阅读说明：本技术 一种甾体中间体的生物转化制备方法 (Biotransformation preparation method of steroid intermediate ) 是由 杜艳 刘辉 杜江涛 王鹏辉 单东奇 白傲雪 刘娟玲 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法,属于生物制药技术领域。本发明先制备中间体I的甾体混悬液,然后将混悬液投入含有霉菌种子的发酵培养基中,在霉菌的作用下发生C<Sub>11</Sub>位羟化反应,并同时水解C<Sub>21</Sub>位醋酸酯,得到中间体Ⅱ。本发明采用乳化投料法取代了有机溶媒溶解底物投料的操作,投入底物的浓度可以提高到15g/L以上,生物转化率提高到90％以上。采用本方法在乳化的同时加入氮源营养物质,在提高底物投料浓度的情况下使生物转化更彻底,生产成本显著降低。(The invention relates to a biotransformation preparation method of a steroid intermediate, belonging to the technical field of biological pharmacy. The invention firstly prepares steroid suspension of an intermediate I, then puts the suspension into a fermentation medium containing mould seeds, and generates C under the action of the mould 11 By hydroxylation reaction with simultaneous hydrolysis of C 21 And (4) performing ester position reaction to obtain an intermediate II. The invention adopts an emulsification feeding method to replace the operation of dissolving the substrate feeding by an organic solvent, the concentration of the fed substrate can be improved to more than 15g/L, and the biotransformation rate is improved to more than 90%. The method is adopted to add the nitrogen source while emulsifyingThe nutrient substances enable the biotransformation to be more thorough under the condition of improving the concentration of the fed substrate, and the production cost is obviously reduced.)

一种甾体中间体的生物转化制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，特别涉及一种甾体中间体的生物转化制备方法。

背景技术

甾体激素类物质是皮质激素药物的主要成分，倍他米松以及***等都是甾体激素类物质，具有抗炎、抗感染、抗休克和抑制免疫等药理作用。甾体的C₁₁位α-羟化是各种皮质激素合成不可缺少的步骤。与化学合成方法相比较，生物转化具有转化效率高、专一性好等突出优点，所以目前甾体的C₁₁位α-羟化通常由微生物通过发酵过程来完成。

微生物催化羟化反应的酶为胞内酶，甾体底物晶体必须先分散并逐渐溶于水中，然后被微生物吸收并在细胞内经酶催化转化，最后产物排出细胞外并形成新的晶体，完成整个转化过程。可见，要提高投料浓度和转化率，必须同时满足两个条件，首先是物料在发酵液和微生物细胞之间的迁移速度要快，其次是微生物细胞内的酶能够保持较长时间的高活性状态。

由于甾体中间体通常亲水性较差，在对甾体的C₁₁位进行α-羟化的反应中，现有技术以水溶性有机溶媒溶解底物，然后投入到发酵液中，底物在形成极细微晶的同时借助于有机溶媒的助溶作用，使其向微生物细胞内部迁移的速度得到提升，进而提高了转化效率。

常用于甾体的C₁₁位α-羟化发酵的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇等，这些溶剂的使用虽然会在一定程度上提高转化效率，但有机溶剂本身对微生物是有毒害的，长时间和有机溶剂接触会让微生物细胞迅速老化，失去对底物的转化能力，这就意味着有机溶剂使用量是有限的，该工艺的投料浓度提升自然就会遇到瓶颈。同时，有机溶剂的使用也会带来严重的安全和环保问题，在对安全和环保要求越来越严格的现在，并不利于转化方法的产业化推广。

公开号为CN103146793B的中国专利报导了一种添加生物催化剂的C₁₁位α-羟化生物转化方法，但仍然采用了乙醇溶解底物的方式投料，转化过程中底物最高浓度仅达到8g/L，生物转化率最高仅为80％。

发明内容

本发明提供了甾体中间体的生物转化制备方法，能够解决上述现有技术问题中的一种或几种。

本发明针对现有C₁₁位α-羟化反应生产技术的制约因素，重点研究了如何增加底物溶解性以及延长羟化酶活性的方法。初步研究发现，将甾体底物中间体I与一定量的乳化剂混合后充分乳化，可取代有机溶剂溶解甾体底物的方式实现C₁₁位α-羟化，在投料浓度相同的情况下，可得到不低于现有技术方案的生物转化率。进一步开展的实验表明，在甾体乳化后，如果在投料时同步加入一定量的氮源物质，甾体的生物转化率会有一定的提升。

最终的研究发现，最佳的技术方案是：将氮源物质与表面活性剂混合后加入中间体I进行乳化，再投入含有霉菌种子的发酵培养基中发酵，甾体的生物转化率有大幅度的提高。在投料浓度提高到15g/L的情况下，C₁₁位α-羟化反应的生物转化率达到90％以上。

根据本发明的一个方面，提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，先制备中间体I(倍他米松脱溴物或***脱溴物)的甾体混悬液，然后将其投入霉菌预培养液中，中间体I在发酵培养基中的初始浓度可以达到15g/L以上。在霉菌的作用下中间体I发生C₁₁位羟化反应，同时水解C₂₁位醋酸酯，得到中间体Ⅱ(倍他米松羟化物或***羟化物)，中间体Ⅱ为生产***或者倍他米松的重要中间体，主要反应为：

生物发酵过程中使用的霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或几种。具体步骤如下：

(1)菌种培养

制备霉菌斜面菌种，并将所得斜面培养物接入种子培养基，培养得霉菌种子液；将种子液转接入发酵培养基进行发酵预培养，得到预培养液；备用。

(2)制备甾体混悬液

制备表面活性剂与第一氮源物质的混合水溶液，并将混合水溶液灭菌，然后加入中间体I，充分搅拌乳化后得甾体混悬液，备用。

(3)生物转化

将步骤(2)中得到的甾体混悬液转入步骤(1)中的预培养液，得初始发酵液，继续发酵培养。

(4)后处理

生物转化结束后，将最终培养液灭活后冷却至室温，用有机溶剂进行萃取，萃取液浓缩得到产物中间体Ⅱ。

在一些实施方式中，为适应较大规模的生产，种子液可以分为摇瓶种子液、一级种子液和二级种子液。即通过斜面菌种先得到摇瓶种子液；再将摇瓶种子液接入更大体积的种子培养基中，经培养得到一级种子液；一级种子液按比例接入更大体积的种子培养基中，培养后得到二级种子液，用于发酵接种。

在一些实施方式中，摇瓶种子液接种一级种子培养基接种量为1％～5％；一级种子液接种二级种子培养基接种量为1％～10％；二级种子液接种发酵培养基接种量为5％～15％。

在一些实施方式中，可以省略一级种子液和二级种子液，而是用摇瓶种子液直接接种发酵，接种量为5％～15％。

在一些实施方式中，可以省略二级种子液，而是由一级种子液接种发酵，接种量为5％～15％。

在一些实施方式中，种子培养基配比：第二氮源物质为10～15g/L、葡萄糖为10～15g/L、KH₂PO₄为1～3g/L、KNO₃为0.5～1g/L；发酵培养基配比：第二氮源物质为20～45g/L、葡萄糖为20～40g/L、KH₂PO₄为1～3g/L、MgSO₄为0.5～1.5g/L。

在一些实施方式中，种子培养基和发酵培养基中的第二氮源物质可以是酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏、硫酸铵、磷酸氢二铵中的一种或几种。

在一些实施方式中，甾体混悬液的制备方法为：在投料罐中加入表面活性剂以及第一氮源物质，加水溶解，并将混合水溶液灭菌。将投料罐内物料灭菌后冷却至29℃以下，加入一定数量的中间体I，搅拌至少1小时使之充分乳化，得甾体混悬液。

在一些实施方式中，制备甾体混悬液过程中，使用的第一氮源物质包含酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或几种。第一氮源物质在发酵液中的浓度为2～5g/L，在发酵过程中起补充氮源作用。

在一些实施方式中，制备甾体混悬液过程中，使用的表面活性剂包含吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或几种，表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.5～1.0g/L，在甾体混悬液制备过程中起乳化分散作用。

在一些实施方式中，将制备好的甾体混悬液转入预培养液，得到初始发酵液，其中表面活性剂的初始浓度为0.5～1.0g/L，中间体I的初始浓度为15g/L以上，氮源物质的浓度增加2～5g/L。

在一些实施方式中，步骤(1)中发酵预培养，控制培养温度25～32℃，通气量0.025～0.75vvm，预培养8～12小时。由此，菌体在进行生物转化之前进行充分的繁殖，霉菌生物量大幅提高，有助于生物转化的进行。

在一些实施方式中，步骤(3)生物转化，控制温度25～32℃，通气量0.025～0.75vvm，转化周期为70～76小时。

在一些实施方式中，后处理方式为：发酵转化结束后，将最终培养液灭活并冷却至室温，用有机溶剂进行萃取，萃取有机溶剂为醋酸乙酯、醋酸丁酯、三氯甲烷、二氯甲烷、二氯乙烷、己烷、庚烷中的一种或几种。可选用的有机溶剂较多，并且不会影响产物的品质。

本发明的有益效果：

采用先制备甾体混悬液然后投料的方式取代了现行工艺中有机溶剂溶解底物后投料的操作。

在甾体混悬液的制备及发酵过程中，表面活性剂起到乳化分散作用，使底物在发酵液中分散更加均匀，也增加了底物和水的亲和性，同时，表面活性剂会增加霉菌细胞壁的通透性，更进一步提高了霉菌吸收底物和排出产物的速度；在投料过程中同时为发酵菌种补充了营养物质，延长了微生物细胞的活性周期。如此在提高投料浓度的情况下，确保了转化率大幅度上升。

新的投料方式完全不使用有机溶剂，避免有机溶剂对发酵菌种的刺激和损害，也更加安全环保，同时能减少防爆设备及厂房建设方面的投入，显著降低成本。

底物投料浓度提高到了15g/L以上(最高为21.4g/L)，转化率提高到90％以上，提高了生产效率，更有利于产业化生产。

附图说明

图1是本发明中间体I转化为中间体Ⅱ的反应原理图。

图2是本发明实施例7的转化率HPLC检测图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1不同投料方式转化及收率情况对比

本实施例采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以***脱溴物(中间体I)为底物，对其C₁₁位进行改造，同时水解C₂₁位醋酸酯，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体***羟化物(中间体Ⅱ)。本实施例中，不同摇瓶采用不同投料方式或不同的投料浓度，以便对转化率及收率情况进行对比。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将金龟子绿僵菌转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

种子培养基配比：酵母浸粉为10g/L、葡萄糖为10g/L、KH₂PO₄为1g/L、KNO₃为0.5g/L，配制完成分装为300mL/摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用。

取得到的斜面菌种接种到300mL摇瓶种子培养基中，控制温度32±1℃，摇床转速180rpm，培养40hr后得种子液。

(2)预培养液制备

发酵培养基配比：酵母粉为15g/L、硫酸铵为5g/L、玉米浆为10g/L、葡萄糖为20g/L、KH2PO4为1g/L、MgSO4为0.5g/L；分装为950mL/摇瓶，共5瓶，121℃灭菌35分钟后，降至室温，每瓶接入种子液50mL。控制温度32±1℃，摇床转速150rpm，培养12hr，得预培养液。

(3)制备甾体混悬液

甾体混悬液1

在三颈瓶中加入1.2g的吐温-80，5g的酵母浸粉，加水200mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入18.3g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

甾体混悬液2

在三颈瓶中加入1.2g的吐温-80，加水200mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入18.3g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

甾体混悬液3

在三颈瓶中加入1.2g的吐温-80，5g的酵母浸粉，加水200mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入9.8g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

(4)中间体I乙醇溶液制备

中间体I乙醇溶液1

在三角瓶中加入乙醇40mL，加入15.6g的倍他米松脱溴物(中间体I)，升温直至溶清，保温备用。

中间体I乙醇溶液2

在三角瓶中加入乙醇20mL，加入8.3g的倍他米松脱溴物(中间体I)，升温直至溶清，保温备用。

(5)生物转化

预培养液5个摇瓶编号分别为A、B、C、D、E，各摇瓶投料情况如下：

摇瓶A，投甾体混悬液1；中间体I在发酵液中的初始浓度为15.3g/L，吐温-80在发酵液中的初始浓度为1g/L，氮源物质的浓度增加4.2g/L；

摇瓶B，投甾体混悬液2；中间体I在发酵液中的初始浓度为15.3g/L，吐温-80在发酵液中的初始浓度为1g/L，未补充氮源物质；

摇瓶C，投甾体混悬液3；中间体I在发酵液中的初始浓度为8.2g/L，吐温-80在发酵液中的初始浓度为1g/L，氮源物质的浓度增加4.2g/L；

摇瓶D，投中间体I乙醇溶液1；中间体I在发酵液中的初始浓度为15g/L，未补充氮源物质；

摇瓶E，投中间体I乙醇溶液2；中间体I在发酵液中的初始浓度为8.1g/L，未补充氮源物质；

投料后继续发酵培养；培养条件：32±1℃，摇床转速150rpm，转化周期为76hr。

(6)提取

生物转化结束后，分别将各摇瓶最终发酵液90℃灭活后冷却至室温，分5次用共计2倍发酵液体积(V/V)的醋酸乙酯进行萃取。合并萃取所得醋酸乙酯，取样，HPLC面积归一法检测转化率。

(7)结果与分析

本实施例结果如下所示：

摇瓶编号	投料量	投料浓度	投料方式	转化率
					A	18.3g	15.3g/L	乳化+氮源	90.8％
B	18.3g	15.3g/L	乳化	80.4％
					C	9.8g	8.2g/L	乳化+氮源	93.2％
D	15.6g	15g/L	乙醇溶解	70.1％
					E	8.3g	8.1g/L	乙醇溶解	73.9％

从本实施例的结果可以得出结论:

本发明涉及的工艺之所以能够获得较高的转化率，是乳化投料工艺和补充氮源物质二者共同作用的结果，如果只改变投料方式而不补充氮源，会降低本发明涉及的工艺的优势；

本发明涉及的工艺在8g/L投料浓度情况下转化率为93.2％，比现行工艺高19.3个百分点；在15g/L投料浓度情况下转化率为90.8％，比现行工艺高20.7个百分点；在高浓度投料情况下，本发明涉及的工艺优势更加突出。

实施例2

本实施例采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以***脱溴物(中间体I)为底物，通过霉菌发酵制备***羟化物(中间体Ⅱ)。

本实施例中，考察三种不同的投料方式。

第一种投料方式：表面活性剂水溶液灭菌后，加入甾体进行乳化，制备得到甾体混悬液；之后投入预培养液中发酵转化。

第二种投料方式：表面活性剂水溶液灭菌后，加入甾体进行乳化，制备得到甾体混悬液；补充的氮源物质单独灭菌，得到氮源混悬液；投料时将甾体混悬液和氮源混悬液同时加入预培养液中发酵转化。

第三种投料方式：将补充的氮源物质与表面活性剂水溶液先混合、灭菌，再加入甾体进行乳化，制备得到甾体加氮源的混悬液；之后投入预培养液中发酵转化。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将金龟子绿僵菌转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

种子培养基配比：酵母浸粉为12g/L、葡萄糖为12g/L、KH₂PO₄为1.5g/L、KNO₃为0.7g/L，配制完成分装为200mL/摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用。

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶种子培养基中，控制温度32±1℃，摇床转速180rpm，培养40hr后得种子液。

(2)预培养液制备

发酵培养基配比：酵母粉为15g/L、硫酸铵为3g/L、玉米浆为15g/L、葡萄糖为30g/L、KH₂PO4为1.5g/L、MgSO₄为0.75g/L；分装为950mL/摇瓶，共2瓶，121℃灭菌35分钟后，降至室温，每瓶接入种子液50mL。控制温度30±1℃，摇床转速150rpm，培养12hr，得预培养液。

(3)甾体预处理

甾体混悬液1：在三颈瓶中加入0.6g的吐温-80，加入0.4g的司盘-80，加水200mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入19g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

甾体混悬液2：在三颈瓶中加入0.6g的吐温-80，加入0.4g的司盘-80，加水150mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入19g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

氮源混悬液3：在三角瓶中加入4g酵母浸粉，2g玉米浆，加水50mL，121℃灭菌35分钟灭菌后，冷却到28℃，得补充氮源混悬液，备用

甾体加氮源混悬液4：在三颈瓶中加入0.6g的吐温-80，加入0.4g的司盘-80，加入4g的酵母浸粉，加入2g的玉米浆，加水200mL。121℃灭菌35分钟后，冷却到28℃，加入19g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

(4)生物转化

预培养液3个摇瓶编号分别为A、B、C，各摇瓶投料情况如下：

摇瓶A，投甾体混悬液1；中间体I在发酵液中的初始浓度为15.8g/L，表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.8g/L；

摇瓶B，投入甾体混悬液2，并同时投入氮源混悬液3；中间体I在发酵液中的初始浓度为15.8g/L，表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.8g/L，氮源物质的浓度增加5g/L；

摇瓶C，投甾体加氮源混悬液4；中间体I在发酵液中的初始浓度为15.8g/L，表面活性剂在发酵液中的初始浓度为0.8g/L，氮源物质的浓度增加5g/L。

投料后继续发酵培养；培养条件：30±1℃，摇床转速150rpm，转化周期为72hr。

(6)提取

生物转化结束后，分别将各摇瓶最终发酵液90℃灭活后冷却至室温，分5次用共计2倍发酵液体积(V/V)的醋酸乙酯进行萃取。合并萃取所得醋酸乙酯，取样，HPLC面积归一法检测转化率。

(7)结果与分析

本实施例结果如下所示：

从本实施例的结果可以得出结论:

与单独乳化投料相比，投料时加入营养物质，生物转化率都有一定程度的上升，但氮源的加入方式不同产生了不同的转化效果。同样在15.8g/L的投料浓度下，采用氮源与甾体合并乳化的投料方式比氮源分开加入的投料方式，C₁₁位α-羟化的生物转化率高5.8％。

原因分析如下：实验B投料时加入的氮源物质，起到了补充细胞营养、增加羟化酶活力的作用，因此相比于实验A生物转化率有一定程度的提高。实验C将氮源物质在甾体乳化前加入，与甾体同步乳化。由于氮源的有效成分多为氨基酸类、多肽类和核酸类物质。其中多肽为氨基酸的多分子聚合物，核酸为核苷酸的聚合物，两者都具有较为明显的表面活性剂特征。因此在乳化前加入的氮源物质，不仅能起到增加霉菌细胞羟化酶活力的作用，还可与表面活性剂协同作用，进一步提高底物的溶解性，促进底物与细胞的结合能力，使底物的转化更加彻底，从而得到了更高的生物转化率。

实施例3

本实施例提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，采用匍枝根霉作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体I)为底物，对其C₁₁位进行改造，同时水解C₂₁位醋酸酯，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体Ⅱ)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将匍枝根霉转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

制备种子培养基，配比为：酵母浸粉为10g/L、葡萄糖为10g/L、KH₂PO₄为1g/L、KNO₃为0.5g/L，配制完成分装为200mL/摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用。

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶种子培养基中，控制温度32±1℃，摇床转速180rpm，培养40hr后得种子液。

在容积为5L的发酵罐中配制2L发酵培养基，配比为：酵母粉为15g/L、硫酸铵为5g/L、玉米浆为10g/L、葡萄糖为20g/L、KH₂PO₄为1g/L、MgSO₄为0.5g/L；121℃灭菌35分钟后，降温至29℃，接入种子液200mL。控制温度32±1℃，转速180rpm，通气量0.025vvm，罐压0.04～0.06MPa，培养12hr，得预培养液。

(2)制备甾体混悬液

在三颈瓶中加入1.25g的吐温-80，5g的酵母浸粉，加水300mL。121℃灭菌35分钟灭菌后，加入37.5g的倍他米松脱溴物(中间体I)，转速180rpm，搅拌2小时，得甾体混悬液，备用。

(3)生物转化

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液。其中倍他米松脱溴物(中间体I)在初始发酵液中的初始浓度为15g/L，吐温-80在初始发酵液中的初始浓度为0.5g/L，氮源物质的浓度增加2g/L。继续发酵培养；培养条件：32±1℃，转速150rpm，通气量0.025vvm，罐压0.04～0.06MPa。转化周期为76hr。

(4)提取

生物转化结束后，将最终发酵培养液90℃灭活后冷却至室温，分5次用共计2倍发酵液体积(V/V)的醋酸丁酯进行萃取。合并萃取所得醋酸丁酯，HPLC检测转化率为90.6％，HPLC图谱与图2相似。

实施例4

本实施例提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，采用赭曲霉作为发酵菌种，以***脱溴物(中间体I)为底物，对其C₁₁位进行改造，同时水解C₂₁位醋酸酯，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体***羟化物(中间体Ⅱ)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将赭曲霉转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度25±1℃，培养7天得斜面菌种。

种子培养基的配比为：酵母粉为5g/L、蛋白胨为5g/L、玉米浆为5g/L、葡萄糖为15g/L、KH₂PO₄为3g/L、KNO₃为1g/L；配制完毕后分装100mL摇瓶。摇瓶种子培养基灭菌后冷却至室温，接入斜面菌种，在摇床上控制温度28±1℃，转速200rpm，培养48hr后得种子液。

发酵培养基配比为：酵母粉为20g/L、磷酸氢二铵为10g/L、玉米浆为15g/L、葡萄糖为40g/L、KH₂PO₄为3g/L、MgSO₄为1.5g/L。

在容积为5L的发酵罐中配制2L发酵培养基，灭菌后冷却至室温；将得到的种子液100mL转接入发酵培养基，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，通气量0.75vvm，罐压0.04～0.06MPa，预培养8hr，得到预培养液，备用。

(2)制备甾体混悬液

在三颈瓶中加入1.8g的吐温-80、0.8g司盘-80、8g酵母浸粉和5g玉米浆，加水500mL。将投料罐灭菌后，加入65g***脱溴物(中间体I)，转速200rpm，搅拌2.5小时，得甾体混悬液。

(3)生物转化

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液。其中***脱溴物(中间体I)在初始发酵液中的初始浓度为15g/L，表面活性剂(吐温-80以及司盘-80)在初始发酵液中的初始浓度为1g/L，氮源物质的浓度增加5g/L。继续发酵培养；培养条件：25±1℃，通气量：0.75vvm；转化周期为70hr。

(4)提取

生物转化结束后，将发酵培养液90℃灭活后冷却至室温，分4次用共计2倍发酵液体积(V/V)的醋酸乙酯进行萃取，合并萃取液，HPLC归一法检测转化率为91.4％，HPLC图谱与图2相似。

实施例5

本实施例提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，采用匍枝根霉和金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以***脱溴物(中间体I)为底物，对中间体I的11位进行改造，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁-羟基的甾体激素类物质重要中间体***羟化物(中间体Ⅱ)。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将匍枝根霉和金龟子绿僵菌分别转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养6天得斜面菌种。

采用的种子培养基(包括摇瓶种子和一级种子培养基)配比为：酵母浸粉为8g/L、硫酸铵为5g/L、葡萄糖为12g/L、KH₂PO₄为2g/L、KNO₃为0.8g/L。

将得到的斜面菌种接种到100mL种子培养基中，控制温度28±1℃，摇床转速180rpm，培养45hr后得摇瓶种子液；将得到的摇瓶种子液20mL接入280mL种子培养基摇瓶中，控制温度28±1℃，摇床转速180rpm，培养36hr，得一级种子液；备用。

发酵培养基配比为：酵母浸粉为10g/L、酵母膏为10g/L、葡萄糖为30g/L、KH₂PO₄为2g/L、MgSO₄为1g/L。

在容积为5L的发酵罐中配置2L发酵培养基，灭菌后冷却至室温；将得到的一级种子液300mL转接入发酵培养基，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量0.5vvm，罐压0.04～0.06MPa，预培养10hr，得到预培养液，备用。

(2)制备甾体混悬液

在三颈瓶中加入1.5g吐温-20、0.5g十二烷基苯磺酸钠、5g蛋白胨和3g酵母粉，加500mL水溶解。121℃灭菌25分钟后，加入***脱溴物(中间体I)60g，搅拌2.5小时，得甾体混悬液。

(3)生物转化

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液。其中***脱溴物(中间体I)在初始发酵液中的初始浓度约为21.4g/L，表面活性剂在初始发酵液中的初始浓度约为0.71g/L，氮源物质的浓度增加约2.86g/L。继续发酵培养；培养条件：28±1℃，通气量：0.5vvm；转化周期为72hr。

(4)提取

生物转化结束后，将最终发酵培养液90℃灭活后冷却至室温，分4次用共计1.5倍发酵液体积(V/V)的三氯甲烷进行萃取，合并萃取液，HPLC检测转化率为87.8％，HPLC图谱与图2相似。

实施例6

本实施例提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，采用赭曲霉和匍枝根霉作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体I)为底物，对中间体I的11位进行改造，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁-羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体Ⅱ)。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将赭曲霉和匍枝根霉转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种。

采用的种子培养基为配比为：蛋白胨为12g/L、葡萄糖为15g/L、KH₂PO₄为1.5g/L、KNO₃为0.5g/L。

取得到的斜面菌种接种到300mL摇瓶种子培养基中，控制温度28±1℃，摇床转速180rpm，培养42hr后得种子液。

采用的发酵培养基配比：蛋白胨为25g/L、磷酸氢二铵为10g/L、葡萄糖为25g/L、KH₂PO₄为2g/L、MgSO₄为1.5g/L。

在容积为5L的发酵罐中配制2L发酵培养基，灭菌后冷却至28℃；将得到的种子液300mL转接入发酵培养基，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，通气量0.25vvm，搅拌转速150rpm，罐压0.04～0.06MPa，预培养9hr，得到预培养液，备用。

(2)制备甾体混悬液

在三颈瓶中加入1.0g的十二烷基硫酸钠、0.5g吐温-40，3g的酵母浸粉、1g酵母膏和3g玉米浆，加500mL水溶解。将投料罐115℃灭菌30分钟后，加入50g的倍他米松脱溴物(中间体I)，搅拌2.5小时，得甾体混悬液。

(3)生物转化

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液。其中倍他米松脱溴物(中间体I)在初始发酵液中的初始浓度约为17.9g/L，表面活性剂在初始发酵液中的初始浓度约为0.54g/L，氮源物质的浓度增加约2.5g/L。继续发酵培养；培养条件：28±1℃，搅拌转速150rpm，通气量：0.25vvm，搅拌转速150rpm；转化周期为72hr。

(4)提取

生物转化结束后，将最终发酵培养液90℃灭活后冷却至室温，分5次用共计2倍发酵液体积(V/V)的二氯甲烷、二氯甲烷和二氯乙烷的混合溶剂进行萃取，合并有机溶剂，HPLC检测转化率为89.7％，HPLC图谱与图2相似。

实施例7

本实施例提供了一种甾体中间体的生物转化制备方法，采用赭曲霉作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体I)为底物，对其C₁₁位进行改造，同时水解C₂₁位醋酸酯，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体Ⅱ)。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将赭曲霉转接在PDΑ斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养6天得斜面菌种；

采用的种子(包括摇瓶种子、一级种子和二级种子)培养基配比为：酵母浸粉为12g/L、葡萄糖为13g/L、KH₂PO₄为3g/L、KNO₃为1g/L。

摇瓶种子培养基配制完毕后，分装量为500mL/瓶，共4瓶，包扎后于121℃灭菌35分钟，冷却至室温，接入斜面菌种，放入摇床，控制温度28±1℃，摇床转速180rpm，培养30hr后得摇瓶种子液；

一级种子罐中配制100L种子培养基，于121℃灭菌35分钟，降温至27.5℃。将得到的摇瓶种子液共2L接入一级种子罐中，控制温度28±1℃，搅拌转速160rpm，通气量0.45vvm，罐压0.04～0.06MPa，培养36hr，得一级种子液；

二级种子罐中配制2000L种子培养基，于121℃灭菌35分钟，降温至28.5℃，将得到的一级种子液共200L接入二级种子罐中，控制温度28±1℃，搅拌转速180rpm，通气量0.3vvm，罐压0.04～0.06MPa，培养20hr，得二级种子液；

发酵培养基配比为：酵母浸粉为20g/L、酵母膏为15g/L、葡萄糖为30g/L、KH₂PO₄为2g/L、MgSO₄为1g/L。

在发酵罐中配制20m³发酵培养基，灭菌后冷却至28℃；将得到二级种子液转接入灭菌后的发酵培养基中，控制温度28±1℃，搅拌转速200rpm，通气量0.35vvm，罐压0.04～0.06MPa，预培养8hr，得到预培养液。

(2)制备甾体混悬液

在溶料罐中加入8kg吐温-80、9kg十二烷基苯磺酸钠、1kg十二烷基硫酸钠、30kg蛋白胨、30kg酵母浸粉、3500L水，121℃、25分钟灭菌后，加入倍他米松脱溴物(中间体I)430kg，搅拌2.5小时，得甾体混悬液。

(3)生物转化

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液。其中倍他米松脱溴物(中间体I)在初始发酵液中的初始浓度约为16.8g/L，表面活性剂在初始发酵液中的初始浓度约为0.7g/L，氮源物质的浓度增加约2.3g/L。控制温度28±1℃、搅拌转速200rpm、通气量0.45vvm、罐压0.04～0.06MPa继续发酵培养。转化周期为72hr。

(4)提取

发酵生物转化结束后，终培养液90℃灭活后冷却至室温，分5次，用共计1倍发酵液体积(V/V)的己烷和庚烷的混合液萃取，合并萃取液，HPLC检测，转化率为90.7％，转化率图谱如图2所示。1号峰的保留时间(Rt)为5.928min，2号峰的保留时间为8.881min，3号峰的保留时间为13.780min。以1号峰为参比，将1号峰的保留时间看成1，计算其余2号峰和3号峰的相对保留时间(RRT)。其中，2号峰为水解物杂质，RRT＝8.881/5.928＝1.49；3号峰为中间体Ⅱ，RRT＝13.780/5.928＝2.32。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。