具体实施方式

本发明提供的实施方案涉及调节OX40活性的多价结合OX40的多肽以及其在各种治疗癌症的方法中的用途。

定义及各种实施方案

本申请使用的章节标题仅用于组织目的且不应视为限制所描述的主题。

本申请引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公开以及Genbank登记号)均以引用方式并入本申请中，并入程度如同每篇参考文献均已明确且单独地指出通过全文引用的方式并入本申请一样。

本申请所描述或提及的技术和程序通常由本领域技术人员充分了解且通常使用常规方法而由本领域技术人员采用，例如以下文献中所描述的广泛利用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(F.M.Ausubel等人编，(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR 2:APRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames及G.R.Taylor编(1995)),Harlow及Lane编(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,and ANIMAL CELLCULTURE(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)PlenumPress；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell编,1993-8)J.Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编,1991)；ShortProtocols in Molecular Biology(Wiley及Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd及C.Dean编,Oxford University Press,2000)；Using Antibodies:ALaboratory Manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编,Harwood Academic Publishers,1995)；及Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等人编,J.B.LippincottCompany,1993)；及其更新版本。

除非另外定义，否则结合本申请公开内容使用的科学与技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求或另外明确指出，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。关于各种来源或参考文献之间在定义方面的任何冲突，将以本申请所提供的定义为准。

通常，免疫球蛋白重链中的残基编号如Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991)中的EU索引的编号。“Kabat中的EU索引”是指人类IgG1 EU抗体的残基编号。

应了解，本申请所述的本发明的实施方案包括“由…组成”和/或“基本上由…组成”实施方案。除非另外规定，否则如本申请所用，单数形式“一(a/an)”和“该”包括复数个指代物。本申请使用的术语“或”不意在暗示替代方案是互相排斥的。

在本申请中，除非明确地叙述或如本领域技术人员所理解，否则使用的“或”表示“和/或”。在多项从属权利要求的上下文中，使用的“或”重新提及一个以上前述独立权利要求或从属权利要求。

短语“参比样品”、“参比细胞”或“参比组织”表示可用作与具有至少一种未知特征的样品进行比较的具有至少一种已知特征的样品。在一些实施方案中，参比样品可用作阳性或阴性指示物。参比样品可用于确定例如在健康组织中存在的蛋白质和/或mRNA的含量，相比于在具有未知特征的样品中存在的蛋白质和/或mRNA的含量。在一些实施方案中，参比样品来自同一受试者，但来自该受试者不同于待测试部分的部分。在一些实施方案中，参比样品来自癌周围或靠近癌的组织区域。在一些实施方案中，参比样品并非来自待测试的受试者，而是来自已知患有或未患有所讨论病症(例如，特定癌症或OX40相关病症)的受试者的样品。在一些实施方案中，参比样品是来自同一受试者，但来自在受试者患癌症前的时间点。在一些实施方案中，参比样品是来自相同或不同受试者的良性癌样品。当使用阴性参比样品进行对比时，在给定本公开内容的情况下，阴性参考样品中所讨论分子的表达水平或量将指示本领域技术人员应理解的水平，该水平不存在和/或分子水平低。在使用阳性参比样品进行对比时，在给定本公开的情况下，在阳性参考样品中所讨论的分子的表达水平或量将指示本领域技术人员应理解的水平，存在该水平的该分子。

如本申请在受益于治疗剂施用或对治疗剂施用有反应的上下文中所用的术语“益处”、“临床益处”、“反应性”及“治疗反应性”可通过评估不同终点来测量，例如在一定程度上抑制疾病进程，包括减慢和完全遏止；减少疾病发作和/或症状的数量；减小病变大小；抑制(即，减少、减慢或完全停止)疾病细胞浸润至相邻的周边器官和/或组织；抑制(即，减少、减慢或完全停止)疾病扩散；在一定程度上缓解与该病症相关的一种或多种症状；增加在治疗后呈现无病(例如，无进展生存期)的时长；增加总体存活率；反应率较高；和/或减小在治疗后给定时间点的死亡率。“无反应性”或“无法反应”的受试者或癌症是无法满足关于“反应性”的上述限制条件的受试者或癌症。

术语“核酸分子”、“核酸”和“多聚核苷酸”可互换使用，且是指核苷酸的聚合物。此类核苷酸的聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸，且包括但不限于DNA、RNA和PNA。“核酸序列”是指包含在核酸分子或多聚核苷酸中的核苷酸线性序列。

术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基，且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白及其片段均由该定义涵盖。该术语也包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化及其类似修饰。此外，针对本申请公开的目的，“多肽”是指下述蛋白质，其包括对天然序列的修饰，如缺失、添加和替代(性质上通常是保守的)，只要该蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可为有意的，如经由定点突变诱发进行；或可为偶然的，如经由产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增所引起的错误导致。

本申请使用的“OX40”是指由在细胞中加工OX40前驱体产生的任何天然成熟的OX40。除非另外规定，否则该术语包括来自任何脊椎动物来源的OX40，包括哺乳动物如灵长类动物(例如，人类和食蟹猕猴或恒河猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。该术语也包括OX40的天然产生的变异体，如剪接变异体或等位基因变异体。一种非限制性示例性人类OX40氨基酸序列例如展示于GenBank登记号CAE11757.1中。参见SEQ ID NO.1。一种非限制性示例性食蟹猕猴OX40氨基酸序列例如展示于NCBI登记号XP_005545179中。参见SEQ IDNO.2。

术语“特异性结合”至抗原或抗原决定簇是本领域中众所周知的术语，且用于确定此种特异性结合的方法也是本领域公知的。若分子与特定细胞或底物比其与可替换细胞或底物以较长持续时间和/或以较大亲和力较频繁、较快速地反应或缔合，则称其展现“特异性结合”或“优先结合”。若单域抗体(sdAb)或含VHH的多肽以相比于其结合其它底物较大的亲和力、亲合力、较容易和/或较长持续时间结合标靶，则其“特异性结合”或“优先结合”于标靶。例如，特异性或优先结合于OX40抗原决定簇的sdAb或含VHH的多肽是以相比于其结合至其它OX40抗原决定簇或非OX40抗原决定簇较大的亲和力、亲合力、较容易和/或较长持续时间结合该抗原决定簇的sdAb或含VHH的多肽。通过阅读该定义，也应理解，例如特异性或优先结合至第一标靶的sdAb或含VHH的多肽可能或可能不特异性或优先结合至第二标靶。由此，“特异性结合”或“优先结合”并不要求(尽管其可包括)排他式结合。通常，但并非必然，提及的结合表示优先结合。“特异性”是指结合蛋白选择性地结合抗原的能力。

如本申请中所用，关于OX40的活性使用的术语“调节”是指OX40的活性发生变化。在一些实施方案中，“调节”是指与不存在调节剂时的OX40相比，OX40活性增加。

本申请使用的术语“抗原决定簇”是指抗原结合分子(例如，sdAb或含VHH的多肽)在标靶分子(例如，抗原，如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)上结合的位点。抗原决定簇常常包括分子的化学活性表面分组如氨基酸、多肽或糖侧链，且具有特定三维结构特征以及荷质比特征。抗原决定簇可由标靶分子的相邻和/或并列非相邻残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由相邻残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的抗原决定簇通常在暴露于变性溶剂时得以保留，而通过三级折叠形成的抗原决定簇通常在经变性溶剂处理时失去。抗原决定簇可包括但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，抗原决定簇的长度小于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)、小于15个残基或小于12个残基。若两个抗体对某个抗原展现竞争性结合，则它们可结合该抗原内的同一个抗原决定簇。在一些实施方案中，可通过与抗原结合分子上的CDR残基相距某一最小距离来识别抗原决定簇。在一些实施方案中，抗原决定簇可通过上述距离来识别，且进一步限于在抗原结合分子的残基与抗原残基之间的键(例如，氢键)中所包含的那些残基。抗原决定簇也可通过各种扫描来识别，例如丙胺酸或精胺酸扫描可指示出可与抗原结合分子相互作用的一种或多种残基。除非明确指出，否则作为某一抗原决定簇的一组残基不排除其它残基成为特定抗原结合分子的抗原决定簇的一部分。实际上，该组的存在表示抗原决定簇的最小系列(或类别集合)。因此，在一些实施方案中，识别为抗原决定簇的一组残基表示与抗原相关的最小抗原决定簇，而非抗原上的抗原决定簇的残基的排他性清单。

“非线性抗原决定簇”或“构象抗原决定簇”包含在对抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子所结合的抗原蛋白内的非相邻多肽、氨基酸和/或糖。在一些实施方案中，至少一个残基将与抗原决定簇的其它所指出残基不相邻；然而，一或多个残基也可与其它残基相邻。

“线性抗原决定簇”包含在对抗原决定簇具有特异性的抗原结合分子所结合的抗原蛋白内的相邻多肽、氨基酸和/或糖。应注意，在一些实施方案中，并非线性抗原决定簇内的每一个残基都需要通过抗原结合分子直接结合(或参与键合)。在一些实施方案中，线性抗原决定簇可来自有效地由线性抗原决定簇序列组成的肽的免疫，或来自与蛋白质的剩余部分相对分离的蛋白质的结构部分(以使得抗原结合分子可至少主要地仅与该序列部分相互作用)。

术语“抗体”和“抗原结合分子”就最广义而言可互换使用，且涵盖包含抗体样抗原结合域的各种多肽，包括但不限于常规抗体(通常包含至少一个重链和至少一个轻链)、单域抗体(sdAb，其仅包含一个通常类似于重链的链)、含VHH的多肽(包含至少一个仅重链抗体可变域或VHH的多肽)及前述任一者的片段，只要其表达所需的抗原结合活性即可。在一些实施方案中，抗体包含二聚域。此类二聚域包括但不限于重链恒定域(包含CH1、铰链、CH2及CH3，其中CH1通常与轻链恒定域CL配对，而铰链调节二聚作用)和Fc域(包含铰链、CH2和CH3，其中铰链调节二聚作用)。

术语抗体也包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体及各种物种的抗体，例如骆驼科动物(包括美洲驼)、鲨鱼、小鼠、人类、食蟹猕猴等。

术语“单域抗体”与“sdAb”在本申请中可互换使用，是指具有单一单体域的抗体，例如一对重链可变域(或VHH)，而无轻链。

本申请使用的术语“VHH”或“VHH域”或“VHH抗原结合域”是指单域抗体的抗原结合部分，该单域抗体例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。在一些实施方案中，VHH包含三个CDR和四个骨架区，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些实施方案中，VHH可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要VHH实质上保持抗原结合和特异性即可。

术语“含VHH的多肽”是指包含至少一个VHH域的多肽。在一些实施方案中，VHH多肽包含两个、三个或四个或更多个VHH域，其中各VHH域可以相同或不同。在一些实施方案中，含VHH的多肽包含Fc域。在一些此类实施方案中，VHH多肽可形成二聚体。含VHH的多肽的非限制性结构包括VHH₁-Fc、VHH₁-VHH₂-Fc及VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc，其中VHH₁、VHH₂及VHH₃可以相同或不同。在此类结构的一些实施方案中，一个VHH可经接头连接至另一VHH，或一个VHH可经接头连接至Fc。在一些此类实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选为1-20个主要包含甘胺酸且任选包含丝胺酸的氨基酸。在一些实施方案中，当含VHH的多肽包含Fc时，其形成二聚体。因此，若结构VHH₁-VHH_2-Fc形成二聚体，则认为其是四价的(即，二聚体具有四个VHH域)。类似地，若结构VHH₁-VHH₂-VHH₃-Fc形成二聚体，则认为其是六价的(即，二聚体具有六个VHH域)。

术语“单克隆抗体”是指基本上均质的抗体群的抗体(包括含sdAb或含VHH的多肽)，也就是说，除了可能少量存在的天然存在的突变外，构成该群的各个抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定子(抗原决定簇)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定子。因此，单克隆抗体的样品可结合至抗原上的同一抗原决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性是自基本上均质的抗体群获得的，且不应理解为要求通过任何特定方法来产生该抗体。例如，单克隆抗体可通过最初由Kohler及Milstein,1975Nature 256:495描述的杂交瘤方法制得，或可通过如在美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制得。例如，单克隆抗体也可由使用McCafferty等人，1990，Nature348:552-554中所述的技术产生的噬菌体库中分离。

术语“CDR”表示互补决定区，如由本领域技术人员通过至少一种识别方式所定义。在一些实施方案中，CDR可根据Chothia编号方案、Kabat编号方案、Kabat与Chothia的组合、AbM定义和/或接触定义中的任一者来定义。VHH包含三个CDR，称为CDR1、CDR2及CDR3。

本申请使用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定域C_H1、铰链、C_H2及C_H3的区域。当然，除非另外指示，否则该域内的非功能改变性缺失及更改是涵盖在术语“重链恒定区”的范围内。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区也包括ε和μ。各重链恒定区对应于抗体同型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，包含α恒定区的抗体是IgA抗体。另外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同型可进一步细分为子类。例如，IgG抗体包括但不限于IgG1(包含γ₁恒定区)抗体、IgG2(包含γ2恒定区)抗体、IgG3(包含γ₃恒定区)抗体和IgG4(包含γ₄恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α₁恒定区)抗体和IgA2(包含α₂恒定区)抗体；且IgM抗体包括但不限于IgM1及IgM2。

本申请使用的“Fc区”是指包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。在各种实施方案中，当Fc区包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc区可为本申请讨论的任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

如本申请所讨论，本申请使用的“受体人类骨架”是包含源自人类免疫球蛋白骨架或人类共同骨架(consensus framework)的重链可变域(V_H)骨架的氨基酸序列的骨架。源自人类免疫球蛋白骨架或人类共同骨架的受体人类骨架可包含与其相同的氨基酸序列，或其可含有氨基酸序列改变。在一些实施方案中，在如VHH的单一抗原结合域中的所有人类骨架中，氨基酸改变的数量少于10、或少于9、或少于8、或少于7、或少于6、或少于5、或少于4、或少于3。

“亲和力”是指分子(例如，抗体或含VHH的多肽)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力或表观亲和力通常可分别由解离常数(K_D)或K_D-表观来表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法(例如ELISA K_D、KinExA、流式细胞术和/或表面等离子体共振装置)来测量，所述常用方法包括本申请所述的那些方法。此类方法包括但不限于包含或流式细胞术的方法。

本申请使用的术语“K_D”是指抗原结合分子/抗原相互作用的平衡解离常数。当本申请中使用术语“K_D”时，其包括K_D及K_D-表观。

在一些实施方案中，通过流式细胞术使用抗原表达细胞系和将在各抗体浓度下测量的平均荧光拟合成非线性单位点结合方程(Prism Software graphpad)来测量抗原结合分子的K_D。在一些此类实施方案中，K_D是K_D-表观。

术语“生物活性”是指分子中的任何一种或多种生物性质(无论是在体内发现为天然存在的，还是通过重组方式提供或实现的)。生物性质包括但不限于结合配位体、诱导或增加细胞增殖(例如T细胞增殖)和诱导或增加细胞因子的表达。

本申请使用的术语“OX40活性”或OX40的“生物活性”包括OX40蛋白的任何生物效应或至少一种生物相关功能。在一些实施方案中，OX40活性包括OX40与OX40配位体(OX40L)相互作用或与结合的能力。非限制性示例性OX40活性包括增加NFκB信号传递、增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖、增加T细胞中的IFNγ表达、增加T细胞上的CD25和/或CD71表达和减小Treg细胞对效应子T细胞活化和增殖的抑制性活性。

“激动剂”或“活化”抗体(例如sdAb或含VHH的多肽)是增加和/或活化标靶抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体结合至抗原且使其生物活性增加至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％、至少约85％或更多。

“拮抗剂”、“阻断”或“中和”抗体是减小标靶抗原的生物活性和/或使标靶抗原的生物活性失活的抗体。在一些实施方案中，中和抗体结合至抗原且使其生物活性减小至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或更多。

“亲和力成熟”的含VHH的多肽是指其一个或多个CDR中具有一种或多种改变的含VHH的多肽，相比于不具有此类改变的亲代含VHH的多肽，此类改变导致含VHH的多肽对抗原的亲和力得以改进。

本申请使用的“人源化VHH”是指其中一或多个骨架区已基本上由人类骨架区替换的VHH。在一些情形中，人类免疫球蛋白的某些骨架区(FR)由相应非人类残基替换。此外，人源化VHH可包含在初始VHH或人类骨架序列中均未发现、但被包括在内以进一步改进和优化VHH或含VHH的多肽的性能的残基。在一些实施方案中，人源化的含VHH的多肽包含人类Fc区。应了解，人源化序列可由其一级序列识别且不是必须表示产生该抗体的方法。

“功能Fc区”具有天然序列Fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。此类效应子功能通常需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)组合且可使用各种分析来评估。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；及天然序列人类IgG4 Fc区，以及其天然存在的变异体。

“变异Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，“变异Fc区”包含因至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区、但保留天然序列Fc区的至少一种效应子功能的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区相比于天然序列Fc区或相比于亲代多肽的Fc区具有至少一个氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在亲代多肽的Fc区中具有约一个至约十个氨基酸置换，且优选具有约一个至约五个氨基酸置换。在一些实施方案中，本申请中的变异Fc区与天然序列Fc区和/或与亲代多肽的Fc区具有至少约80％序列一致性、至少约90％序列一致性、至少约95％序列一致性、至少约96％序列一致性、至少约97％序列一致性、至少约98％序列一致性或至少约99％序列一致性。

“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。在一些实施方案中，FcγR是天然人类FcR。在一些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变异体和交替剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA (“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有类似的氨基酸序列，不同之处主要在于其细胞质域。活化受体FcγRIIA在其细胞质域中含有免疫受体酪胺酸激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质域中含有免疫受体酪胺酸抑制基序(ITIM)。(参见例如，Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR例如评述于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和deHaas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中。其它FcR(包括将来识别的那些FcR)由本申请的术语“FcR”涵盖。例如，术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人，J.Immunol 24:249(1994))和调节免疫球蛋白的内稳定。已知用于测量与FcRn结合的方法(参见例如，Ghetie和Ward，Immunol.Today 18(12):592-598(1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997)；Hinton等人,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。

本申请使用的术语“基本上类似”或“基本上相同”表示两个或两个以上数值之间的相似度足够高，以使得在通过该值测量生物特征的情况下，本领域技术人员将认为该两个或更多个值之间的差异具有极小或不具有生物和/或统计显著性。在一些实施方案中，两个或两个以上基本上类似的值相差大致不超过以下中的任一者：5％、10％、15％、20％、25％或50％。

多肽“变异体”表示在比对序列且必要时引入间隙以达到最大序列一致性百分比之后，且不考虑任何保守置换作为序列一致性的部分的情况下，与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列一致性的生物活性多肽。此类变异体包括，例如其中在多肽的N端或C端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变异体将具有至少约80％的氨基酸序列一致性。在一些实施方案中，变异体将具有至少约90％的氨基酸序列一致性。在一些实施方案中，变异体与天然序列多肽将具有至少约95％的氨基酸序列一致性。

本申请关于肽、多肽或抗体序列使用的“氨基酸序列一致性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列且必要时引入间隙以达到最大序列一致性百分比之后，且不考虑任何保守置换作为序列一致性的部分的情况下，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比。用于测定氨基酸序列一致性百分比目的的比对可由本领域范围内的各种方式来达成，例如使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM(DNASTAR)软件。本领域技术人员可测定用于测量比对的适当参数，包括为在所比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。

氨基酸置换可包括但不限于将多肽中的一个氨基酸置换为另一个氨基酸。示例性置换展示于表1中。可向所关注的抗体中引入氨基酸置换，且针对所需活性来筛选产物，例如保留/改进的抗原结合、减小的免疫原性或改进的ADCC或CDC。

表1

氨基酸可根据共有侧链性质来进行分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。

非保守置换将引起这些类别中的一个成员换成另一类别的成员。

术语“载体”用于描述可经工程改造为含有可在宿主细胞中繁殖中的一个或多个克隆多聚核苷酸的多聚核苷酸。载体可包括以下元件中的一个或多个：复制起点、一个或多个调控所关注多肽的表达的调控序列(例如启动子和/或增强子)和/或一个或多个可选择标记基因(例如抗生素抗性基因和可用于比色分析的基因，例如β-半乳糖苷酶)。术语“表达载体”是指用于表达宿主细胞中所关注多肽的载体。

“宿主细胞”是指可为或已为载体或经分离多聚核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，例如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，例如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于NSO细胞、细胞(Crucell)、以及293和CHO细胞，及其衍生物，例如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S及CHO-DS细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，且后代可能由于自然、偶然或故意突变而不一定与原始亲代细胞完全一致(在形态或基因组DNA补体方面)。宿主细胞也包括原代细胞，例如原代人类免疫细胞。

本申请使用的术语“经分离”是指已与自然界中通常一起发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生多肽的细胞的至少一些组分分离时，该多肽称为“经分离”。当多肽在表达后由细胞分泌时，认为使含有多肽的上清液与产生其的细胞物理分离是“分离”多肽。类似地，当多聚核苷酸不是通常在自然界中发现的较大的多聚核苷酸当多核苷酸不是通常在自然界中发现的较大的多核苷酸(例如，在DNA多核苷酸的情况下，例如基因组DNA或线粒体DNA)的一部分时，或者与产生它的细胞的至少某些组分分离(例如在RNA多聚核苷酸的情况下)时，则称该多聚核苷酸为“经分离”。因此，宿主细胞内部的载体中所含的DNA多聚核苷酸可称为“经分离”。

术语“个体”与“受试者”在本申请中可互换使用，是指动物；例如哺乳动物。在一些实施方案中，提供治疗哺乳动物的方法，该哺乳动物包括但不限于人类、啮齿动物、猿猴、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、山羊、哺乳类实验室动物、哺乳类农场动物、哺乳类运动型动物和哺乳类宠物。在一些实方案中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或病症的个体或受试者。在一些实施方案中，接受治疗的受试者可为患者，指出以下事实：该受试者已鉴别为患有与该治疗相关的病症，或存在极大感染该病症的风险。

本申请使用的“疾病”或“病症”是指需要和/或期望治疗的病况。

除非另外指出，否则术语“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“癌症”、“肿瘤”和/或“赘生物”在本申请中可互换使用，且是指表达不受控生长和/或异常增加细胞存活率和/或抑制细胞凋亡的细胞，其干扰身体器官和系统的正常功能。此定义中包括良性及恶性癌症、息肉、增生以及潜伏性肿瘤或微小转移灶。

术语“癌症”和“肿瘤”包括实体癌症及血液/淋巴癌，且也包括恶性、癌前和良性生长，例如发育不良。此定义中也包括具有不受免疫系统阻碍(例如，免疫逃避和免疫逃脱机制)的异常增殖的细胞(例如，被病毒感染的细胞)。示例性癌症包括但不限于基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；大脑及中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠及直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；晚期胃癌(包括胃肠道癌)；胶质母细胞瘤；原发性肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变；肾脏癌或肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌及肺鳞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌和咽癌)；卵巢癌；胰脏癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高度小无核裂细胞性NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤))；及瓦登史东巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性骨粒细胞白血病；以及其它癌瘤和肉瘤；和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)，以及与母斑病、水肿(例如与脑瘤相关)及梅格斯氏症状(Meigs'syndrome)相关的异常血管增生。

本申请使用的术语“非肿瘤细胞”是指正常细胞或组织。示例性非肿瘤细胞包括但不限于：T细胞，B细胞，自然杀伤(NK)细胞，自然杀伤T(NKT)细胞，树突状细胞，单核细胞，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞，肝细胞，间质性肾细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，成骨细胞，以及位于乳房、骨骼肌、胰腺、胃、卵巢、小肠、胎盘、子宫、睪丸、肾脏、肺、心脏、脑、肝、前列腺、结肠、淋巴器官、骨骼和骨髓间充质干细胞。如本申请所用的术语“位于外周的细胞或组织”是指不位于肿瘤细胞附近和/或肿瘤微环境内的非肿瘤细胞。

本申请使用的术语“肿瘤微环境内的细胞或组织”是指围绕和/或供给肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管。肿瘤微环境内的示例性细胞或组织包括但不限于：肿瘤血管结构；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其它基质细胞；细胞外基质(ECM)的组分；树突状细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞(Treg细胞)；巨噬细胞；中性粒细胞；髓系来源抑制性细胞(MDSC)和位于肿瘤附近的其它免疫细胞。如本申请下文中所述，本领域公知用于识别肿瘤细胞和/或位于肿瘤微环境内的细胞/组织的方法。

在一些实施方案中，“增加”或“减少”各自是指统计学上显著的增加或减少。如本领域技术人员将显而易见的，“调节”也可包括与相同条件但不存在测试剂的情形相比，对标靶或抗原的配位体、结合配偶体、配偶体中的一个或多个缔合为均多聚体或异多聚体形式或底物的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性实现改变(可为增加或减少)；对标靶或抗原对该标靶或抗原所存在的介质或周围环境中的一种或多种条件(例如pH、离子强度、辅因子的存在等)的敏感性实现改变(可为增加或减少)；和/或细胞增殖或细胞因子产生。这可根据包含的标靶按任何合适方式和/或使用本身已知或本申请所述的任何合适试验来确定。

如本申请中所用，“免疫反应”意在包括足以抑制或预防疾病发作或改善疾病症状(例如，癌症或癌转移)的细胞和/或体液免疫反应。“免疫反应”可包含先天性和后天性免疫系统两者的各个方面。

如本申请所用，“治疗”为用于获得有益或所期望的临床结果的方法。本申请使用的“治疗”涵盖对于包括人类在内的哺乳动物的疾病进行的任何给药或施用治疗方案。针对本申请公开的目的，有益或所期望的临床结果包括但不限于以下的任何一种或多种：减轻一种或多种症状、减弱疾病程度、预防或延迟疾病扩散(例如转移，例如转移至肺或淋巴结)、预防或延迟疾病复发、延迟或减缓疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病进展、抑制或减缓疾病或其进展、阻滞其发展和缓解(不管是部分还是完全)。“治疗”也涵盖减轻增殖性疾病的病理后果。本发明提供的方法涵盖治疗的这些方面中中的任何一种或多种。根据上文，术语治疗不需要百分之百移除病症的所有方面。

“改善”表示与未给予治疗剂相比，一种或多种症状得以减轻或改良。“改善”也包括症状的持续时间缩短或减少。

术语“抗癌剂”在本申请中以最广含义用于表示用于治疗一种或多种癌症的药剂。示例性类别的此类药剂包括但不限于化学治疗剂、抗癌生物制剂(例如细胞因子、受体胞外域-Fc融合，和抗体)、放射疗法、CAR-T疗法、治疗性寡核苷酸(例如反义寡核苷酸和siRNA)和溶瘤病毒。

术语“生物样品”表示一定量的来自活物或先前为活物的物质。此类物质包括但不限于血液(例如全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其它细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结及脾脏。

术语“对照”或“参比”是指已知不含分析物的组合物(“阴性对照”)或已知含有分析物的组合物(“阳性对照”)。阳性对照可包含已知浓度的分析物。

术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或该特征的发生率、程度或可能性的减少或停止。“降低”或“抑制”是使活性、功能和/或量与参比相比减少、降低或停止。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”表示导致总体减少为10％或更大的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”表示导致总体减少为50％或更大的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”表示导致总体减少为75％、85％、90％、95％或更大的能力。在一些实施方案中，一段时间内上述量相对于同一段时间内的对照而言受到抑制或减少。

如本申请所用，“延迟疾病发展”意谓推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定、抑制和/或推迟疾病(例如癌症)的发展。根据疾病病史和/或待治疗的受试者，该延迟可具有不同时间长度。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著延迟可实际上涵盖预防，使得该受试者不发展该疾病。例如，可延迟晚期癌症，例如转移的发展。

如本申请所用，“预防”包括对某一疾病在可能易患该疾病但尚未诊断患有该疾病的受试者中出现或复发方面提供预防作用。除非另外规定，否则术语“降低”、“抑制”或“预防”不表示或不需要在所有时间内完全预防，而仅在所测量的时间段内。

一种物质/分子(激动剂或拮抗剂)的“治疗有效量”可根据以下因素而变化：例如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重，以及该物质/分子(激动剂或拮抗剂)在受试者体内引起所需反应的能力。治疗有效量也为治疗学上的有益作用超过物质/分子(激动剂或拮抗剂)的任何有毒或有害作用的量。治疗有效量可在一次或多次给药中来递送。治疗有效量是指可在所必需的剂量和时间段下有效实现所需治疗和/或预防结果的量。

术语“药物配制物”和“药物组合物”是指所呈形式允许活性成分的生物活性有效，且不含对配制物将给药的受试者具有不可接受毒性的其它组分的制剂。此类配制物可为无菌的。

“药物学上可接受的载剂”是指本领域常规与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、配制助剂或载剂，一起构成用于给予受试者的“药物组合物”。药物学上可接受的载剂在所用剂量及浓度对接受者是无毒的且与配制物的其它成分相容。药物学上可接受的载剂适于所用的配制物。

与一种或多种其它治疗剂“组合”给予包括同时(并行)给予和按任何顺序连续给予。

术语“并行”在本申请中用于表示给予两种或更多种治疗剂，其中至少部分给予在时间上重叠，或其中一种治疗剂的给予落在相对于给予另一种治疗剂较短的时间段内，或其中两种药剂的治疗作用重叠至少一段时间。

术语“连续”在本申请中用于表示时间上不重叠地给予两种或更多种的治疗剂，或其中该药剂的治疗作用不重叠。

如本申请所用，“联合”是指除一种治疗方式以外也给予另一种治疗方式。因此，“联合”是指在向个体给予一种治疗方式之前、在给予一种治疗方式期间或在给予一种治疗方式之后给予另一种治疗方式。

术语“药品说明书”用于表示通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书，其含有关于与使用此类治疗性产品有关的适应症、用法、剂量、给药、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

“制造产品”是包含至少一种试剂例如用于治疗疾病或病症(例如，癌症)的药物、或用于特异性检测本申请所述的生物标记物的探针的任何制品(例如，包装或容器)或试剂盒。在一些实施方案中，制品或试剂盒是作为用于执行本申请所述方法的单元的形式推销、分销或出售。

术语“标记”及“可检测标记”表示附着例如至抗体或抗原以使得特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)可检测的部分。特异性结合对的经标记成员称为“可检测地标记”。因此，术语“经标记的结合蛋白”是指并入有标记以便识别结合蛋白的蛋白质。在一些实施方案中，标记是能产生可通过视觉或仪器手段(例如，并入经放射性标记的氨基酸或附着至可由经标记的抗生物素蛋白(例如含有可通过光学或比色方法检测的荧光标记物或酶活性的抗生蛋白链菌素)检测的生物素部分的多肽)检测的信号的可检测标记物。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下各项：放射性同位素或放射性核素(例如³H、¹⁴C、³⁵S、⁹⁰Y、⁹⁹Tc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁷⁷Lu、¹⁶⁶Ho或¹⁵³Sm)；色原、荧光标记(例如FITC、若丹明(rhodamine)、镧系磷光体(lanthanide phosphor))、酶标记(例如辣根过氧化酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基；由二级报告基因识别的预定多肽抗原决定簇(例如亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合域、抗原决定簇标签)；和磁性剂，例如钆螯合物。常用于免疫分析的标记的代表性实例包括产生光的原子团，例如吖锭化合物，及产生荧光的原子团，例如荧光素。就此而言，该原子团自身可能无法被检测标记，但在与又一原子团反应后可变为可检测的。

示例性的结合OX40的多肽

本发明提供结合OX40的多肽激动剂。在各种实施方案中，结合OX40的多肽激动剂包含至少一个结合OX40的VHH域。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽激动剂包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个结合OX40的VHH域。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽激动剂包含一个、两个、三个或四个结合OX40的VHH域。此类结合OX40的多肽可包含结合除OX40以外的一种或多种靶蛋白的一个或多个另外VHH域。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽激动剂包含一个Fc域和至少一个结合OX40的VHH域。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽激动剂包含一个Fc域和一个、两个、三个或四个结合OX40的VHH域。在一些实施方案中，Fc域调节结合OX40的多肽在生理学条件下的二聚作用以使得形成OX40结合位点的数量加倍的二聚体。例如，包含三个结合OX40的VHH域和一个Fc区的结合OX40的多肽作为单体是三价的，但在生理学条件下，Fc区可调节二聚作用，使得结合OX40的多肽在这样的条件下以六价二聚体形式存在。非限制性示例性六价的结合OX-40的多肽包括3x1D10v1-Fc和3x1D10v6-Fc，其也分别称为Hex-1D10v1和Hex-1D10v6。不意在受任何特定理论限制，认为通过使OX40群集来改善经由OX40的共刺激作用，表示多价的结合OX40的多肽(例如四价或六价)比单价或二价的结合OX40的多肽更有效。

在各种实施方案中，结合OX40的VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，VHH域是人源化的。

在一些实施方案中，结合OX40的VHH域可经人源化。人源化抗体(例如含VHH的多肽)适用作治疗性分子，这是因为人源化抗体减小或消除对非人类抗体的人类免疫反应，这可导致对抗体治疗剂的免疫反应且降低治疗剂的有效性。一般而言，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中CDR(或其部分)来源于非人类抗体，且FR(或其部分)来源于人类抗体序列。人源化抗体任选地也将包含人类恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基由来自非人类抗体(例如用于产生CDR残基的抗体)的相应残基置换，从而例如恢复或改善抗体特异性或亲和力。

人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro及Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633中，且进一步描述于例如Riechmann等人,(1988)Nature 332:323-329；Queen等人,(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,(2005)Methods 36:25-34；Padlan,(1991)Mol.Immunol.28:489-498(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,(2005)Methods 36:43-60(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,(2005)Methods 36:61-68和Klimka等人,(2000)Br.J.Cancer,83:252-260(描述用于FR改组的“导引式选择”方法)。

可用于人源化的人类骨架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的骨架区(参见例如，Sims等人(1993)J.Immunol.151:2296)；来自于特定子群重链可变区的人类抗体的共同序列的骨架区(参见例如，Carter等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；和Presta等人(1993)J.Immunol,151:2623)；人类成熟(体细胞突变)骨架区或人类生殖系骨架区(参见例如，Almagro和Fransson,(2008)Front.Biosci.13:1619-1633)；和来源于筛选FR库的骨架区(参见例如，Baca等人,(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684和Rosok等人,(1996)J.Biol.Chem.271:22611-22618)。通常由人类FR区置换VHH的FR区来制备人源化VHH。在一些实施方案中，置换人类FR的某些FR残基来改良人源化VHH的一种或多种特性。具有此类置换残基的VHH域在本申请中仍称为“人源化”。

在一些实施方案中，结合OX40的VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3；以及包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的骨架2(FR2)。在一些实施方案中，VHH域进一步包含：包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR3。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽包含至少一个包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VHH域。在一些实施方案中，结合OX40的多肽包含一个、两个、三个或四个包括SEQ IDNO:9的氨基酸序列的VHH域。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽包含三个结合OX40的VHH域和一个Fc域。在一些此类实施方案中，各VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ IDNO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，各VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3；以及包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的骨架2(FR2)。在一些实施方案中，各VHH域进一步包含：包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR3。在一些实施方案中，各VHH域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在各种实施方案中，结合OX40的多肽中包括的Fc域是人类Fc域或来源于人类Fc域。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽中包括的Fc域来源于人类Fc域，且在对应于IgG1的较低铰链中包含三个氨基酸缺失E233、L234和L235，本申请中称为“Fc xELL”。FcxELL多肽不接合FcγR，且因此称为“效应子沉默(effector silent)”或“效应空缺(effector null)”，然而在一些实施方案中，xELL Fc域结合FcRn且因此具有延长的半衰期以及与FcRn介导的再循环相关的穿胞运输。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽中包括的Fc域来源于人类Fc域且包含突变M252Y和M428V，本申请称为“Fc-YV”。在一些实施方案中，此类突变在核内体的酸性pH下(接近6.5)增强与FcRn结合，而在中性pH(约7.2)下失去可检测的结合，使得FcRn介导的再循环增强且半衰期延长。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽中包括的Fc域来源于人类Fc域且包含设计用于杂二聚化的突变，本申请称为“结(knob)”和“孔(hole)”。在一些实施方案中，“结”Fc域包含突变T366W。在一些实施方案中，“孔”Fc域包含突变T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，用于杂二聚化的Fc域包含其它突变，例如位于形成不对称双硫键的杂二聚Fc对的第一成员上的突变S354C和位于杂二聚Fc对的第二成员上的相应突变Y349C。在一些实施方案中，杂二聚Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K以避免蛋白A结合同时保持FcRn结合。在一些实施方案中，杂二聚Fc对的一个成员包含修饰H435R或H435K，而杂二聚Fc对的第二成员在H435处未经修饰。在各种实施方案中，孔Fc域包含修饰H435R或H435K(当修饰为H435R时的一些情况下，称为“孔-R”)，而结Fc域并不包含。在一些情况下，孔-R突变针对可能存在的均二聚体孔Fc域来改善杂二聚体的纯化。

可用于结合OX40的多肽中的非限制性示例性Fc域包括：包含SEQ ID NO:25和26的氨基酸序列的Fc域。

在一些实施方案中，包含三个VHH域和一个Fc域的结合OX40的多肽包含：SEQ IDNO:14的氨基酸序列，和与该氨基酸序列的C端稠合的Fc域。在一些实施方案中，包含三个VHH域和一个Fc域的结合OX40的多肽包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合OX40的多肽由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成。

结合OX40的多肽的示例性活性

在各种实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽是OX40活性的激动剂。在一些实施方案中，激动剂活性可使用本申请实施例中所提供的方法例如使用Jurkat/OX40报告细胞或类似细胞来测定。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外和/或在体内增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖。在一些实施方案中，结合OX40的多肽使CD4⁺和/或CD8⁺T细胞增殖增加至少1.5倍或至少2倍。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞增殖的增加可通过本领域的任何方法，例如本申请实例中提供的方法来测定。一种非限制性示例性试验如下。可从一个或多个健康人类供体分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞且用CellTrace Violet(CTV)染色。随后将T细胞用anti-CD3抗体和结合OX40的多肽共刺激，且随后通过FACS进行分析。CTV染色损失指示增殖。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞增殖的增加测定为例如通过测量从不同健康人类供体分离的CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖而得到的来自一组实验或来自集合的T细胞的平均值。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞增殖的增加测定为来自使用来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞进行的实验或来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞池的平均值。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽甚至在Treg细胞的存在下增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外和/或在体内增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达。CD25表达指示T细胞活化。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达。在一些实施方案中，结合OX40的多肽使CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达增加至少1.5倍或至少2倍。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达的增加可通过本领域的任何方法例如本申请实例中提供的方法来测定。一种非限制性示例性试验如下。可从一个或多个健康人类供体分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞且用anti-CD3抗体和结合OX40的多肽共刺激，且随后通过FACS分析CD25表达。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达的增加，例如通过测量自不同健康人类供体分离的CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达而测定为来自一组实验或来自集合的T细胞的平均值。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上CD25表达的增加测定为来自使用来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞进行的实验或来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞池的平均值。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽甚至在Treg细胞的存在下增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD25表达。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外和/或在体内增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达。CD71表达指示T细胞活化。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达。在一些实施方案中，结合OX40的多肽使CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达增加至少1.5倍或至少2倍。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达的增加可通过本领域的任何方法例如本申请实例中提供的方法来测定。一种非限制性示例性试验如下。可从一个或多个健康人类供体分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞且用anti-CD3抗体和结合OX40的多肽共刺激，且随后通过FACS分析CD71表达。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达的增加，例如通过测量自不同健康人类供体分离的CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达测定为来自一组实验或来自集合的T细胞的平均值。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上CD71表达的增加测定为来自使用来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞进行的实验或来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞池的平均值。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽甚至在Treg细胞的存在下增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的CD71表达。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外和/或在体内增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中的IFNγ表达。IFNγ表达指示T细胞活化。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在体外增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中的IFNγ表达。在一些实施方案中，结合OX40的多肽使CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的IFNγ表达增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍或至少5倍。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中的IFNγ表达的增加可通过本领域的任何方法例如本申请实例中提供的方法来测定。一种非限制性示例性试验如下。可从一个或多个健康人类供体分离CD4⁺和/或CD8⁺T细胞且用anti-CD3抗体和结合OX40的多肽共刺激。为测定胞内IFNγ表达，将细胞粒化并用可检测的anti-CD4和anti-CD8抗体进行表面标记。随后将细胞固定并透膜，随后用可检测的anti-IFNγ抗体染色。随后通过FACS检测IFNγ⁺CD4⁺或IFNγ⁺CD8⁺细胞。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的IFNγ表达的增加，例如通过测量自不同健康人类供体分离的CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中的IFNγ表达而测定为来自一组实验或来自集合的T细胞的平均值。在一些实施方案中，CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中IFNγ表达的增加测定为来自使用来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞进行的实验或来自至少五个或至少十个不同健康供体的T细胞池的平均值。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽甚至在Treg细胞的存在下增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞中的IFNγ表达。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽降低或减弱调节性T细胞(Treg)的抑制活性。在一些实施方案中，结合OX40的多肽使CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的Treg抑制活性降低至少10％、至少20％、至少30％或至少50％。常规CD4⁺和/或CD8⁺T细胞上的Treg抑制活性的降低可通过本领域的任何方法例如本申请实例中提供的方法来测定。一种非限制性示例性试验如下。在将Treg和CD4⁺T细胞从健康人类供体PBMC分离后，用荧光增殖性细胞染料进行差异性标记。以anti-CD3抗体刺激CD4⁺T细胞，同时在本发明提供的结合OX40的多肽存在下培育Treg细胞。将两个T细胞群体共培养3天，且通过流式细胞术监测CD4⁺T细胞的增殖和活化。在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽在Treg细胞的存在下增加CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的活化和增殖，例如相比于在存在Treg细胞而不存在本发明提供的结合OX40的多肽时CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的活化和增殖。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽是多价的，包含多于一个OX40结合域。在各种实施方案中，结合OX40的多肽包含两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个OX40结合域。在一些此类实施方案中，至少一个或所有OX40结合域是相同的。在一些此类实施方案中，所有OX40结合域均包含1D10v6的CDR1、CDR2及CDR3(分别为SEQ ID NO:10、11和12)。在一些实施方案中，至少一个或所有的OX40结合域均包含1D10v6 VHH(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，至少一个OX40结合域包含1D10v6的CDR或VHH，至少一个OX40结合域不包含1D10v6的CDR或VHH。在一些实施方案中，结合OX40的多肽系多特异性的，包含至少一个结合OX40的域和至少一个结合另一抗原的域。在一些实施方案中，第二抗原选自：PD1、PDL1、CTLA4、TIGIT、LAG3、VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CD73、CD39、41BB、GITR、CD28、ICOS、HVEM、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗-Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、胶原蛋白、畸胎瘤衍化生长因子(Cripto)、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、纤维结合蛋白外域B(EDB)、FLT-3、α型叶酸受体(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配位体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、LewisX、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、黏蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、NEctin 4、呆蛋白(Nicastrin)、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰-丝胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇-1-磷酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2和WISP-3。在一些实施方案中，该至少一个结合第二抗原的结合域是拮抗剂或激动剂。在一些实施方案中，该至少一个结合第二抗原的结合域是VHH域。

本发明提供表达本发明提供的结合OX40的多肽的工程改造细胞。在一些实施方案中，结合OX40的多肽是从细胞分泌的。在一些实施方案中，结合OX40的多肽包含信号肽，例如抗体信号肽或促使细胞分泌多肽的其它信号序列。信号肽或信号肽的一部分可在多肽分泌时从该多肽裂解。在一些实施方案中，结合OX40的多肽可由细胞中的核酸编码，随后由细胞表达和分泌。核酸通常含有适用于在所需条件下表达的合适调节序列(例如，启动子和/或增强子)。核酸可并入细胞的基因组中，或可作为基因组外核酸的形式存在。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，例如原代免疫细胞。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽是嵌合抗原受体(CAR)。CAR为通常在细胞(例如，T细胞)表面上表达的融合分子中含有胞外标靶或结合部分(例如，抗原结合域、跨膜域和一或多个信号传递域)的合成受体。因此，CAR将抗原特异性和T细胞活化特性合并于单一分子中。第一代CAR通常包括CD3ζ或Fc l受体γ链的细胞质区作为其信号传递域。已在对卵巢癌、肾癌、淋巴瘤和成神经细胞瘤患者的I期临床研究中测试第一代CAR，其在这些患者中已诱发适度反应(综述于Sadelain等人,Curr Opin Immunol,21(2):215-223,2009中)。第二代CAR含有共刺激分子的信号传递域(例如CD28和CD3ζ)，其提供双重信号传递来引导组合的活化和共刺激信号。第三代CAR更为复杂，具有三个或更多个信号传递域(综述于Sadelain等人,Cancer Discovery(3),388-398,2013和Dotti等人,Immuno.Rev,257(1),1-36,2014)中。

在一些实施方案中，CAR的胞外结合部分包含一个或多个结合域，例如结合OX40的VHH域。在一些实施方案中，胞外结合部分是多价的，包含多于一个结合OX40的结合域。在各种实施方案中，胞外结合部分包含两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个OX40结合域。在一些此类实施方案中，至少一个或所有OX40结合域是相同的。在一些此类实施方案中，所有OX40结合域均包含1D10v6的CDR1、CDR2和CDR3(分别为SEQ ID NO:10、11和12)。在一些实施方案中，至少一个或所有的OX40结合域均包含1D10v6 VHH(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，至少一个OX40结合域包含1D10v6的CDR或VHH，至少一个OX40结合域不包含1D10v6的CDR或VHH。在一些实施方案中，胞外结合部分是多特异性的，包含至少一个结合OX40的域和至少一个结合另一抗原的域。在一些实施方案中，第二抗原选自：PD1、PDL1、CTLA4、TIGIT、LAG3、VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CD73、CD39、41BB、GITR、CD28、ICOS、HVEM、5T4、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗-Lewis-Y、Apelin J受体、APRIL、B7-H3、B7-H4、B7-H6、BAFF、BTLA、C5补体、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5(CEA)、CEACAM6(NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、胶原蛋白、畸胎瘤衍化生长因子、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL3、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、内皮素B受体(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV的F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、纤维结合蛋白外域B(EDB)、FLT-3、α型叶酸受体(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受体、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、透明质酸酶、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受体(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R(wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰岛素受体、Jagged配位体、Jagged 1、Jagged 2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、间皮素、MRP4、MUC1、黏蛋白-16(MUC16、CA-125)、Na/KATPase、NGF、NEctin 4、呆蛋白、Notch受体、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂酰-丝胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、鞘氨醇-1-磷酸、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、转铁蛋白、转铁蛋白受体、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2和WISP-3。在一些实施方案中，胞外结合部分中的一个或多个抗原结合域是scFv或VHH。在一些实施方案中，胞外结合部分结合或能够结合标靶抗原，其亲和力足以使CAR适用于疗法，例如适用于靶向表达标靶抗原的细胞或组织。

CAR的跨膜域是通常跨越或能够跨越或横跨质膜且(例如经由间隔子，例如免疫球蛋白铰链序列)直接或间接地连接至胞外抗原结合域和含有内质网部分的胞内信号传递域的域。在一些实施方案中，CAR的跨膜域是跨膜蛋白(例如，I型跨膜蛋白)的跨膜区、人工疏水性序列或其组合。在一些实施方案中，跨膜域包含CD3ζ域或CD28跨膜域。其它跨膜域对于本领域技术人员而言将为显而易见的，且可与本发明提供的CAR的实施方案结合使用。

本发明提供的CAR的胞内信号传递区含有一个或多个胞内信号传递域，该胞内信号传递域经由CAR的抗原结合域的接合作用，例如经由结合抗原将信号传递至T细胞。在一些实施方案中，胞内区含有胞内信号传递域，其为ITAM信号传递域或含有ITAM信号传递域。示例性胞内信号传递域包括例如来源于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同源物(例如，η链、FcsRIy和β链、MB 1(Iga)链、B29(Ig)链等)、人类CD3ζ链、CD3多肽(Δ、δ和ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)以及T细胞转导中所包含的其它分子(例如CD2、CD5、OX40和CD28)的信号传递域。在特定实施方案中，胞内信号传递区含有来源于人类CD3ζ链的胞内信号传递域。

在一些实施方案中，胞内域包含CD3-ζ信号传递域。在一些实施方案中，CD3-ζ信号传递域包含SEQ ID NO:27中所述的氨基酸序列，或展现出与SEQ ID NO:27有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列一致性且保留T细胞信号传递活性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR的胞内信号传递区可进一步含有来源于共刺激分子的胞内信号传递域。在此类实施方案中，此种信号传递域例如在抗原特异性结合后，例如与仅含有含ITAM的信号传递域(例如，CD3ζ)的CAR相比，经由记忆细胞的增殖、存活和/或发展的增强可增强CAR-T细胞活性。在一些实施方案中，共刺激域是由选自以下的蛋白质获得的功能性信号传递域：CD28、CD137(4-IBB)、CD134(OX40)、DapIO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1(CD1 la/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其组合。在特定实施方案中，共刺激信号传递域来源于人类蛋白或由人类蛋白获得。在一些方面中，共刺激信号传递域来源于人类CD28或人类CD137(4-IBB)或由人类CD28或人类CD137(4-IBB)获得。

在一些实施方案中，共刺激信号传递域来源于CD28或4-1BB且包含SEQ ID NO:28-31中任一者所述的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:28-31有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列一致性且保留T细胞共刺激信号传递活性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，CAR进一步包含连接胞外抗原结合域与跨膜域的铰链或间隔区。该铰链或间隔区可用于实现所得CAR的不同的长度和挠性。可使用的铰链或间隔区的实例包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物、抗体的铰链区或其片段或衍生物、抗体的C_H2区、抗体的C_H3区、人工间隔序列(例如，肽序列)或其组合。其它铰链或间隔区对于本领域技术人员而言将为显而易见的且可使用。在一种实施方案中，铰链系IgG4铰链或CD8A铰链。

在一些实施方案中，间隔子及跨膜域来源于CD8的铰链及跨膜域，例如具有如SEQID NO:32-34中所述的示例性序列或展现出与SEQ ID NO:32-34有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列一致性的氨基酸序列。

本发明也提供经分离核酸，其包含编码包含本发明提供的结合OX40的多肽的CAR的多聚核苷酸。在一些实施方案中，通过双顺反子元件(例如IRES)或核糖体跳跃序列(例如，T2A或P2A)将编码CAR的第一核酸与编码结合OX40的多肽的第二核酸分离。在一些方面中，构建体(construct)为用于在细胞中表达结合OX40的多肽和/或CAR的表达载体。表达载体可为病毒载体。病毒载体技术是本领域公知的且例如描述于Sambrook等人(MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,2013)中。已研发出多种用于将基因转移至哺乳动物细胞中的基于病毒的系统。例如，使用逆转录病毒，例如腺病毒载体。在一种实施方案中，使用慢病毒载体。

在另一方面中，本发明也提供一种经分离细胞或细胞群体，其包含一种或多种如上文所述的核酸构建体。本发明也提供一种经分离细胞或细胞群体，其已经经基因修饰以表达本发明所提供的结合OX40的多肽和/或CAR。因此，本发明提供基因工程改造的细胞，其包含本发明提供的CAR，且任一者可稳定表达本发明提供的CAR。在一种实施方案中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、造血干细胞和/或多能胚胎/诱导干细胞。在一些情形中，细胞为T细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞对受试者而言是自体性的。例如，在一些实施方案中，T细胞可从患者分离(也称为原代T细胞)以用于由CAR核酸构建体进行工程改造，例如转染或转导。

在一种示例性方法中，原代T细胞可离体纯化(CD4+细胞或CD8+细胞或其两者)且由TCR/CD28激动剂(例如，经anti-CD3/anti-CD28涂布的珠粒)刺激。2或3天活化过程后，编码CAR的重组表达载体可经标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略而稳定引入至原代T细胞中。可例如通过使用与原生亲代分子交叉反应的抗-抗原决定簇标签(anti-epitope tag)或抗体的流式细胞术监控细胞的结合OX40的多肽分泌和/或CAR表达。表达CAR的T细胞可根据应用经由用抗-抗原决定簇标签抗体分选来富集或针对高表达或低表达而富集。

可通过各种方式来分析结合OX40的多肽和/或经CAR工程改造的T细胞的适当功能。在一些情况下，可使用在体外细胞毒性、增殖、OX40报告基因分析或细胞因子分析(例如，IFN-γ、IL-2、TNFα表达)来评估经工程改造T细胞的功能。示例性标准端点为肿瘤细胞系的溶胞％、经工程改造T细胞的增殖或培养上清液中的IFN-γ蛋白质表达。在一些情况下，例如可通过监测活化标记物(例如、CD44或CD62L)的表达、增殖和/或细胞因子产生来评估(例如)经由抗原刺激CAR来刺激T细胞活化的能力。

本发明也提供用于预防和/或治疗受试者疾病或病况(例如癌症)的方法，其包括向受试者给予本发明提供的工程改造细胞。一般而言，受试者需要治疗疾病或病况。药物学上活性量的细胞和/或本发明的药物组合物。在一些实施方案中，治疗中使用表达且分泌本发明提供的结合OX40的多肽的细胞。在一些实施方案中，使用本发明提供的表达结合OX40的多肽的CAR工程改造T细胞进行治疗。

多肽表达和产生

本发明提供包含编码结合OX40的多肽的多聚核苷酸的核酸分子。因此，在各种实施方案中，提供编码结合OX40的VHH域的核酸分子，该VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR3。在一些实施方案中，提供编码结合OX40的VHH域的核酸分子，该VHH域包含：包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR2、和包括SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR3；以及包括SEQ ID NO:22的氨基酸序列的骨架2(FR2)。在一些实施方案中，核酸分子进一步编码包括SEQ ID NO:23的氨基酸序列的FR3。在一些实施方案中，提供编码结合OX40的多肽的核酸分子，该结合OX40的多肽包含至少一个(例如一个、两个、三个或四个)包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VHH域。在各种实施方案中，核酸分子进一步编码Fc域，例如SEQ ID NO:25或26的Fc域。在一些实施方案中，提供编码结合OX40的多肽的核酸分子，该结合OX40的多肽包含三个VHH域和包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的Fc域以及与该氨基酸序列的C端稠合的Fc域。在一些实施方案中，提供编码结合OX40的多肽的核酸分子，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或由SEQ ID NO:15的氨基酸序列组成。在前述任一实施方案中，核酸分子也可编码引导结合OX40的多肽的分泌的前导序列，该前导序列通常裂解以使其不存在于所分泌的多肽中。前导序列可为天然重链(或VHH)前导序列，或可为另一种异源前导序列。

核酸分子可使用本领域常规的重组DNA技术来构建。在一些实施方案中，核酸分子为适于在所选宿主细胞中表达的表达载体。

本发明提供包含编码本申请所述的结合OX40的多肽的核酸的载体。此类载体包括但不限于DNA载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，选择经优化的载体以供在所需的细胞类型(例如CHO或CHO衍生细胞)中或在NSO细胞中表达多肽。示例性的此类载体描述于例如Running Deer等人,Biotechnol.Prog.20:880-889(2004)中。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽可表达于原核细胞中，例如细菌细胞；或表达于真核细胞中，例如真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。这种表达可例如根据本领域已知的过程来进行。可用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于COS细胞，包括COS 7细胞；293细胞，包括293-6E细胞；CHO细胞，包括CHO-S，DG44，Lec13 CHO细胞和FUT8 CHO细胞；细胞(Crucell)；和NSO细胞。在一些实施方案中，结合OX40的多肽可在酵母中表达。参见例如美国专利公开US2006/0270045A1。在一些实施方案中，基于对多肽进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，CHO细胞产生多肽，该多肽的唾液酸化水平高于在293细胞中所产生的相同多肽。

向所需宿主细胞中引入一种或多种核酸(例如载体)可通过任何方法来实现，包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-聚葡萄糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性示例性方法描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第3版，Cold Spring Harbor Press(2001)中。核酸可根据任何合适方法在所需宿主细胞中暂时或稳定转染。

本发明也提供包含本申请所述的任何核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明提供一种表达本申请所述的结合OX40的多肽的宿主细胞。可通过任何合适方法来纯化在宿主细胞中表达的结合OX40的多肽。此类方法包括但不限于使用亲和性基质或疏水性相互作用色谱。合适的亲和性配位体包括ROR1 ECD和结合Fc区的药剂。例如，蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或抗体亲和柱可用于结合Fc区和纯化包含Fc区的结合OX40的多肽。疏水相互作用色谱，例如丁基或苯基柱，也可适用于纯化一些多肽，例如抗体。离子交换色谱(例如，阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱)也可适用于纯化一些多肽，例如抗体。混合模式色谱(例如，逆相/阴离子交换、逆相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可适用于纯化一些多肽，例如抗体。本领域已知多种用于纯化多肽的方法。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽在无细胞系统中产生。非限制性示例性无细胞系统描述于例如Sitaraman等人,Methods Mol.Biol.498:229-44(2009)；Spirin,TrendsBiotechnol.22:538-45(2004)；Endo等人,Biotechnol.Adv.21:695-713(2003)中。

在一些实施方案中，本发明提供通过上述方法制备的结合OX40的多肽。在一些实施方案中，在宿主细胞中制备结合OX40的多肽。在一些实施方案中，在无细胞系统中制备结合OX40的多肽。在一些实施方案中，将结合OX40的多肽纯化。在一些实施方案中，本发明提供一种包含结合OX40的多肽的细胞培养基。

在一些实施方案中，本发明提供包含通过上文所述方法制备的抗体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含在宿主细胞中制备的结合OX40的多肽。在一些实施方案中，组合物包含在无细胞系统中制备的结合OX40的多肽。在一些实施方案中，组合物包含经纯化的结合OX40的多肽。

使用结合OX40的多肽治疗疾病的示例性方法

在一些实施方案中，本发明提供治疗个体疾病的方法，其包括给予结合OX40的多肽。此类疾病包括将受益于CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的增殖和活化增加的任何疾病。在一些实施方案中，本发明提供治疗个体癌症的方法。该方法包括向个体给予有效量的本发明提供的结合OX40的多肽。此类治疗方法可针对人类或动物。在一些实施方案中，本发明提供治疗人类的方法。可由本发明提供的结合OX40的多肽治疗的非限制性示例性癌症包括：基底细胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；大脑及中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠和直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；晚期胃癌；胃肠道癌；胶质母细胞瘤；原发性肝癌；肝细胞瘤；上皮内瘤变；肾脏癌或肾癌；喉癌；肝癌；肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；肺腺癌；肺鳞癌；黑素瘤；骨髓瘤；成神经细胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰脏癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睪丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；以及外阴癌；淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高度小无核裂细胞性NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；瓦登史东巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；和慢性骨粒细胞白血病。

结合OX40的多肽可视需要给予受试者。给药频率可由本领域技术人员例如主治医师基于考虑待治疗病况、待治疗的受试者的年龄、待治疗病况的严重程度、待治疗的受试者的一般健康状况及类似因素来确定。在一些实施方案中，向受试者给予一或多次有效剂量的结合OX40的多肽。在一些实施方案中，以每天、每半周、每周、每两周、每月一次等向受试者给予有效剂量的结合OX40的多肽。向受试者给予至少一次有效剂量的结合OX40的多肽。在一些实施方案中，有效剂量的结合OX40的多肽可多次给予，包括在至少一个月、至少六个月或至少一年的病程期间多次给予。

在一些实施方案中，以有效治疗(包括预防)癌症和/或增加T细胞增殖的量给予药物组合物。治疗有效量通常取决于待治疗的受试者的体重、其生理或健康状况、待治疗病况的广泛性或待治疗的受试者的年龄。一般而言，可以每次给药约0.05mg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约0.5mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约0.05mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以每次给药约0.05mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量给予抗体。在一些实施方案中，可以约5mg/kg体重或小于5mg/kg体重范围内的量给予抗体，例如小于4、小于3、小于2或小于1mg/kg的抗体。

在一些实施方案中，结合OX40的多肽可通过各种途径活体内给予，这些途径包括但不限于静脉内、动脉内、非经肠、腹膜内或皮下。适当配制物和投药途径可根据预期应用来选择。

在一些实施方案中，使用结合OX40的多肽的治疗性处理通过增加T细胞增殖和/或活化来实现。在一些实施方案中，增加T细胞增殖和/或活化抑制癌的生长。

药物组合物

在一些实施方案中，以含各种药物学上可接受的载剂的配制物的形式提供包含结合OX40的多肽的组合物(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practice ofPharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,LippencottWilliams and Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000))。可用各种药物学上可接受的载剂，包括媒剂、佐剂及稀释剂。此外，也可用各种药物学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂(tonicity adjusting agents)、稳定剂、湿润剂及其类似物。非限制性示例性载剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。

在一些实施方案中，药物组合物包含浓度为至少10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL、225mg/mL或250mg/mL的结合OX40的多肽。

组合疗法

结合OX40的多肽可单独或与其它治疗模式(例如，其它抗癌剂)组合给予。其可在其它治疗模式之前、基本上与其它治疗模式同时或在其它治疗模式之后(即，同时或依序)来提供。在一些实施方案中，本申请所述的治疗方法可进一步包括给予：放射疗法、化疗、疫苗接种、靶向肿瘤疗法、CAR-T疗法、溶瘤病毒疗法、癌症免疫疗法、细胞因子疗法、手术切除、染色质修饰、烧蚀、冷冻疗法、对抗肿瘤标靶的反义药剂、对抗肿瘤标靶的siRNA剂、对抗肿瘤标靶的microRNA剂或抗癌/肿瘤剂，或生物制剂，例如抗体、细胞因子或受体胞外域-Fc融合。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽与第二治疗剂(例如，PD-1疗法)同时提供。PD-1/PD-L1疗法的实例包括纳武单抗(nivolumab，BMS)；匹地利珠单抗(pidilizumab，CureTech，CT-011)、帕博利珠单抗(pembrolizumab，Merck)；德瓦鲁单抗(durvalumab，Medimmune/AstraZeneca)；阿特珠单抗(atezolizumab，Genentech/Roche)；阿维鲁单抗(avelumab，Pfizer)；AMP-224(Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514(Amplimmune)；MDX-1105(Merck)；TSR-042(Tesaro/AnaptysBio，ANB-011)；STI-A1010(Sorrento Therapeutics)；STI-A1110(Sorrento Therapeutics)；以及针对程序性死亡-1(PD-1)或程序性死亡配位体1(PD-L1 PD-L1)的其它药剂。

在一些实施方案中，本发明提供的结合OX40的多肽与CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法、溶瘤病毒疗法、细胞因子疗法和/或靶向其它检查点分子的药剂(例如VISTA、gpNMB、B7H3、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)同时给出。

诊断和治疗的非限制性示例性方法

在一些实施方案中，本申请所述的方法适用于评估受试者和/或来自受试者(例如，癌症患者)的样品。在一些实施方案中，评估是诊断、预后和/或对治疗做出反应中的一者或多者。

在一些实施方案中，本申请所述的方法包含评估蛋白质的存在、不存在或含量。在一些实施方案中，本申请所述的方法包含评估核酸的存在、不存在或表达水平。本申请所述的组合物可用于这些测量。例如，在一些实施方案中，本申请所述的方法包含使肿瘤或由肿瘤培养的细胞样品与如本申请所述的治疗剂接触。

在一些实施方案中，评估可引导治疗(包括以本申请所述的抗体进行治疗)。在一些实施方案中，评估可引导辅助疗法在切除之后的使用或拒绝。辅助疗法(也称作辅助护理)是除初级、主要或初始治疗以外给出的治疗。作为非限制性实例，辅助疗法可为通常在手术后当所有可检测疾病已移除，但由于隐性疾病而仍存在统计学复发风险时所给出的额外治疗。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中的辅助疗法。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中唯一的辅助疗法。在一些实施方案中，本申请所述的抗体被拒绝作为癌症治疗中的辅助疗法。例如，若患者不可能对本申请所述的抗体起反应或将具有最低程度的反应，则为生活质量起见可不给予治疗且避免来自低效化学疗法的不必要毒性。在这样的情况下，可使用姑息护理。

在一些实施方案中，给予这些分子作为切除前的新辅助疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法是指在任何手术之前使肿瘤收缩和/或降低的疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法表示在手术之前向癌症患者给予的化学疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法表示在手术之前向癌症患者给予的抗体。通常考虑新辅助化学疗法的癌症类型包括例如乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和肺癌。在一些实施方案中，抗体用作癌症治疗中的新辅助疗法。在一些实施方案中，在切除之前使用。

在一些实施方案中，本申请所述方法中涵盖的肿瘤微环境是以下中的一种或多种：肿瘤血管结构；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(EPC)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其它基质细胞；细胞外基质(ECM)的组分；树突状细胞；抗原呈递细胞；T细胞；调节性T细胞；巨噬细胞；中性粒细胞；和位于肿瘤附近的其它免疫细胞。

试剂盒

本发明也提供包括如本申请所述的任何结合OX40的多肽和合适包装的制品和试剂盒。在一些实施方案中，本发明包括试剂盒，其具有(i)结合OX40的多肽，和(ii)关于使用向个体给予结合OX40的多肽的试剂盒的说明书。

适用于本申请所述组合物的合适包装是本领域已知的，且包括例如小瓶(例如，密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐、挠性包装(例如，密封聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)及其类似物。这些制品可进一步经灭菌和/或密封。本发明也提供包含本申请所述组合物的单位剂型。这些单位剂型可以单个或多个单位剂型储存于合适包装中且也可经进一步灭菌和密封。本发明试剂盒中提供的说明书通常为标签或药品说明书(例如，试剂盒中包括的纸片)上的书面说明书，但机器可读说明书(例如，磁盘或光盘上存储的说明书)也是可接受的。与使用抗体相关的说明书一般包括关于用于期望治疗或工业用途的剂量、给药方案和给药途径的信息。试剂盒可进一步包含选择合适治疗的个体的描述。

容器可为单位剂量、散装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，也可提供含有足够剂量本申请公开的分子以对个体提供延长期有效治疗的试剂盒，该延长期为例如约1周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更久中的任一者。试剂盒也可包括多个单位剂量的分子以及使用说明，且以对于在药房(例如医院药房和配药房)中储存和使用而言足够的量包装。在一些实施方案中，试剂盒包括干燥(例如，冻干)组合物，其可经恢复原状、再悬浮或再水合以形成抗体的通常稳定的水性悬浮液。

实施例

以下讨论的实施例仅为本发明的示例，且不应视为以任何方式限制本发明。这些实施例并非意在表示下述实验为所进行的所有实验或唯一实验。虽然已努力确保关于所用数字(例如，含量、温度等)的准确性，但应当说明还是会存在一些实验性误差和偏差。除非另外指明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度以摄氏度计，压力是大气压或接近大气压。

实施例1：1D10v6-Fc与1D10v1-Fc相比具有减少的非特异性结合

先前已研发包含结合OX40的VHH域的单域抗体(sdAb)。参见PCT公开WO 2017/123673A2。选择SdAb 1D10用于人源化，产生1D10v1。参见同上及SEQ ID NO:3。

优化1D10v1以减少非特异性结合。该优化导致置换sdAb的VHH域的CDR3中的一个氨基酸以及置换骨架区2(FR2)中的两个氨基酸，得到1D10v6(SEQ ID NO:9)。1D10v6的CDR3(SEQ ID NO:12)相对于1D10v1的CDR3(SEQ ID NO:6)而言G置换为A，且1D10v6的FR2中GL置换为ER(SEQ ID NO:22)。令人惊讶地，如下文所述，那些置换减少sdAb的非特异性结合，同时保持对人类以及食蟹猕猴OX40的亲和力。

通过在高温应力下的流式细胞术来测定二价sdAb的非特异性结合。将经纯化的1D10v1-Fc和1D10v6-Fc缓冲交换至20mM Tris pH 8.0、150mM NaCl、2％海藻糖、0.2％TWEEN-20中，且通过在50℃培育7天以施加应力。随后使用0.2μm Acrodisc针筒过滤器将抗体过滤，且通过A280测量术进行定量化。HEK293细胞并未在细胞表面上表达可测量的OX40，且因此用作非特异性结合的对照细胞系。以连续稀释的温度加应力的1D10v1-Fc或1D10v6-Fc培育每孔30,000个细胞。在以一级抗体培育之后，以1/2000的稀释比使用二级anti-人类Fc Alexa Fluor 647，随后在Intellicyte iQue Plus中通过流式细胞术测量结合的抗体，且将荧光作为中值荧光强度绘图。如图1中所示，1D10v1-Fc在约33nM sdAb起始时对未经转染的HEK293细胞展示非特异性结合，该结合随sdAb浓度增加而显著增加。相比之下，1D10v6-Fc在高达1000nM sdAb时仍未对未经转染的HEK293细胞展示可检测的结合。

如下测定sdAb与人类以及食蟹猕猴OX40的结合。将表达全长人类OX40或食蟹猕猴OX40的经稳定转染的CHO细胞以每孔50,000个细胞涂板(plated)。将抗体从400nM开始以1:3连续稀释滴定，且以anti-人类Fc 488二级抗体检测。在Intellicyte iQue分析仪上进行流动式细胞测量分析，且将荧光作为平均荧光强度绘图。如图2中所示，1D10v6-Fc展示出与1D10v1-Fc相当的对人类OX40的集合(图2A)和对食蟹猕猴OX40的接合(图2B)。1D10v6-Fc对人类OX40和对食蟹猕猴OX40的亲和力(K_D)分别为0.81nM和0.66nM。1D10v1-Fc对人类OX40和对食蟹猕猴OX40的亲和力(K_D)分别为0.86nM和0.79nM。

实施例2：六价3x1D10v6-Fc与六价3x1D10v1-Fc相比具有减小的非特异性结合

通过将三个VHH域连接至Fc来制备六价抗OX40 sdAb，该多肽形成六价二聚体。如下测定六价3x1D10v1-Fc(SEQ ID NO:8；也称作Hex-1D10v1)以及六价3x1D10v6-Fc(SEQ IDNO:14；也称作Hex-1D10v6)的非特异性结合。将3x1D10v1-Fc和3x1D10v6-Fc在室温，在20mMHis、150mM NaCl、0.02％TWEEN-20(pH 9)的缓冲液中，以未经转染的HEK293游离式细胞或以表达全长OX40的经短暂转染HEK293游离式细胞培育48小时。荧光anti-Fc特异性二级抗体用于检测结合的3x1D10v1-Fc和3x1D10v6-Fc，并使用Intellicyte iQue分析仪通过流式细胞术来测量。针对各浓度的抗体绘制平均荧光强度。

如图3中所示，3x1D10v1-Fc与3x1D10v6-Fc在这些条件下展示出相当的特异性结合，其表观K_D分别为0.82nM和0.90nM(图3A)。3x1D10v1-Fc展示与未经转染的HEK293细胞非特异性结合，而3x1D10v6-Fc并未展示(图3B)。

实施例3：六价3x1D10v6-Fc保持OX40激动剂活性

如上文所述，3x1D10v6-Fc与HEK293细胞的非特异性结合减小，但保持OX40结合亲和力。如下证实3x1D10v6-Fc的激动剂活性。

将解冻使用(Thaw-and-Use)的Jurkat/OX40报告细胞(Promega)传代5从液氮中取出并在37℃水浴中解冻。细胞稳定表达OX40且含有NFκB应答元件下游的荧光素酶报告基因。将细胞轻微地混合并转移至9mL预温热的培养基(RPMI+10％FBS)中。将细胞以400x g离心5分钟，并再悬浮于5mL的试验培养基(RPMI+10％FBS)中。使用锥虫蓝(Trypan Blue)和TC20自动细胞计数器测定细胞密度和存活率。在试验板的内部60个孔中，在50μL/孔试验培养基中以6x10⁴个细胞/孔将细胞涂板。以100μL/孔向外部孔中添加试验培养基。向试验板的各角落储集器中添加2.5mL试验培养基。

将3x1D10v1-Fc和3x1D10v6-Fc在试验培养基中稀释以使浓度为所需最高最终浓度的2倍。进行9点连续稀释(5倍、5倍、2倍、2倍、2倍、2倍、5倍、5倍)，最高浓度为50nM且最低浓度为0.005nM。因此，最终分析浓度将为最高25nM且最低0.0025nM。在96孔稀释板中进行抗体稀释。向试验板中添加50μL/孔的2x抗体稀释液。每孔的最终试验体积为100μL。将试验板以板盖覆盖并于37℃的CO₂培育箱中放置6小时。

培育6小时后，将试验板从培育箱取出并在室温放置10分钟。向试验板中每个含有细胞的孔中添加100μL恢复原状的Bio-Glo荧光素酶试剂(Promega)。将试验板在室温培育10分钟。将100μL/孔的试验板转移至白色的96孔板中以测量相对发光单位(RLU)。根据试剂表中定义的设置(PMT-MaxRange，目标波长-470nm)，在Molecular Devices SpectraMax L板阅读器和SoftMax Pro 5.4版上读取板数。

实验结果展示于图4中。最大结合(Bmax)和50％反应时的酶浓度(K_D)表明，3x1D10v6-Fc在OX40荧光素酶报告基因试验中具有与3x1D10v1-Fc相当的活性。

实施例4：六价3x1D10v6-Fc具有较优的OX40激动剂活性

为证明六价3x1D10v6-Fc优于二价和四价形式(分别为SEQ ID NO:13及16)的较优OX40激动剂，使用基本上如实施例3中所述的OX40荧光素酶报告基因试验。

实验结果展示于图5中。六价3x1D10v6-Fc在此试验中优于四价2x1D10v6-Fc，表明3x1D10v6-Fc是较优的激动剂。二价1D10v6-Fc在此试验中展示最小活性。

实施例5：六价3x1D10v6-Fc增加T细胞增殖

PBMC分离：如下使用密度梯度离心从正常人类供体白细胞去除术或全血样品分离的PBMC。将血液样品以PBS/2％FBS(1:2)稀释且将30ml的稀释血液分层至15ml的淋巴细胞分离剂(Lymphoprep，Stemcell Technologies)密度梯度培养基上。在以800xg离心30分钟后，移除血浆与淋巴细胞分离剂的界面处的PBMC层并将剩余的红细胞使用红细胞溶解缓冲液(BioLegend)在室温溶解5分钟。将细胞在PBS中洗涤，随后以每毫升100x10⁶个细胞在Cryostor CS10(Stemcell Technologies)中冷冻保鲜。

T细胞富集：在室温将非T细胞群体以针对CD14、CD16、CD19、CD20、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ(BioLegend)的经生物素标记的抗谱系(anti-lineage)标记抗体标记20分钟。随后通过在室温以磁性抗生蛋白链菌素粒子(每100x10⁶中500μl珠粒浆料加500μl细胞悬浮液，在磁体上培育2x8分钟)培育20分钟耗尽非T细胞群体。未结合的细胞上清液含有T细胞。或者，根据制造商推荐，使用EasySep Human T cell Enrichment Kit(StemcellTechnologies)从PBMC样品富集T细胞。为产生富集CD4⁺T细胞，基本上如上文所述以经生物素标记的anti-CD8抗体培育富集的T细胞并使用磁性抗生蛋白链菌素粒子耗尽。

涂布M-450甲苯磺酰基活化的珠粒：根据制造商推荐的涂布程序，以每4x 10⁸个珠粒200μg小鼠anti-人类CD3抗体(克隆OKT3；eBioscience)涂布用于T细胞活化试验的刺激物珠粒。简而言之，将珠粒在缓冲液1(0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.4-8.0)中洗涤一次，随后在室温在含有200μg anti-人类CD3抗体的缓冲液1中在管式旋转器中培育18小时。随后将珠粒用缓冲液2(PBS、0.1％BSA、2mM EDTA pH 7.4)洗涤4次。通过将珠粒在37℃在缓冲液3(0.2M Tris、0.1％BSA，pH 8.5)中培育4小时使游离甲苯磺酰基失活。随后将珠粒在缓冲液2中洗涤一次并再悬浮至每毫升400x10⁶个珠粒的浓度。

共刺激分析：将富集的CD4⁺T细胞(来自四种不同供体)按1:1000的稀释比用CellTrace Violet(CTV；Invitrogen)标记。随后将细胞一式三份以200,000个细胞/孔涂于圆底96孔板中并与100,000个经anti-人类CD3抗体涂布的珠粒组合。由50nM最终浓度开始用3x1D10v6-Fc或二价1D10v6-Fc滴定，且在整个板上以1:5滴定来培育培养物。最终培养物体积为200μl/孔，并将细胞在37℃/5％CO₂培育4天。

FACS染色：在T细胞培养第4天，将细胞在150μL FACS缓冲液中洗涤一次并将细胞集结粒再悬浮于50μl的表面标记染色溶液(含有CD4、CD25和CD71的抗体和碘化丙锭)中。将细胞在室温培育20min，之后进行最终洗涤，并在SONY Analyzer流式细胞仪上进行分析。使用FlowJo软件来分析T细胞群体。随后使用Excel和GraphPad PRISM输出和分析不同活化标记物的原始平均荧光强度。对各值进行绘图，并使用[激动剂]相对于反应-可变斜率(四个参数)非线性曲线拟合来拟合滴定曲线，从而评估剂量-反应关系。该拟合也用于确定各供体的有效浓度(EC50)。

FACS选通策略(gating strategy)：为评估T细胞亚群上的T细胞增殖量以及活化标记物表达水平，使用以下选通策略：通过FSC/SSC尺寸排阻排除细胞碎片，且基于其阳性碘化丙锭信号排除死亡细胞。使用FSC-A/FSC-H双重和聚集排除来选择单个细胞。剩余细胞群体经确认为CD4⁺。CellTrace Violet(CTV⁺)染色与单独T细胞对照物相比的损耗指示细胞增殖。活化标记物CD25和CD71的MFI水平增加指示T细胞活化。

IFNγELISA和数据分析：在细胞培养第4天，获取上清液样品并将其储存于-80℃。根据制造商的方案，使用IFNγELISA试剂盒来测量细胞培养上清液中的IFNγ含量。简而言之，在4℃以anti-IFNγ捕获抗体涂布ELISA板并保持过夜。次日，将板在试验缓冲液中阻断(blocked)1小时，之后将细胞上清液培育2小时。将样品在试验缓冲液中以1:25稀释。通过将板以经生物素标记的检测抗体培育1小时且接着以辣根过氧化酶结合的抗生蛋白链菌素试剂培育来检测抗原结合。在添加底物溶液且培育15分钟后测量HRP活性。在添加终止液后，在450nm波长下在Emax精确微量板阅读器上分析板。

使用微量板阅读器的Softmax Pro分析软件分析来自Emax精确微量板阅读器的原始值。使用标准曲线和四参数逻辑回归的吸光度值来计算以pg/ml计的样品IFNγ含量。将分析值输出至Excel(Microsoft,15.27版)中用于进一步数据分析。使用PRISM(GraphPadSoftware Inc.,7.0c版)对各值进行绘图，并使用[激动剂]相对于反应-可变斜率(四个参数)非线性曲线拟合来拟合滴定曲线，从而评估剂量-反应关系。

如图6中所示，以六价3x1D10v6-Fc治疗而不以二价1D10v6-Fc治疗导致来自所有四种供体的CD4⁺T细胞增殖均增加。以六价3x1D10v6-Fc治疗也导致所有四种供体中的活化标记物CD25及CD71的含量较高(图7和图8)。经3x1D10v6-Fc治疗后，分泌的IFNγ含量也较高(图9)。共刺激的强度随供体而变化，但通常是剂量依赖性的。计算的EC50值总结于以下表2中。

表2：3x1D10v6-Fc的EC50值：

总之，3x1D10v6-Fc在体外改善anti-CD3抗体介导的T细胞刺激。不意在受任何特定理论限制，该试验中的有效共刺激似乎需要例如用六价3x1D10v6-Fc来群集OX40。

实施例6：六价3x1D10v6-Fc增强T细胞共刺激和IFNγ产生

在存在或不存在3x1D10v6-Fc的情况下用次优选的anti-CD3抗体刺激来自10个健康人类供体的富集T细胞。

基本上如实施例5中所述，从10个健康人类供体分离PBMC且富集T细胞群体。

T细胞刺激：将来自10个健康供体的富集T细胞解冻并使用CTL抗聚集培养基洗涤两次。在37℃用增殖性染料CellTrace Violet(CTV)(ThermoFisher)标记10分钟。洗涤之后，将T细胞在补充有10％FBS和1X抗生素/抗真菌剂的RPMI中再悬浮至每毫升1.5x10⁶个细胞，且在平底96孔板的每孔中以100μl添加150,000个T细胞。根据制造商说明，将M-450甲苯磺酰基活化的戴诺珠粒(Dynabead,ThermoFisher)用200μg的anti-CD3抗体(克隆OKT3，eBioscience)涂布并保持过夜。将经anti-CD3抗体涂布的珠粒以50μl/孔按1:2的比率添加至经标记的T细胞中以提供原代T细胞刺激。添加50μl的3x1D10v6-Fc，最终浓度为10nM。将板在37℃/5％CO₂培育3天并通过流式细胞术进行分析。

流式细胞术：3天后，将T细胞快速离心并在FACS缓冲液(PBS/2％FBS/0.05％叠氮化钠)中以存活率标记物碘化丙锭(PI)以及以下经荧光标记的抗体在室温标记20分钟：CD4-PE、CD8-APC、CD25-FITC和CD71-PE/Cy7(Biolegend)。将T细胞洗涤并再悬浮于70μl的FACS缓冲液中，并使用Sony SA3800光谱分析仪进行分析。使用Flowjo软件导通(gate on)活的(PI-)CD4和CD8群体且通过导通如经由CTV稀释测定经历最少一次分裂的T细胞来测定经历增殖的细胞的百分比。通过与未经刺激的T细胞群体比较来测定表达活化标记物CD25和CD71的CD4和CD8 T细胞的百分比。将数据输出至Microsoft Excel中并使用Prism进行绘图。

胞内细胞因子染色：将细胞快速离心并在室温在FACS缓冲液(2％FBS/0.1％叠氮化钠在PBS中)中用PE结合的抗CD4抗体和APC结合的抗CD8抗体以及Zombie Red存活率染料(BioLegend)进行表面标记达20分钟。洗涤后，将细胞用BD Fix/Perm缓冲液固定30分钟。将细胞用1X BD Perm/Wash缓冲液洗涤并在室温在Perm/Wash缓冲液中用PE/Cy7抗-IFNγ抗体标记45分钟。洗涤后，将细胞再悬浮于FACS缓冲液中并在Sony SA3800光谱分析仪上读取。使用Flowjo软件对CD4⁺和CD8⁺T细胞群体进行数据分析并使用Prism进行绘图。

在来自所测试的所有10个供体的T细胞中，3x1D10v6-Fc治疗导致对anti-CD3抗体刺激做出反应而经历增殖的CD4⁺和CD8⁺T细胞的百分比显著增加(图10，图11)。此外，表达活化标记物CD25和CD71的CD4和CD8 T细胞的百分比因3x1D10v6-Fc治疗而增加(图11)。在一独立实验中，在用3x1D10v6-Fc治疗后，在两个T细胞子集中，4个供体的较小子集均展示胞内IFNγ含量增加(图12)。因此，3x1D10v6-Fc对T细胞提供强效共刺激信号，导致活化、增殖和效应子功能增强。

实施例7：六价3x1D10v6-Fc逆转Treg介导非对CD4⁺T细胞增殖的抑制作用

T细胞富集：根据制造商说明，通过使用EasySep人类CD4⁺CD127^低CD25⁺调节性T细胞分离试剂盒(Stemcell)从新鲜的健康供体PBMC富集Treg和常规的CD4⁺T细胞。

T细胞抑制分析：为区别两种细胞群体，将富集的Treg和CD4⁺响应T细胞分别用增殖性染料CellTrace Violet(CTV)及CFSE在37℃标记10分钟。洗涤后，将Treg和CD4⁺T细胞在补充有10％FBS和1X抗生素/抗真菌剂的RPMI中再悬浮至1.5x10⁶个细胞/毫升。将Treg接种于50μl体积中，在圆底96孔板中产生75,000个Treg/孔。在10nM的anti-OX40六价3x1D10v6-Fc、10nM的常规(HC/LC)二价anti-OX40抗体存在下，或在不存在抗体的情况下，将Treg在37℃培育过夜。平行地，以1:2的珠粒与T细胞比率，将经标记的CD4⁺响应T细胞在37℃用anti-CD3涂布的戴诺珠粒活化过夜。次日，将Treg板用培养基洗涤2次以移除抗体。将经刺激的响应CD4⁺T细胞添加至100μl培养基中，以每2个CD4⁺响应T细胞1个Treg的比率向含有Treg的板传递150,000个CD4⁺T细胞/孔。将六价3x1D10v6-Fc或常规二价anti-OX40抗体以10nM的最终浓度添加回100μl的培养基中，一式两份添加至细胞子集中。另外，包括一组未与Treg共培育的CD4⁺响应T细胞。将板在37℃/5％CO₂培育3天并通过流式细胞术进行分析。

流式细胞术：3天后，将T细胞快速离心并在FACS缓冲液(PBS/2％FBS/0.05％叠氮化钠)中以存活率标记物碘化丙锭(PI)以及以下经荧光标记的抗体在室温标记20分钟：CD4-PE、CD25-APC及CD71-PE/Cy7(Biolegend)。将T细胞洗涤并再悬浮于70μl的FACS缓冲液中，并使用Sony SA3800光谱分析仪进行分析。使用Flowjo软件导通活的(PI^-)CFSE⁺响应CD4⁺或CTV⁺Treg群体，并通过导通如经由CFSE稀释测定经历最少一次分裂的响应T细胞来测定经历增殖的细胞的百分比。通过与未经刺激的T细胞群体比较来测定表达活化标记物CD25和CD71的响应CD4⁺T细胞的百分比。将数据输出至Microsoft Excel中并使用Prism进行绘图。

用anti-CD3涂布珠粒总计刺激4天导致66％的响应CD4⁺T细胞增殖(图13)。向培养物中添加富集的Treg导致响应CD4⁺T细胞增殖显著降低(34％增殖)。用10nM的六价3x1D10v6-Fc治疗导致响应CD4⁺T细胞增殖接近完全恢复(62％增殖)。此外，T细胞活化标记物CD25及CD71的表达恢复到与无Treg的CD4⁺T细胞响应物实验组类似的水平。相比之下，用常规二价anti-OX40抗体治疗相对于无抗体组而言无法恢复CD4⁺T细胞增殖或增加CD25或CD71的表达。

实施例8：六价3x1D10v6-Fc与帕博利珠单抗组合加强T细胞活化

TCR结合后，除阴性调节分子以外，将如OX40的共刺激分子上调，其通过抑制TCR信号传递来对抗T细胞活化。临床上已证明阻断一种此类路径(即，PD-1/PD-L1轴)通过缓解该抑制信号成功地恢复无响应肿瘤特异性T细胞的功能。OX40经由不同机制实现类似结果，增强T细胞反应：提供与TCR信号协同作用的外源性共刺激信号。这些不重叠但互补的机制表明OX40激动剂作用与检查点阻断作用组合将实现较大的临床益处。

同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)是用于证实T细胞的功能性调节的体外试验，其利用源自体外的不成熟树突状细胞(iDC)与HLA错配T细胞的混合物来诱发TCR依赖性T细胞活化。已证明六价3x1D10v6-Fc在该试验中具有适度活性。(数据未展示。)与anti-PD-1抗体帕博利珠单抗组合来测试六价3x1D10v6-Fc的活性，从而确定该组合是否展现增加的T细胞活化。

CD4+T细胞分离：基本上如下使用密度梯度离心从人类供体血液leukopak分离PBMC。将血液样品用PBS/2％FBS(1:2)稀释，并将30mL的稀释样品分层至15ml的Lymphoprep^TM密度梯度培养基上。在以800xg离心30分钟后，收集位于血浆与Lymphoprep^TM的界面处的PBMC层并将剩余的红细胞使用红细胞溶解缓冲液在室温溶解7分钟。随后如下文所述富集PBMC的单核细胞，并在低温保存的培养基中以100x10⁶个细胞/毫升冷冻并储存于液氮中。根据制造商说明，通过EasySep^TM人类CD4+T细胞分离试剂盒(Stemcell Technologies)从新鲜健康的供体PBMC富集CD4+T细胞。将PBMC以每毫升50x10⁶个细胞再悬浮于含有2％FBS和1mM EDTA的PBS中。使用CD4+T细胞分离混合物对CD4+T细胞进行负富集，然后在EasySep^TM磁体中用葡聚糖RapidSpheres^TM进行培育。在磁体上进行两轮富集后，对CD4+T细胞进行计数并用PBS/0.1％BSA(CTV缓冲液)洗涤。在37℃，在CTV缓冲液中以每毫升10x10⁶个细胞将细胞用CellTrace^TMViolet染料标记10分钟。将经标记的细胞用PBS/2％FBS洗涤一次，并将其以3.5x10⁶个细胞/毫升再悬浮于试验培养基(RPMI+10％FBS加青霉素、链霉素和两性霉素)中。

单核细胞富集和不成熟树突状细胞(iDC)的产生：根据制造商的方案(无CD16损耗的EasySep^TM人类单核细胞富集试剂盒；Stemcell Technologies)，使用无CD16损耗的负富集试剂盒由从leukopak供体分离的PBMC富集单核细胞。简而言之，以识别抗谱系标记物的四聚抗体复合物标记非单核细胞群体并使用磁性粒子耗尽。未结合的细胞上清液含有单核细胞。在补充有10％FBS加青霉素、链霉素和两性霉素、500U/mL GM-CSF和250U/mL IL-4的RPMI中以1x10⁶个细胞/毫升培养单核细胞。将细胞在PBS中洗涤并随后在中以3x10⁶个细胞/毫升冷冻保鲜。通过使用FSC/SSC尺寸排阻的流式细胞术和检测至少60％群体中的CD14-CD11c+HLA-DR+染色来证明遵循该方案的iDC表型诱导作用。

混合淋巴细胞反应(MLR)：将源自单核细胞的不成熟树突状细胞(iDC)以0.8x10⁶个细胞/毫升再悬浮于试验培养基中。将来自不同供体的1.75x10⁵个CD4+T细胞悬浮于50μL中，并在96孔U形板中与4x10⁴个iDC混合成50μL。

以10nM的初始分析浓度添加六价3x1D10v6-Fc，并在存在或不存在恒定分析浓度的10nM帕博利珠单抗的情况下在板上以1:4滴定，一式三份。在一个独立实验中，以50nM的初始分析浓度添加帕博利珠单抗，且在存在或不存在恒定试验浓度的1nM六价3x1D10v6-Fc的情况下在板上以1:4滴定，一式三份。基于在T细胞共刺激试验中展示最大活性的饱和抗体浓度，且对于帕博利珠单抗(10nM)而言，在PD1/PD-L1阻断试验中产生最大报告基因活性的饱和抗体浓度来选择六价3x1D10v6Fc(1nM)的固定浓度。将所有试验板在37℃培育7天。

人类IL-2ELISA：在第3天收集试验上清液的等分试样以根据制造商说明，使用人类IL-2ELISA MAX^TM Deluxe试剂盒(Biolegend)，通过ELISA来测定人类IL-2的浓度。将ELISA MaxiSorp板用人类IL-2捕捉抗体涂布过夜、洗涤、随后用稀释剂缓冲液阻断一小时。由1000pg/mL IL-2的初始浓度一式两份制备标准曲线，且将试验上清液样品以1:5或1:10稀释于稀释剂缓冲液中。将样品和标准物在ELISA板上培育两小时，继而洗涤并用检测抗体培育一小时。将试验板洗涤并以辣根过氧化酶(HRP)结合的抗生蛋白链菌素培育30分钟。在最终洗涤步骤后，在具有所提供底物溶液的ELISA板上检测捕捉的人类IL-2。10-30分钟后，用相等体积的1M HCl终止检测反应。在板阅读器(Molecular Devices)上读取450nm下的吸光度值，且由标准曲线计算人类IL-2在MLR试验上清液中的浓度。

如图14A-14B中所示，帕博利珠单抗与六价3x1D10v6-Fc的组合增强在混合淋巴细胞反应(MLR)中由CD4⁺T细胞产生IL-2。这些结果展示PD-1/PD-L1轴阻断与OX40激动剂作用组合的益处。

实施例9：评估六价3x1D10v6-Fc的药代动力学性质

治疗剂的药代动力学(PK)性质和毒理动力学分布对于理解剂量/暴露关系、清除率和安全分布而言至关重要。暴露衰减和/或清除分布加速可揭示由于非特异性相互作用、不良稳定性或免疫原性而在药剂本身中产生的不利因素；或如毒性或药物处置发生改变所证实在标靶中产生的不利因素。通常在啮齿动物和/或非人类灵长类动物中评估治疗性抗体的PK性质。这些模型中的不良PK可指示抗体的非特异性结合和快速清除。

经由静脉内注射以5mg/kg、20mg/kg和60mg/kg向食蟹猕猴(每组5只雄性和5只雌性)给予六价3x1D10v6Fc。基本上如下使用定量性ELISA方法来测定六价3x1D10v6-Fc的血清浓度。向微量滴定板孔预涂布重组形式的小鼠Fc域融合的人类OX40的胞外域(OX40-mFc)。阻断且洗涤后，将一滴度的六价3x1D10v6-Fc(用于标准曲线)、含有预定浓度六价3x1D10v6-Fc的对照样品和测试样品添加至孔中并培育以使得样品中所含的六价3x1D10v6Fc结合固定的OX40-mFc。洗涤板，并添加Fcγ片段特异性辣根过氧化酶(HRP)结合的抗人类IgG二级抗体来检测板结合的六价3x1D10v6Fc。向孔中添加含有HRP底物四甲基联苯胺(TMB)的溶液，其产生与同六价3x1D10v6-Fc结合的HRP缀合anti-人类IgG抗体的浓度成比例的比色信号。通过添加酸性溶液停止反应，并测定450nm下的吸光度。对于对照物和测试样品而言，通过与根据4-PL/逻辑模型回归的同时分析的校准曲线进行比对来进行将分光光度吸光度(通过光学密度[OD450]定量)的值转化为浓度。通过该方法，六价3x1D10v6Fc在血清中的定量的下限(LLOQ)为100ng/mL。

在剂量范围内，达到系统暴露(Cmax及AUC_0-168h)且与剂量成比例增加，而无性别差异。在5至60mg/kg的剂量范围内，使用非房室性分析，各组的平均T_1/2为55-89.7小时，清除率(CL)为0.683-0.832mL/h/kg，且稳态的分布体积(Vdss)为55.9-86.2mL/kg。六价3x1D10v6-Fc的PK分布展示于图15中。

这些结果证明，六价3x1D10v6-Fc具有良好的PK分布，适合于治疗性应用，且表明已缓解了用1D10v1观察到的非特异性结合。

在不背离本发明精神或基本特征的情况下，本发明可按其它特定形式实施。前述实施方案因此从各个方面均应视为说明性的，而非限制本发明。本发明的范围因此由所附权利要求范围而非由前述说明书来指示，且旨在将落入权利要求的等同物的含义和范围内的所有改变包括在内。

某些序列的列表

【序列表】

<110> 印希比股份有限公司(INHIBRX, INC.)

<120> 结合OX40的多肽及其用途

<130> 01202-0014-00PCT

<150> US 62/718,106

<151> 2018-08-13

<160> 34

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 1

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Thr Leu Ala Lys Ile

275

<210> 2

<211> 277

<212> PRT

<213> 食蟹猕猴

<400> 2

Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Lys Leu His Cys Val

20 25 30

Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln Glu Cys Arg Pro

35 40 45

Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys

50 55 60

Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ala Lys Pro

65 70 75 80

Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys

85 90 95

Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly

100 105 110

Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys

115 120 125

Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp

130 135 140

Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn

145 150 155 160

Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Pro Thr Gln Pro

165 170 175

Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr Val Gln Pro Thr

180 185 190

Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu

195 200 205

Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala

210 215 220

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Met Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu

225 230 235 240

Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala Pro Lys Ala Pro Gly Gly

245 250 255

Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser

260 265 270

Ala Leu Ala Lys Ile

275

<210> 3

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1

<400> 3

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro

115

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 CDR1

<400> 4

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 CDR2

<400> 5

Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 CDR3

<400> 6

Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp Phe

1 5

<210> 7

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1-Fc (二价)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

115 120 125

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

130 135 140

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

145 150 155 160

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

165 170 175

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

180 185 190

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

195 200 205

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

210 215 220

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

225 230 235 240

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

245 250 255

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

260 265 270

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

275 280 285

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

290 295 300

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

305 310 315 320

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

325 330 335

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210> 8

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3x1D10v1-Fc (六价；也称为六价-1D10v1)

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly

165 170 175

Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp

210 215 220

Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro

245 250 255

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

260 265 270

Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

275 280 285

Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu

290 295 300

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

305 310 315 320

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

325 330 335

Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Gly Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu

340 345 350

Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

355 360 365

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

370 375 380

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

385 390 395 400

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

405 410 415

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

420 425 430

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

435 440 445

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

450 455 460

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

465 470 475 480

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

485 490 495

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

500 505 510

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

515 520 525

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

530 535 540

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

545 550 555 560

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

565 570 575

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580 585

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6

<400> 9

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro

115

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 CDR1

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 CDR2

<400> 11

Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 CDR3

<400> 12

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe

1 5

<210> 13

<211> 346

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6-Fc (二价)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

115 120 125

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

130 135 140

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

145 150 155 160

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

165 170 175

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

180 185 190

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

195 200 205

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

210 215 220

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

225 230 235 240

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

245 250 255

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

260 265 270

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

275 280 285

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

290 295 300

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

305 310 315 320

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

325 330 335

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

340 345

<210> 14

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3x1D10v6

<400> 14

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly

165 170 175

Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp

210 215 220

Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro

245 250 255

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

260 265 270

Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

275 280 285

Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu

290 295 300

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

305 310 315 320

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

325 330 335

Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu

340 345 350

Val Thr Val Lys Pro

355

<210> 15

<211> 588

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3x1D10v6-Fc (六价；也称为六价-1D10v6)

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly

165 170 175

Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp

210 215 220

Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Ser Ser

225 230 235 240

Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro

245 250 255

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

260 265 270

Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

275 280 285

Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu

290 295 300

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

305 310 315 320

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

325 330 335

Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu

340 345 350

Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

355 360 365

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

370 375 380

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

385 390 395 400

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

405 410 415

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

420 425 430

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

435 440 445

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

450 455 460

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

465 470 475 480

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

485 490 495

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

500 505 510

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

515 520 525

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

530 535 540

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

545 550 555 560

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

565 570 575

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

580 585

<210> 16

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2x1D10v6-Fc (四价)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala

20 25 30

Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Lys Pro Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

130 135 140

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala Phe Met Tyr Trp Val Arg Gln

145 150 155 160

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Asn Arg Gly

165 170 175

Leu Lys Thr Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

180 185 190

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg

195 200 205

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asp Val Asp Ala Asp

210 215 220

Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 17

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 FR1

<400> 17

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 FR2

<400> 18

Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 19

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 FR3

<400> 19

Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 20

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v1 FR4

<400> 20

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro

1 5 10

<210> 21

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 FR1

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Glu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 FR2

<400> 22

Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val Ser

1 5 10 15

Ser

<210> 23

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 FR3

<400> 23

Ala Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1D10v6 FR4

<400> 24

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Lys Pro

1 5 10

<210> 25

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 25

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys

225

<210> 26

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列(Homo sapiens)

<400> 26

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser

1 5 10 15

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

20 25 30

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

35 40 45

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

50 55 60

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

65 70 75 80

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

100 105 110

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

115 120 125

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

145 150 155 160

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

165 170 175

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

195 200 205

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 27

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：CD3-ζ信号传递域

<400> 27

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 28

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：信号传递域源自CD28或4-1BB

<400> 28

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 29

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：信号传递域源自CD28或4-1BB

<400> 29

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 30

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：信号传递域源自CD28或4-1BB

<400> 30

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 31

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：信号传递域源自CD28或4-1BB

<400> 31

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

1 5 10 15

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

20 25 30

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 32

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：源自CD8的铰链或跨膜域

<400> 32

Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Ile

35 40 45

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

50 55 60

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

65 70

<210> 33

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：源自CD8的铰链或跨膜域

<400> 33

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

50 55 60

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：源自CD8的铰链或跨膜域

<400> 34

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

1 5