一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法和应用 (Monodisperse beta-cyclodextrin functionalized polymer microsphere chiral stationary phase and preparation method and application thereof ) 是由 龚波林 王肖肖 于 2021-03-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法和应用,涉及色谱固定相技术领域。以单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质,在其表面引入3-氯丙基,与二乙基二硫代氨基甲酸钠反应,加入β-环糊精功能单体进行可逆加成断裂链转移聚合反应,形成单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相。该单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相制备过程简单、反应条件温和、反应可控,可用于高效液相色谱,高效快速地完成对映体的分离。(The invention provides a monodisperse beta-cyclodextrin functionalized polymer microsphere chiral stationary phase and a preparation method and application thereof, and relates to the technical field of chromatographic stationary phases. Taking monodisperse poly (glycidyl methacrylate) microspheres as a matrix, introducing 3-chloropropyl on the surface of the monodisperse poly (glycidyl methacrylate) microspheres, reacting with sodium diethyldithiocarbamate, adding a beta-cyclodextrin functional monomer to perform reversible addition fragmentation chain transfer polymerization reaction, and forming a monodisperse beta-cyclodextrin functional polymer microsphere chiral stationary phase. The monodisperse beta-cyclodextrin functionalized polymer microsphere chiral stationary phase has the advantages of simple preparation process, mild reaction conditions and controllable reaction, can be used for high performance liquid chromatography, and can efficiently and quickly complete the separation of enantiomers.)
技术领域
本发明涉及色谱固定相技术领域，具体涉及一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法和应用。
背景技术
由于对映体药物在生物活性、代谢机制和毒性等方面存在一定的差异，使得分离对映体变成了一项重要而且具有挑战性的工作。手性固定相(CSPs)法是分离对映体的一种有效的方法，是将手性选择剂固定到色谱固定相中，利用流动相中对映体与固定相中手性选择剂之间相互作用的差异来分离对映体。基于环糊精的手性固定相是一种广泛使用的手性固定相，因为环糊精独特的中空结构可以与对映体客体分子形成包合物，而形成的包合物强度的差异使得这种环糊精功能化的固定相可以用于对映体的分离。
目前，环糊精手性固定相的制备主要通过物理涂覆和化学键合的方式。物理涂覆法是利用基质的吸附性能将环糊精衍生物固定在基质表面，环糊精衍生物一般具有较好的水溶性，在反相色谱条件下容易流失，因此物理涂覆法制备的环糊精手性固定相比较适合于正相色谱条件下分离对映体。化学键合法是利用化学键将环糊精衍生物通过间隔臂以化学键键合在基质表面上。这种方式得到的固定相比较稳定，流动相适用范围较广，因而研究比较广泛。最早是引入含氮的连接集团如胺、酰胺以及氨基甲酸酯作为间隔臂将环糊精衍生物键合到二氧化硅微球表面。然而，这类手性固定相中由于氮原子的存在导致间隔臂不稳定，易于水解，而且繁琐的合成路径以及环糊精低负载量使得含氮连接剂的环糊精手性固定相在含水流动相中具有很强的局限性。为了提高固定相的稳定性，研究者们采用不容易水解的醚键连接基团制备手性固定相。目前，大多数商品化的环糊精固定相也是通过这些醚键连接基团来制备的。然而，这类手性柱仅适用于反相模式下拆分对映体，因而在应用范围上受到一些限制。
近年来，由于自由基聚合反应条件温和，对单体和溶剂不需要进行严格纯化，可以得到大分子量的聚合物而被广泛应用。研究者们通过自由基聚合方式将环糊精衍生物接枝到功能化的二氧化硅微球上制备了一系列环糊精手性固定相。这些固定相对药物、除草剂以及在正向模式下对含羧酸的化合物有很好的拆分效果，而且这些固定相在许多溶剂中都比氨基甲酸酯为连接剂的固定相更稳定。然而，通过经典的自由基聚合反应合成这些环糊精手性固定相过程中，其固有的慢引发、易终止的基元反应决定了得到的固定相相对分子质量及其分布、组成结构等不可控。因此为了提高反应活性得到特定结构的手性固定相，将可控/活性自由基聚合技术引入到手性固定相的制备中。Wang等先通过原子转移自由基(ATRP)聚合反应在二氧化硅微球上聚合了甲基丙烯酸缩水甘油酯，得到了“梳形”环糊精手性固定相。ATRP方法提高了反应活性，但是一些含羧基、羟基、酰胺基或卤素的烯类单体难以用ATRP方法直接聚合，一般要采取保护基团的方法使得制备过程复杂化，另外ATRP方法一般要用过渡金属化合物作为催化剂，在聚合物中很难去除,这些都限制了ATRP方法在手性固定相合成中的应用。因而，仍然有必要探讨合成β-环糊精手性固定相的有效合成方法。
最近，由于可逆加成断裂链转移聚合(RAFT)方法具有活性可控，适用单体范围广以及反应条件温和的特点而备受关注。RAFT聚合避免了原子转移自由基聚合法中过渡金属催化剂、有机配体等难以从聚合产物中除去的缺点，并且解决了带有烯类官能团单体的聚合局限性。采用RAFT方法制备手性固定相可以引入高密度的功能基团和适当的间隔臂，而且可以确保聚合物杂化材料处于单分散状态。因此，利用聚合物微球具有高比表面的特性，在单分散的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面采用可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合方式制备环糊精手性固定相可能成为合成手性固定相的有效方法。
发明内容
：本发明的目的在于提供一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法和应用，其可用作高效液相色谱的固定相高效快速地完成对映体的分离。
本发明一方面提供了一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相，以单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球为基质，在其表面引入3-氯丙基，与二乙基二硫代氨基甲酸钠反应，加入β-环糊精功能单体进行可逆加成断裂链转移聚合反应，形成单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相(β-CD-CSP)，其结构式如图1所示；
所述的β-环糊精功能单体为(甲基丙烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精。
优选地，所述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相粒径为6.5μm，孔径为18nm，比表面积为180.6m2/g。
本发明另一方面提供了一种上述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备方法，步骤如下(制备方法示意图如图2所示)：
(1)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液的制备：取5-10mL甲基丙烯酸环氧丙酯、0.1-0.2g偶氮二异丁腈和1.0-2.0g聚乙烯吡咯烷酮超声分散在60-90mL的无水乙醇中，在氮气保护下，升温至50-70℃聚合反应16-36h，产物用无水乙醇充分洗涤、离心，加入30-60mL十二烷基硫酸钠溶液，静置，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液；
(2)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：分别取2-6mL甲基丙烯酸环氧丙酯、2-6mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、2-6mL甲苯、2-6mL环己醇和0.2-0.36g偶氮二异丁腈超声分散均匀，加入20-35mL 5％(w/v)聚乙烯醇、45-75mL 0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠和25-45mL蒸馏水混合均匀，置于细胞破碎仪中30-60min，直至溶液呈乳浊状，加入5-9mL步骤(1)得到的聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液，25-35℃溶胀反应16-48h，在氮气保护下，再升温至50-70℃反应18-36h，反应结束后用无水乙醇、蒸馏水洗涤，将所得产物在四氢呋喃中索氏提取48-60h，用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球(PGMA/EDMA)；
(3)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面修饰二硫键：取步骤(2)得到的单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球2.0-6.0g分散在100-300mL0.1mol·L-1的H2SO4溶液中，40-80℃反应6-20h，得到水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取2.0-5.0g水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声下分散在80-150mL的无水甲苯中，逐滴滴加4-10mL 3-氯丙基三甲氧基硅烷，在氮气保护下，120℃油浴中回流24-48h，产物用无水乙醇洗涤，真空干燥，得到氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取1.0-3.0g二乙基二硫代氨基甲酸钠超声分散在50-120mL无水四氢呋喃中，加入1.0-4.0g氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，在氮气保护下，40-80℃反应12-48h，产物用四氢呋喃和甲醇依次洗涤；
(4)β-环糊精功能单体的制备：取1.0-3.0g干燥的β-环糊精溶于50-100mL干燥的吡啶中，滴加干燥四氢呋喃3-9mL，搅拌，加入3-15mL异氰酸苯酯，80-120℃油浴中反应10-24h，反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，将其倒入250mL水中，析出固体，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到土黄色的β-环糊精功能单体；
(5)单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备：取步骤(3)得到的二硫键修饰的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.0-3.0g，加入40-120mL干燥四氢呋喃，超声分散，再加入0.2-2.5g步骤(4)得到的β-环糊精功能单体，10-30mg偶氮二异丁腈，超声分散，在氮气保护下，50-70℃油浴反应12-36h，依次用四氢呋喃、甲醇洗涤，真空干燥，得到单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相；
步骤(4)中所述的干燥四氢呋喃中含有甲基丙烯酰氯0.170-0.85mL。
优选地，步骤(1)中所述的静置的时间为10-24h；步骤(2)中所述的真空干燥的条件是的30-60℃真空干燥箱中干燥12-24h；步骤(3)中所述的真空干燥的条件是40-80℃真空干燥箱中干燥6-24h；步骤(4)中所述的搅拌是在20-60℃下搅拌10-20h；步骤(5)中所述的真空干燥的条件是50℃真空干燥箱中干燥24h。
优选地，所述的步骤(5)中超声分散的时间为10-40min。
上述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液的制备：取5-10mL甲基丙烯酸环氧丙酯、0.1-0.2g偶氮二异丁腈和1.0-2.0g聚乙烯吡咯烷酮超声分散在60-90mL的无水乙醇中，置于旋转蒸发仪上，在氮气保护下，升温至50-70℃聚合反应16-36h，产物用无水乙醇充分洗涤、离心，加入30-60mL十二烷基硫酸钠溶液置于冰箱静置、沉淀10-24h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液；
(2)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：分别取2-6mL甲基丙烯酸环氧丙酯、2-6mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、2-6mL甲苯、2-6mL环己醇和0.2-0.36g偶氮二异丁腈超声分散均匀，加入20-35mL 5％(w/v)聚乙烯醇、45-75mL 0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠和25-45mL蒸馏水混合均匀，放入细胞破碎仪中工作30-60min，直至溶液呈乳浊状，再加入5-9mL聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液，在25-35℃溶胀反应16-48h，在氮气保护下，再升温至50-70℃反应18-36h，反应结束后用无水乙醇、蒸馏水洗涤，将所得产物在四氢呋喃中索氏提取48-60h，用无水乙醇洗涤，置于30-60℃真空干燥箱中干燥12-24h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；
(3)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面修饰二硫键：取步骤(2)得到的单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球2.0-6.0g分散在100-300mL0.1mol·L-1的H2SO4溶液中，40-80℃反应6-20h，得到水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取2.0-5.0g水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声下分散在80-150mL的无水甲苯中，逐滴滴加4-10mL 3-氯丙基三甲氧基硅烷(NQ-54)，在氮气保护下，120℃油浴中回流24-48h，产物用无水乙醇洗涤，置于40-80℃的真空干燥箱中干燥6-24h，得到氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取1.0-3.0g二乙基二硫代氨基甲酸钠超声分散在50-120mL无水四氢呋喃中，加入1.0-4.0g氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，在氮气保护下，40-80℃反应12-48h，产物用四氢呋喃和甲醇依次洗涤；
(4)β-环糊精功能单体的制备：取1.0-3.0g干燥的β-环糊精溶于50-100mL干燥的吡啶中，滴加干燥四氢呋喃3-9mL(内含甲基丙烯酰氯0.170-0.85mL)，在20-60℃下搅拌10-20h，加入3-15mL异氰酸苯酯，80-120℃油浴中反应10-24h，反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，将其倒入盛有250mL水的烧杯中，有大量的固体析出，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到土黄色的β-环糊精功能单体；
(5)单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备：取步骤(3)得到的二硫键修饰的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.0-3.0g，加入40-120mL干燥四氢呋喃，超声分散10-40min，再加入0.2-2.5g步骤(4)得到的β-环糊精功能单体，10-30mg偶氮二异丁腈，超声分散10-40min，在氮气保护下，50-70℃油浴反应12-36h，依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得到单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相。
本发明另一方面还提供了一种上述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的应用，所述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相可用于对映体的手性分离。
具体地，上述的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相2-4g，并向其中加入20-40mL甲醇，超声分散20-60min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为15-30MPa。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相及其制备方法，该手性固定相的制备方法简单，反应条件温和，反应效率高，有利于环糊精功能化聚合物微球的快速、高效合成。
(2)本发明提供的一种单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相可用作高效液相色谱的固定相，能够高效快速地完成对映体的分离。本发明中甲基丙烯酰化的β-环糊精中的烷烃链提供了合适的间隔臂长度，一方面使得聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面接枝的功能单体密度高，另一方面可以让对映体分子容易地进入到功能化的环糊精分子中，有利于实现手性拆分。另外，环糊精边缘上的苯基氨基甲酸酯拓展了环糊精固定相的空腔，这在反相模式下有利于与各种类型的对映体化合物形成包合复合物，在正相模式下有利于提高与对映体之间的π-π作用，偶极-偶极相互作用，氢键以及疏水相互作用。
附图说明
图1为β-CD-CSP的结构示意图。
图2为单分散磁性手性固定相的制备示意图。
图3为材料的红外光谱图：(A)水解PGMA/EDMA，(B)氯丙基功能化的PGMA/EDMA，(C)二硫键修饰的PGMA/EDMA，(D)β-CD-CSP。
图4为扫描电镜图，(A)为PGMA/EDMA，(B)为β-CD-CSP。
图5为对映体化合物(A)(+/-)-1-苯基-1-丙醇，(B)(+/-)-2-苯丙酸，(C)(+/-)-氧化苯乙烯和(D)布洛芬的结构式。
图6为反相色谱条件下(A)(+/-)-1-苯基-1-丙醇，(B)(+/-)-2-苯丙酸，(C)(+/-)-氧化苯乙烯和(D)布洛芬分离的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与效果易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
单分散磁性手性固定相的制备方法，具体步骤如下：
单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液的制备：取5mL甲基丙烯酸环氧丙酯、0.1g偶氮二异丁腈和1.0g聚乙烯吡咯烷酮超声分散在60mL的无水乙醇中，置于旋转蒸发仪上，在氮气保护下，升温至50℃聚合反应16h，产物用无水乙醇充分洗涤、离心，加入30mL十二烷基硫酸钠溶液置于冰箱静置、沉淀10h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液；
(2)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：分别取2mL甲基丙烯酸环氧丙酯、2mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、2mL甲苯、2mL环己醇和0.2g偶氮二异丁腈超声分散均匀，加入20mL 5％(w/v)聚乙烯醇、45mL 0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠和25mL蒸馏水混合均匀，放入细胞破碎仪中工作30min，直至溶液呈乳浊状，再加入5mL聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液，在25℃溶胀反应16h，在氮气保护下，再升温至70℃反应18h，反应结束后用无水乙醇、蒸馏水洗涤，将所得产物在四氢呋喃中索氏提取48h，用无水乙醇洗涤，置于30℃真空干燥箱中干燥24h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；
(3)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面修饰二硫键：取步骤(2)得到的单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球2.0g分散在100mL0.1mol·L-1的H2SO4溶液中，40℃反应6h，得到水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取2.0g水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声下分散在80mL的无水甲苯中，逐滴滴加4mL 3-氯丙基三甲氧基硅烷，在氮气保护下，120℃油浴中回流24h，产物用无水乙醇洗涤，置于40℃真空干燥箱中干燥48h，得到氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取1.0g二乙基二硫代氨基甲酸钠超声分散在50mL无水四氢呋喃中，加入1.0g氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，在氮气保护下，40℃反应12h，产物用四氢呋喃和甲醇依次洗涤；
(4)β-环糊精功能单体的制备：取1.0g干燥的β-环糊精溶于50mL干燥的吡啶中，滴加干燥四氢呋喃3mL(内含甲基丙烯酰氯0.170mL)，在20℃下搅拌10h，加入3mL异氰酸苯酯，80℃油浴中反应10h，反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，将其倒入盛有250mL水的烧杯中，有大量的固体析出，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到土黄色的(甲基丙烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精，即β-环糊精功能单体；
(5)单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备：取步骤(3)得到的二硫键修饰的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.0g，加入40mL干燥四氢呋喃，超声分散，再加入0.2g步骤(4)得到的β-环糊精功能单体，10mg偶氮二异丁腈，超声分散均匀，在氮气保护下，50℃油浴反应12h，依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得到单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相(β-CD-CSP)。
单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取β-CD-CSP 2g，并向其中加入20mL甲醇，超声分散20min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为15MPa。
实施例2
单分散磁性手性固定相的制备方法，具体步骤如下：
单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备方法，具体步骤如下：
(1)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液的制备：取8mL甲基丙烯酸环氧丙酯、0.15g偶氮二异丁腈和1.5g聚乙烯吡咯烷酮超声分散在75mL的无水乙醇中，置于旋转蒸发仪上，在氮气保护下，升温至60℃聚合反应24h，产物用无水乙醇充分洗涤、离心，加入45mL十二烷基硫酸钠溶液置于冰箱静置、沉淀18h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液；
(2)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：分别取4mL甲基丙烯酸环氧丙酯、4mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、4mL甲苯、4mL环己醇和0.28g偶氮二异丁腈超声分散均匀，加入30mL 5％(w/v)聚乙烯醇、60mL 0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠和35mL蒸馏水混合均匀，放入细胞破碎仪中工作45min，直至溶液呈乳浊状，再加入7.5mL聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液，在30℃溶胀反应24h，在氮气保护下，再升温至60℃反应24h，反应结束后用无水乙醇、蒸馏水洗涤，将所得产物在四氢呋喃中索氏提取55h，用无水乙醇洗涤，置于50℃真空干燥箱中干燥20h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；
(3)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面修饰二硫键：取步骤(2)得到的单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球4.0g分散在200mL0.1mol·L-1的H2SO4溶液中，60℃反应12h，得到水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取3.5g水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声下分散在120mL的无水甲苯中，逐滴滴加7mL3-氯丙基三甲氧基硅烷，在氮气保护下，120℃油浴中回流45h，产物用无水乙醇洗涤，置于60℃真空干燥箱中干燥12h，得到氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取2.0g二乙基二硫代氨基甲酸钠超声分散在90mL无水四氢呋喃中，加入2.5g氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，在氮气保护下，60℃反应24h，产物用四氢呋喃和甲醇依次洗涤；
(4)β-环糊精功能单体的制备：取2.0g干燥的β-环糊精溶于80mL干燥的吡啶中，滴加干燥四氢呋喃6mL(内含甲基丙烯酰氯0.520mL)，在40℃下搅拌15h，加入9mL异氰酸苯酯，100℃油浴中反应18h，反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，将其倒入盛有250mL水的烧杯中，有大量的固体析出，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到土黄色的(甲基丙烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精，即β-环糊精功能单体；
(5)单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备：取步骤(3)得到的二硫键修饰的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球2.0g，加入80mL干燥四氢呋喃，超声分散20min，再加入1.5g步骤(4)得到的β-环糊精功能单体，20mg偶氮二异丁腈，超声分散20min，分散均匀，在氮气保护下，60℃油浴反应24h，依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得到单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相(β-CD-CSP)。
单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取β-CD-CSP 2.5g，并向其中加入30mL甲醇，超声分散40min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为25MPa。
实施例3
(1)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液的制备：取10mL甲基丙烯酸环氧丙酯、0.2g偶氮二异丁腈和2.0g聚乙烯吡咯烷酮超声分散在90mL的无水乙醇中，置于旋转蒸发仪上，在氮气保护下，升温至70℃聚合反应36h，产物用无水乙醇充分洗涤、离心，加入十二烷基硫酸钠溶液置于冰箱静置、沉淀24h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液；
(2)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备：分别取6mL甲基丙烯酸环氧丙酯、6mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、6mL甲苯、6mL环己醇和0.36g偶氮二异丁腈超声分散均匀，加入35mL5％(w/v)聚乙烯醇、75mL0.2％(w/v)十二烷基硫酸钠和45mL蒸馏水混合均匀，放入细胞破碎仪中工作60min，直至溶液呈乳浊状，再加入9mL聚甲基丙烯酸环氧丙酯的种子液，在35℃溶胀反应48h，在氮气保护下，再升温至50℃反应36h，反应结束后用无水乙醇、蒸馏水洗涤，将所得产物在四氢呋喃中索氏提取60h，用无水乙醇洗涤，置于60℃真空干燥箱中干燥12h，得到单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球；
(3)单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面修饰二硫键：取步骤(2)得到的单分散聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球6.0g分散在300mL0.1mol·L-1的H2SO4溶液中，80℃反应20h，得到水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取5.0g水解聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球超声下分散在150mL的无水甲苯中，逐滴滴加10mL3-氯丙基三甲氧基硅烷，在氮气保护下，120℃油浴中回流48h，产物用无水乙醇洗涤，置于80℃的真空干燥箱中干燥24h，得到氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，取3.0g二乙基二硫代氨基甲酸钠超声分散在120mL无水四氢呋喃中，加入4.0g氯丙基功能化聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球，在氮气保护下，80℃反应48h，产物用四氢呋喃和甲醇依次洗涤；
(4)β-环糊精功能单体的制备：取3.0g干燥的β-环糊精溶于100mL干燥的吡啶中，滴加干燥四氢呋喃9mL(内含甲基丙烯酰氯0.850mL)，在60℃下搅拌20h，加入15mL异氰酸苯酯，120℃油浴中反应24h，反应结束后，在减压的条件下除去反应液中的吡啶和未反应的异氰酸苯酯，残余物用乙醇溶解，将其倒入盛有250mL水的烧杯中，有大量的固体析出，过滤，滤饼用乙醇重结晶，得到土黄色的(甲基丙烯酰基)全苯基氨基甲酰基β-环糊精，即β-环糊精功能单体；
(5)单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的制备：取步骤(3)得到的二硫键修饰的聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球3.0g，加入120mL干燥四氢呋喃，超声分散40min，再加入2.5g步骤(4)得到的β-环糊精功能单体，30mg偶氮二异丁腈，超声分散40min，在氮气保护下，70℃油浴反应36h，依次用四氢呋喃、甲醇洗涤后，置于50℃的真空干燥箱中干燥24h，得到单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相(β-CD-CSP)。
单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相在高效液相色谱柱中的填装方法如下：
取β-CD-CSP 4g，并向其中加入40mL甲醇，超声分散60min，所得手性固定相匀浆装入匀浆罐中，在甲醇做顶替液的情况下，通过气动泵压入高效液相色谱柱管中，色谱柱的规格为150×4.6mm(I.D.)，填充压力为30MPa。
实施例4
以实施例2制备得到的β-CD-CSP为例进行单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相的检测：
2.1利用红外光谱检测，结果如图3所示：在1490-1372cm-1处均出现了-COO-的对称和非对称伸缩振动吸收峰，说明水解PGMA/EDMA(图3(A))，氯丙基功能化的PGMA/EDMA(图3(B))，二硫键修饰的PGMA/EDMA(图3(C))和β-CD-CSP(图3(D))具有相同的核(PGMA/EDMA)。曲线A中3525cm-1处宽的吸收峰为PGMA/EDMA水解后-OH的伸缩振动峰。相比氯丙基功能化的PGMA/EDMA，在2958cm-1附近出现-CH3和-CH2内部C-H键的吸收峰，在1062cm-1处出现Si-O的伸缩振动峰，以及在653cm-1处C-Cl键的吸收峰增强，同时3525cm-1处-OH吸收峰减弱，这些结果说明氯丙基成功地接枝在PGMA/EDMA的表面。曲线C，可以看到C-S和C＝S分别在619cm-1和1060cm-1处出现新的吸收峰，说明二硫键接枝成功。在β-CD-CSP的FT-IR谱中，新出现的1648cm-1属于C＝O的振动吸收峰，这个特征峰的出现说明功能化β-环糊精单体成功接枝到聚合物微球表面。
2.2利用透射电镜观察β-CD-CSP，结果如图4所示：聚甲基丙烯酸环氧丙酯(PGMA/EDMA)微球(图4(A))呈单分散性、表面多孔且分布均匀，粒径约为5.0μm。β-CD-CSP(图4(B))的平均直径约为6.5μm。与PGMA/EDMA微球相比，β-CD-CSP的表面多孔结构更加均匀，表面孔径减小，颗粒尺寸明显增大，说明功能化β-环糊精单体成功接枝到PGMA/EDMA微球表面。
2.3流动相和样品的制备：用三乙胺醋酸盐缓冲液(三乙胺和水的体积比为1:1000)调节流动相pH，乙腈、缓冲液流动相在使用前用超声仪超声30min，样品是用甲醇将其配成3mg/mL的溶液，所用样品分别为(A)(+/-)-1-苯基-1-丙醇，(B)(+/-)-2-苯丙酸，(C)(+/-)-氧化苯乙烯和(D)布洛芬，结构式如图5所示。
反相色谱条件：流动相：(A)乙腈/0.1％乙酸(35:65,v/v)；(B)乙腈/0.1％乙酸(77:23,v/v)；(C)乙腈/20mmol醋酸铵缓冲溶液(pH＝3.119)(95:5,v/v)；(D)乙腈/20mmol醋酸铵缓冲溶液(pH＝3.106)(97:3,v/v)；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；紫外检测波长：254nm。
反相色谱条件下对映体分离的色谱图如图6所示，分离结果如表1所示。其中，保留因子(k)由公式k＝(tR–t0)/t0计算，其中tR代表样品保留时间，t0代表死时间。分离因子(α)是由k2/k1计算，而分离度(Rs)由公式Rs＝2(tR2–tR1)/(W1+W2)计算,其中tR2和tR1分别代表第二个光学纯异构体和第一个光学纯异构体的保留时间，W1和W2分别代表色谱峰的峰底宽度。
表1：反相条件下对映体的分离结果：
表1:反相条件下对映体的分离结果
由图6和表1结果可知，4种对映体化合物在本发明实施例2制备的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相上的分离效果好，速度快；另外，利用本发明其他实施例制备的单分散β-环糊精功能化聚合物微球手性固定相分离4种对映体化合物，同样分离效果好，速度快。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化。