一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法
阅读说明：本技术 一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法 (Method for preparing hydrocortisone by multiple rounds of fermentation of resting cells ) 是由 徐明琴 付林 冯蕾 廖俊 田玉林 曾建华 于 2020-12-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。本方法以蓝色犁头霉为生产菌种,经种子扩大培养后,在发酵液中投入底物RSA,转化生成氢化可的松；转化结束后离心收集菌丝体,再以水为发酵介质投料底物RSA进行发酵转化,以此类推进行多轮静息细胞转化。特别说明的是在静息细胞多轮转化工艺中,转化介质-水只需做简单的煮沸处理,不需要像培养基灭菌那样高温高压,也不需要做任何PH等方面的调整,既节省了菌种培养步骤,又节约了培养基的制备灭菌所需的物料和动力,并且提高了氢化可的松的转化率和比生产率。(The invention discloses a method for preparing hydrocortisone by multiple rounds of fermentation of resting cells. The method comprises the steps of taking Absidia coerulea as a production strain, after seed amplification culture, adding a substrate RSA into fermentation liquor, and converting to generate hydrocortisone; and after the conversion is finished, centrifugally collecting mycelia, feeding a substrate RSA (rivest-Adleman) by taking water as a fermentation medium for fermentation conversion, and performing multiple rounds of resting cell conversion by analogy. Particularly, in the multiple rounds of transformation process of resting cells, the transformation medium-water only needs to be subjected to simple boiling treatment, does not need high temperature and high pressure like culture medium sterilization, does not need any adjustment in aspects such as pH and the like, saves the strain culture step, saves materials and power required by preparation and sterilization of the culture medium, and improves the transformation rate and specific productivity of hydrocortisone.)
技术领域
本发明属于微生物甾体制药及医药工程领域，具体涉及一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。
背景技术
甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。氢化可的松(Hydrocortisone，简写HC)又称皮质醇，化学名称为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，属肾上腺皮质激素类药，是目前激素类药物中产量最大的品种，具有抗炎、抗过敏等作用，临床上主要应用于替代治疗肾上腺皮质功能减退症。同时因为它对糖代谢有一定影响，也被用于葡萄糖、血糖过多症等疾病的治疗，在生产中还可作为许多甾体皮质激素药物的前体。自60年代微生物法合成糖皮质激素并进入商业化以来，微生物转化已经成为诸多甾体药物或药物中间体合成路线中的关键技术，而氢化可的松的生产是利用微生物的11β-羟基化作用。对于合成甾体糖皮质激素来说，11β-OH是抗炎药物所必需的基团，现有的高级皮质激素药物都具有C11β-羟基。由于甾体C10位、C13位的甲基容易造成C11β-羟基的立体位阻比C11α-羟基大，并致使C11β-羟基化比C11α-羟基化效率低、副产物多，在一定程度上制约着它的大规模应用。为提高产物的转化率，不少科研工作者进行了大量研究，包括第一个阶段诱变育种或发酵工艺的改进，第二个阶段底物转化。
目前国内微生物转化生产HC的11β-羟基化菌种主要是蓝色犁头霉菌，该菌以化合物RSA(化学名为17α-羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯)为底物，经脱乙酰化(水解)生成RS(化学名为17α，21-二羟基-孕甾-4-烯-3,20-二酮)，RS再被C11β-羟化酶系催化生成HC，其反应式如下：
但由于蓝色犁头霉11β-羟化酶的专一性较差，副产物多，且投料浓度较低，HC的收率受到限制。所以有必要对发酵工艺进行开发优化，提高产品的产量质量，并降低人力，物力，动力以及原材料的使用，达到降低成本、提高收益的目的，这对氢化可的松的工业化生产有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和缺点，本发明提供了一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法。本发明将原工艺发酵转化结束的菌丝体分离收集，再投入到介质水中，以水为转化介质再次投料底物RSA进行发酵转化，以此步骤类推进行多轮静息细胞转化。本发明操作简单，成本低廉，同时提高产量。
本发明菌丝体多轮转化工艺与原工艺路线对比：
原工艺：斜面菌种制备—发酵菌种培养—底物投料转化—发酵液分离提取(菌丝体废弃)
本发明工艺：斜面菌种制备→发酵菌种培养→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体加等体积水(n次利用)→底物投料转化→发酵液分离提取→菌丝体酶耗尽，发酵结束。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法，包括如下步骤：
(1)在蓝色犁头霉发酵菌液中投入RSA进行发酵转化；
(2)步骤(1)发酵转化结束后分离菌丝体，将分离得到的菌丝体加入到水中，再次加入RSA进行静息细胞转化；
(3)重复步骤(2)的步骤，进行静息细胞的多轮转化，直至菌丝体生物酶耗尽，发酵结束。
优选的，步骤(1)所述蓝色犁头霉发酵菌液由以下方法制备得到：首先将蓝色犁头霉接种于斜面进行斜面菌种培养，然后将培养得到的菌种接入到液体培养基中培养，液体培养至pH＝3.8-4.4时，培养到达终点，得到所述蓝色犁头霉发酵菌液。
优选的，所述斜面菌种培养的方式为：培养基为PDA培养基，培养温度为25-29℃，培养周期为7～9天，此时孢子成熟。
优选的，所述液体培养基中培养的温度为25～29℃，转速为160-200rpm。
优选的，所述液体培养基的组成为：葡萄糖1.0～1.2％、玉米浆1.0～1.5％酵母膏0.3～0.5％、硫酸铵0.4～0.6％，其余为水；PH＝6.1-6.5。
优选的，步骤(1)所述RSA的投加量为2.5-2.8g/L。
优选的，步骤(1)所述发酵转化的方式为：在25-29℃，160-200rpm条件下，转化30-33h。
优选的，步骤(2)所述水的用量与步骤(1)所述蓝色犁头霉发酵菌液的体积比为0.75：1～1.1：1，更优选的为1：1。
优选的，步骤(2)所述RSA的加入量为1.5-2.5g/L。
优选的，步骤(2)所述静息细胞转化的方式为：在25-29℃，160-200rpm条件下，转化18-24h。
优选的，步骤(3)所述多轮转化为2～10轮转化。
优选的，步骤(1)和步骤(2)RSA的投料方式为：经助溶剂乙醇回流溶解投入。
优选的，步骤(2)所述水在使用之前经过了灭菌处理。
优选的，所述水的灭菌处理为100℃煮沸灭菌。
本发明以蓝色犁头霉为生产菌种，经种子扩大培养，原工艺的首轮转化，然后收集原工艺中将废弃的菌丝体，再以水为发酵介质进行多轮静息细胞发酵转化。特别说明的是在静息细胞多轮转化工艺中，转化介质-水只需做简单的煮沸处理，不需要像培养基灭菌那样高温高压，并且不需要做任何PH等方面的调整。由于以水为发酵介质，使得菌体细胞处于“饥饿”状态，不会出现染菌现象。这样既节省了菌种培养步骤，又节约了培养基的制备灭菌所需的物料和动力，同时提高了氢化可的松的转化率和比生产率，提高了产品的产量。在静息细胞转化中，由于无外源性营养物质的存在，有利于后续产品的提取精制。在静息细胞多轮转化中，主要副产物-表氢化可的松所占比例等同于原工艺中的发酵液转化比例，并没有因为菌丝体生物酶的重复利用而导致副产物增加。该发明所涉及的生产方法是对氢化可的松发酵菌丝体(即生物酶)进行多次重复利用，操作简单，节约成本、缩短周期，提高产量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明所提供的一种氢化可的松的菌丝体静息细胞多轮发酵转化工艺，其优点在于：静息细胞多轮转化工艺中减少了培养基的配置、灭菌、PH调整及菌种培养等多个环节，大大简化了工艺操作，节约物料动力，降低生产成本；静息细胞转化工艺是以水为转化介质，减少了营养物质的存在，故不必考虑染菌问题；静息细胞转化周期大大缩短，提高了产品的生产效率；静息细胞转化没有了外源性营养物质的存在，后续的提取过程不容易产生乳化层，提取操作更加方便。该发明所涉及的生产方法是对氢化可的松发酵菌丝体(即生物酶)进行多次重复利用，进行多轮投料转化，使菌体生物酶得以充分利用。该过程操作简单，节约成本、缩短周期，提高产量。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在实施例中，氢化可的松净转化率和比生成率的计算方法分别为：
净转化率：n轮转化中HC质量浓度总和/投料浓度总和＝％
比生成率：n轮转化中HC质量浓度总和/总发酵时间＝g/L/h
实施例1
一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法，步骤如下：
菌种制备：将蓝色犁头霉菌在无菌条件下接种于PDA固体斜面培养基上，控制培养温度28±0.5℃，培养时间为7～9天，至长出充满试管的灰色孢子丝及孢子。
发酵培养：将上述菌种的孢子在无菌条件下用一定量的无菌水洗脱，接种于摇瓶培养基，在温度28±0.5℃，转速200r/min的条件下培养至pH为4.0，培养周期24h，制得蓝色犁头霉发酵菌液。
所述摇瓶培养基(按百分比)为：葡萄糖1.2％、玉米浆1％、酵母膏0.4％、硫酸铵0.6％、其余为水，PH＝6.3，121℃灭菌30钟。
底物投料转化：待液体培养至pH＝4.0时，投入已经预先回流溶解的RSA，RSA的投加量为2.8g/L，进行发酵转化，转化周期31h，该发酵液转化定为首轮转化，即原发酵工艺。氢化可的松净转化率为：1.35g/L/2.8g/L＝48.2％；氢化可的松比生产率为1.35g/L/(24+31)h＝0.0245g/L/h。
静息细胞多轮转化：在上述转化结束后离心分离菌丝体，将菌丝体加入到已备好的摇瓶中，摇瓶中装有同上述发酵液等体积的水，并已投入回流溶解的RSA，RSA的投加量为1.5g/L，进行静息细胞转化，然后重复此步骤，进行静息细胞的多轮转化，每轮转化周期20h，共转化9轮。氢化可的松净转化率为9.007g/L/(2.8+1.5*9)g/L＝55.2％；氢化可的松比生产率为9.007g/L/(24+31+180)h＝0.03833g/L/h。
实施例2
一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法，步骤如下：
(1)菌种制备：将蓝色犁头霉菌在无菌条件下接种于PDA固体斜面培养基上，控制培养温度为28±0.5℃，培养时间为7～9天，至长出充满试管的灰色孢子丝及孢子。
(2)发酵培养：然后将上述菌种的孢子在无菌条件下用一定量的无菌水洗脱，接种摇瓶培养基中，在温度28±0.5℃，转速200r/min的条件下培养至pH为4.0，培养周期24h，制得蓝色犁头霉发酵菌液。
所述摇瓶培养基(按百分比)为：葡萄糖1.2％、玉米浆1％、酵母膏0.4％、硫酸铵0.6％、其余为水，PH＝6.2，121℃灭菌30钟。
(3)底物投料转化：待液体培养至pH＝4.0时，投入已经预先回流溶解的RSA，RSA的投加量为2.5g/L，进行发酵转化，转化周期31h，该发酵液转化定为首轮转化，即原发酵工艺。氢化可的松净转化率为1.23g/L/2.5g/L＝49.2％氢化可的松比生产率为1.23g/L/(24+31)h＝0.022364g/L/h。
(4)静息细胞多轮转化：在上述转化结束后离心分离菌丝体，将菌丝体加入到已备好的摇瓶中，摇瓶中装有同上述发酵液等体积的水，并已投入回流溶解的RSA，RSA的投加量为2.0g/L，进行静息细胞转化，然后重复此步骤，进行静息细胞的多轮转化，每轮转化周期20h，共转化9轮。氢化可的松净转化率为：10.961g/L/(2.5+2.0*9)g/L＝53.5％；氢化可的松比生产率为：10.961g/L/(24+31+20*9)h＝0.04664g/L/h。
实施例3
一种静息细胞多轮发酵制备氢化可的松的方法，步骤如下：
(1)菌种制备：将蓝色犁头霉菌在无菌条件下接种于PDA固体斜面培养基上，控制培养温度为28±0.5℃，培养时间为7～9天，至长出充满试管的灰色孢子丝及孢子。
(2)发酵培养：然后将上述菌种的孢子在无菌条件下用一定量的无菌水洗脱，接种摇瓶培养基中，在温度28±0.5℃，转速200r/min的条件下培养至pH为4.0，培养周期24h，制得蓝色犁头霉发酵菌液。
所述摇瓶培养基(按百分比)为：葡萄糖1.2％、玉米浆1％、酵母膏0.4％、硫酸铵0.6％、其余为水，PH＝6.4，121℃灭菌30钟。
(3)底物投料转化：待液体培养至pH＝4.0时，投入已经预先回流溶解的RSA，RSA的投加量为2.8g/L，进行发酵转化，转化周期31h，该发酵液转化定为首轮转化，即原发酵工艺。氢化可的松净转化率为：1.34g/L/2.8g/L＝47.9％氢化可的松比生产率为：1.34g/L/(24+31)h＝0.02436g/L/h。
(4)静息细胞多轮转化：在上述转化结束后离心分离菌丝体，将菌丝体加入到已备好的摇瓶中，摇瓶中装有同上述发酵液等体积的水，并已投入回流溶解的RSA，RSA的投加量为2.0-2.5g/L，进行静息细胞转化，然后重复此步骤，进行静息细胞的多轮转化，每轮转化周期20h，共转化6轮。氢化可的松净转化率为：8.91g/L/(2.8+2.0+2.5*5)g/L＝51.5％，氢化可的松比生产率为：8.91g/L/(24+31+20*6)h＝0.0509g/L/h。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。