300
gagctgtcta gccctagaag cgaggacacc gcagtgtact attgcgcccg gaactacccc 360
tacttcccca tggacttttg gggccaggga acaacagtga cagtgtccag cgctagcacc 420
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 480
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 540
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 600
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 660
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 720
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 780
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 840
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 960
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1080
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 1140
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1200
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1260
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1320
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1380
ctctccctgt ctccgggtaa atga 1404
<210> 104
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
atggggctgc aggtgcaggt catcagcttc ctgctgatca gcgtgaccgt gatcatgagc 60
agaggcgaca tcgtgctgac ccagtctcca gatagcctgg cagtgtctct gggcgagaga 120
gccaccatca attgcagggc ctctcagagc gtggactaca gcggcatcag ctacatggat 180
tggttccagc agaaaccagg ccagcctcct aagctgctga tctaccacgc cagcaacctg 240
gagagcggca tcccagacag attcagcgga agcggaagcg gcaccgactt caccctgacc 300
atctcttctc tgcaggccga agacgtggcc gtgtactatt gccagcagag catcggcacc 360
ccttggacct ttggcggcgg aacaaagctg gagatcaagc gtacggtggc tgcaccatct 420
gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 480
ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 540
caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 600
ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 660
gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 720
tag 723
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