具体实施方式

本发明的目的在于提供一种增强机体免疫力的中药组合物，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：人参10重量份、丹参10重量份、蒲公英20重量份。

实施例2

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：人参5重量份、丹参5重量份、蒲公英10重量份。

实施例3

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：人参20量份、丹参20重量份、蒲公英30重量份。

实施例4

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：人参20重量份、蒲公英20重量份。

实施例5

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：丹参20重量份、蒲公英20重量份。

实施例6

一种增强机体免疫力的中药组合物，原料药包括：人参20重量份、丹参20重量份。

实验例

1.样品处理与给予方式

将实施例1~3及对照例1~3制备成的汤剂，常压，温度 80~90℃，时间 30~60min ，水量为受试样品体积的10倍以上，提取2次，将其合并浓缩至所需2倍浓度。

2.动物实验

（1）动物选择： 推荐用近交系小鼠， 20g±2g，单一性别，每组 10~15 只。

（2）剂量分组：实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10 倍为其中一个剂量组，另设两个剂量组。

（3） 样品给予时间：所有试验动物均食用全价营养配合饲料，动物自由摄食、摄水。给予受试物的灌胃体积为 20ml/（ kg·Bw ）。受试样品给予时间 30 天。

3.指标检测

ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验（ MTT 法）

1) 试剂配制

I：完全培养液：RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%Pen/Strep/Glutamine (100×，liquid)及5×10-5mol/L的β-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L 的NaOH调pH至7.0~7.2即完全培养液。

ii：ConA 液：用双蒸水配制成100μg/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（ -20℃）中保存。

iii：无菌 Hank’s液：用前以3.5%的无菌Na HCO₃调pH7.2~7.4。

Iv：MTT液：将5mg MTT 溶于1ml pH7.2 的 PBS 中，现配现用。

v ：酸性异丙醇溶液：96ml异丙醇中加入 4ml 1mol/L的HCl，临用前配制。

2) 脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s 液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4 层纱布将脾磨碎，用Hank’s 液洗2次，每次离心 10min（1000r/min ）。然后将细胞悬浮于1ml 完全培养液中，用台酚蓝染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为 3×10⁶ 个/ml。

3) 淋巴细胞增殖反应：将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加75μl ConA液（相当于7.5 μg/ml），另一孔作为对照，置 5% CO ₂，37℃ CO孵箱中培养 72h。培养结束前 4h，每孔轻轻吸去上清液 0.7ml，加入 0.7ml 不含小牛血清的 RPMI1640 培养液，同时加入 MTT（5mg/ml ）50μl/孔，继续培养 4h。培养结束后，每孔加入 1ml 酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到 96 孔培养板中，每个孔分装 3~6 孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以 570nm 波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入 2ml比色杯中，721型分光光度计上在波长 570nm 测定 OD 值。若对照组与对应的实施例相比，P＜0.05，则为阳性。

实施例1~3为阳性，实施例4~6为阴性。

抗体生成细胞检测（ Jerne 改良玻片法）

1) SRBC： 绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维，放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。

2) 制备补体：采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清，将1ml压积SRBC加入5ml 豚鼠血清中，4℃冰箱放置30min，经常振荡，离心取上清，分装， -70℃保存。用时以SA缓冲液按1∶8~15 稀释。

3) 玻片涂膜：在清洁玻片上刷上一薄层琼脂糖（ 0.5g 琼脂糖加双蒸水至100ml，加热溶解），待干后放片盒可长期保存备用。

4) 免疫动物：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞，每只鼠经腹腔或静脉注射 SRBC 5×10⁷~2×10⁸ 个。也可将压积 SRBC 用生理盐水配成2%（V/V ）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。

5) 脾细胞悬液制备：将 SRBC 免疫 4~5 天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛有Hank’s液的小平皿内，轻轻撕碎脾脏，制成细胞悬液，经 200 目筛网过滤，或用 4层纱布将脾磨碎，离心（1000r/min ）10min，用Hank’s 液洗 2 遍，最后将细胞悬浮在 5mlRPMI1640 培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10⁶ 个/ml。也可将细胞悬浮在8ml Hank’s液，测定脾空斑形成数。

6) 空斑的测定： 将表层培养基 （1g 琼脂糖加双蒸水至 100ml）加热溶解后， 放45℃水浴保温，与等量 pH7.2~7.4 的2倍浓度的 Hank’s 液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加 50μl10%SRBC（V/V ，用SA 液配制），20μl脾细胞悬液（5×106 个/ml）或25μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育 1~1.5h，然后用 SA 缓冲液稀释的补体（ 1∶8）加到玻片架凹槽内，继续温育 1~1.5h 后，计数溶血空斑数。若对照组与对应的实施例相比，P＜0.05，则为阳性。

实施例1~3为阳性，实施例4~6为阴性。

半数溶血值 (HC50) 的测定

原理：用 SRBC免疫动物后，产生抗 SRBC抗体 ( 溶血素 ) ，与 SRBC一起孵育，在补体参与下，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量；

仪器和材料： 721 分光光度计、离心机、恒温水浴、 SRBC、补体 ( 豚鼠血清 ) 、SA缓冲液、都式试剂( 碳酸氢钠 1.0g 、高铁氰化钾 0.2g 、氰化钾 0.05g ，加蒸馏水至1000mL)；

实验步骤：

1) SRBC绵羊颈静脉取血，将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中朝一个方向摇动，以脱纤维，放入 4℃冰箱保存备用，可保存 2 周。

2) 制备补体 : 采集豚鼠血，分离出血清 ( 至少 5 只豚鼠的混合血清 ) ，使用前将 1mL 压积 SRBC加入到 5mL豚鼠血清中，放 4℃冰箱 30min，经常振荡，离心取上清，分装小瓶，－70℃保存。用时以 SA液按 1∶10 稀释。

3) 免疫动物及血清分离：取羊血，用生理盐水洗涤 3 次，每次离心 (2000r/min)10min 。将压积SRBC用生理盐水配成 2%(v/v) 的细胞悬液，每只鼠腹腔注射 0.2mL 进行免疫。 4～5d 后，摘除眼球取血于离心管内，放置约 1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出， 2000r/min离心 10min，收集血清。

4) 溶血反应：取血清用 SA缓冲液稀释 (一般为 200～500 倍) 。将稀释后的血清 1mL置试管内，依次加入10%(v/v)SRBC 0.5mL ，补体 1mL(用SA液按1：10稀释 ) ，另设不加血清的对照管(以SA液代替 ) 。置 37℃恒温水浴中保温 15～30min 后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL，都氏试剂3mL于试管内，同时取10%(v/v)SRBC0.25mL 加都氏试剂至4mL，于另一支试管内，充分混匀，放置 10min 后，于540nm处以对照管作空白，分别测定光密度值。

5) 数据处理及结果判定：一般用方差分析进行数据统计， 溶血素的量以半数溶血值 (HC50) 表示，按下列公式计算，若对照组与对应的实施例相比，P＜0.05，则为阳性。

公式：

实施例1~3为阳性，实施例4~6为阴性。

小鼠碳廓清实验

1) 溶液配制

I：注射用墨汁： 将印度墨汁原液用生理盐水稀释 3~4 倍。

ii：Na2CO3 溶液取 0.1g Na2CO3，加蒸馏水至 100ml。

2) 注射墨汁： 称体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每 10g 体重0.1ml 计算。待墨汁注入，立即计时。

3) 测定： 注入墨汁后 2min（t1）、10min（t2），分别从内眦静脉丛取血 20μl，并立即将其加到 2ml 0.1% Na ₂CO₃溶液中。用721型分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD），以 Na ₂CO₃ 溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。

按下列公式计算:

吞噬指数：

k =(lgOD ₁-lgOD ₂)/(t2-t1)；OD ₁为t1血标本的OD值；OD ₂为t2血标本的OD值。若对照组与对应的实施例相比，P＜0.05，则为阳性。

实施例1~3为阳性，实施例4~6为阴性。

细胞活性测定（乳酸脱氢酶测定法）

1) 靶细胞的传代（ YAC-1 细胞）： 实验前 24h 将靶细胞进行传代培养。应用前以 Hank’s 液洗3 次，用RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为 4×105个/ml。

2) 脾细胞悬液的制备（效应细胞）：无菌取脾，置于盛有适量无菌 Hank’s 液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经 200 目筛网过滤，或用 4 层纱布将脾磨碎，或用Hank ’s 液洗2 次，每次离心 10min（1000r/min ）。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml 灭菌水20s，裂解红细胞后再加入 0.5ml 2 倍 Hank’s液及 8ml Hank ’s液，1000r/min ，10min 离心，用 1ml 含 10%小牛血清的 RPMI1640 完全培养液重悬，用 1%冰醋酸稀释后计数 （活细胞数应在 95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在 95% 以上），最后用 RPMI1640 完全培养液调整细胞浓度为 2×107 个/ml。

3) NK 细胞活性检测： 取靶细胞和效应细胞各 100μl（效靶比 50∶1），加入 U 型96 孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100μl，靶细胞最大释放孔加靶细胞和 1%NP40或 2.5% Triton 各 100μl；上述各项均设三个复孔，于 37℃、5%CO2 培养箱中培养 4h，然后将 96 孔培养板以 1500r/min 离心 5min，每孔吸取上清 100μl置平底96 孔培养板中， 同时加入 LDH 基质液 100μl，反应 3min，每孔加入 1mol/L 的 HCl 30μl，在酶标仪 490nm 处测定光密度值（ OD）。按下式计算 NK 细胞活性；若对照组与对应的实施例相比，P＜0.05，则为阳性。