一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法
阅读说明：本技术 一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法 (Method for preparing deoxycholic acid from phytosterol ) 是由 蒋红平 唐杰 李斌 郭志军 于 2021-02-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。本发明提供了一种新的以植物甾醇为原料,通过生物发酵与化学合成相结合的手段,制备脱氧胆酸的方法,该方法未使用动物源提取,可以以工业废水废渣为原料,绿色环保；通过分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805诱变菌种生物发酵的方法在植物甾醇侧链一步构建胆酸类化合物的羰基侧链,操作简单,收率高,异构体杂质少,有机溶剂使用量少；通过本发明制备脱氧胆酸类化合物,反应试剂简单易得,反应条件温和,反应收率高,适合工业化大生产。(The invention provides a preservation number of CCTCC NO: use of a mutagenized species of M2020987 in the preparation of deoxycholic acid. The invention provides a novel method for preparing deoxycholic acid by taking phytosterol as a raw material through a means of combining biological fermentation and chemical synthesis, and the method does not use animal source extraction, can take industrial wastewater and waste residues as raw materials, and is green and environment-friendly; the carbonyl side chain of the cholic acid compound is constructed on the phytosterol side chain in one step by a Mycobacterium sp.NRRL B-3805 mutant strain biological fermentation method, the operation is simple, the yield is high, the isomer impurities are few, and the usage amount of an organic solvent is small; the deoxycholic acid compound prepared by the method has the advantages of simple and easily-obtained reaction reagent, mild reaction conditions and high reaction yield, and is suitable for industrial mass production.)
技术领域
本发明涉及化学制药技术领域，尤其涉及一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，具体涉及一种以植物甾醇为原料通过生物发酵与化学合成相结合的方式制备脱氧胆酸化合物的方法。
背景技术
脱氧胆酸(Deoxycholic Acid，简称DCA)又名去氧胆酸，化学名称为3α，12α-二羟-5β-胆烷酸，是胆酸失去一个氧原子而得的一种游离胆汁酸，在胆汁中主要以牛磺酸、甘氨酸结合形式存在。脱氧胆酸及其盐有表面活性，为化妆品和药剂中安全有效的乳化剂，有抗真菌和抗炎作用，可用于治疗牙根患疾。在皮肤外科中可用于皮脂腺分泌过多症的治疗。在香粉等制品中应用可除去多余皮脂和汗渍，而不使皮肤有干燥感。有研究显示，注入脂肪组织的脱氧胆酸盐经由细胞溶解机理降解脂肪细胞。由于注入脂肪的脱氧胆酸盐因暴露于蛋白质而快速失活，接着快速返回到肠内容物，所以其作用受空间限制。作为赋予临床安全性的此减弱作用的结果，脂肪去除疗法通常需要4-6疗程。此无需外科手术的局部脂肪去除不仅有利于与病理学局部脂肪沉积(例如HIV治疗中的医学介入易发的血脂异常)相关的治疗性处理，而且有利于美容脂肪去除且无外科手术(例如吸脂术)所固有的伴随风险。在美国，DCA已被FDA批准用于减少颏下中度至重度脂肪。
目前脱氧胆酸的制备方法主要有两种，一种是从生物体提取分离出来，但从动物来源获得的脱氧胆酸可能含有病原体；另一种是采用合成的方法获得脱氧胆酸，现有的合成方法工艺复杂，对环境污染，成本相对较高。近年来，有从植物甾醇为原料合成脱氧胆酸的相关报道，专利CN106146594A报道了以豆甾醇和麦角固醇为原料合成DCA的方法，该方法采用全合成方法，存在反应步骤长，收率低，试剂昂贵等问题，不适合工业化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，操作简单，收率高。
为达到上述目的，本发明提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。
本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种联合赭曲霉菌Aspergillus ochraceus ATCC 18500菌种在制备脱氧胆酸中的应用。
所述赭曲霉菌Aspergillus ochraceus ATCC 18500菌种的来源为美国模式菌种收集中心(ATCC)。
本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种联合保藏编号为CCTCC NO:M2013544的耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis NK-XHX-118菌种在制备脱氧胆酸中的应用。
上述保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种为分支杆菌Mycobacteriumsp.NRRL B-3805的诱变菌种。
上述诱变菌种由分支杆菌NRRL B-3805为出发菌种，经诱变得到。
上述原始菌种分支杆菌NRRL B-3805的来源为美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)。
本发明提供了用于生产4-胆烯酸-3-酮的分支杆菌诱变菌种的诱变方法，包括以下步骤：
以分支杆菌NRRL B-3805为出发菌种，经过斜面培养和二级种子培养，收集菌体制备菌悬液，加入亚硝基胍进行诱变处理，将诱变后的菌悬液稀释后涂布于固体平板培养基上，挑选单菌落进行植物甾醇发酵，检测4-胆烯酸-3-酮的产量，得到能产生4-胆烯酸-3-酮的目标诱变菌种，并分离保存菌株。
本发明优选的，所述斜面培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L,pH＝7.5。
本发明优选的，所述种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L；葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L，pH＝7.5。
本发明优选的，所述固体培养基的配方为：酵母膏粉10～20g/L，更优选10g/L，葡萄糖15～30g/L，更优选15g/L；硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L；磷酸氢二铵0.1～1g/L，更优选0.6g/L；琼脂粉20g/L，pH＝7.5。
所述诱变处理的时间优选为30min。
具体的，本发明提供了一种从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法，包括以下步骤：
A)将保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种经培养后接种至第一转化培养基，对式Ⅰ所示植物甾醇进行第一发酵转化，得到化合物1；
B)将赭曲霉菌Aspergillus ochraceus ATCC 18500菌种经第二斜面培养、第二种子培养后接种至第二转化培养基，对化合物1进行第二发酵转化，得到化合物2；
或将保藏编号为CCTCC NO:M2013544的耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatisNK-XHX-118菌种经第三种子培养后接种至第三转化培养基，对化合物1进行第三发酵转化，得到化合物2’；
C)化合物2或化合物2’在乙酸酐和浓硫酸的作用下反应生成化合物3；
D)化合物3在催化剂作用下与空气反应生成化合物4；
E)化合物4在催化剂的作用下与氢气反应生成化合物5；
F)化合物5溶于四氢呋喃和水中，与硼氢化钠反应生成式Ⅱ所示脱氧胆酸；
其中，R为-(CH2)3CH(C2H5)CH(CH3)2、-CH2CH＝CHCH(C2H5)CH(CH3)2、-(CH2)3CH(CH3)CH(CH3)2或-CH2CH＝CHCH(CH3)CH(CH3)2。
上述反应的路线如下：
路线一：
本申请以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备脱氧胆酸化合物。从原料来源来说，与动物源原料相比，植物甾醇广泛存在于植物的根茎叶及果实中，在大自然中储量惊人，并且现代商业产品的生产中的废渣都含有高含量的植物甾醇，如油脂产业中压榨后的残渣或馏出物，制糖业中的甜菜渣和甘蔗渣，还有造纸的废液废水中均含有一定含量的植物甾醇，如果对这些甾醇进行开发利用，不仅避免了动物源病原体风险，更是解决了废水废渣的环保问题。从技术手段来讲，本发明采用微生物发酵与化学合成相结合的方法合成脱氧胆酸，在脱氧胆酸合成的2个关键步骤侧链构建和9或11位α羟基引入均采用微生物转化法，具有操作简单，收率高，异构体杂质少，有机溶剂使用量少等优势。
本发明优选的，所述第一发酵转化方法具体为：将保藏编号为CCTCC NO：M2020987的诱变菌种经一级种子培养和二级种子培养后加入转化培养基中，接种量10％～40％，温度20-30℃，转速200～600rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为72～180h。
本发明优选的，所述一级种子培养和二级种子培养的培养基配方为：酵母膏粉10～20g/L，葡萄糖10～20g/L,硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1.0g/L，pH为7.5。
本发明优选的，所述转化培养基配方为：植物甾醇10～40g/L，大豆油10～20g/L，玉米浆30～80g/L，硝酸钠2～6g/L，磷酸氢二铵0.1～1.0g/L，调pH＝8.0。
本发明优选的，所述第一发酵转化后，进行后处理，得到化合物1。
所述后处理优选具体为：
调节体系pH值为5.0-6.0，加热搅拌后，静止分层；取油层用甲醇进行提取，浓缩除去溶剂后，用乙酸乙酯回流打浆，冷却析出固体后过滤；滤液浓缩除去溶剂，用氯仿和水，在pH12-13的条件下，常温搅拌、静置分层；取水相调节pH至1.0，静置分层；取分层后得到的油状物，为化合物1。
本发明优选的，取分层后得到的油状物后，还包括：在油状物中加入乙酸乙酯和活性炭常温搅拌，过滤浓缩后得化合物1。
所述常温搅拌的时间优选为2h。
本发明优选的，所述第二发酵转化的条件具体为：接种量5％～10％，室温，转速200～300rpm，空气流量0.2～0.4Nm3/h，压力0.01～0.1MPa，转化时间为72-120h。
本发明优选的，所述第二斜面培养的培养基为：土豆块100～300g/L，葡萄糖10～30g/L,琼脂10～20g/L,调pH为6.5。
本发明优选的，所述第二种子培养的培养基为：玉米浆5～20g/L，葡萄糖10～40g/L，调pH值为7.2±0.2。
本发明优选的，所述第二转化培养基为：玉米浆5～20g/L，葡萄糖10～40g/L，调pH值为7.2±0.2。
本发明优选的，所述第二发酵转化后，进行后处理，得到化合物2；
所述后处理为：
第二发酵转化结束后，升温至80℃灭活，降至常温调pH＝3.0左右，抽滤；滤饼用二氯甲烷冲洗，收集滤液，浓缩干溶剂后加水搅拌均匀然后过滤，得到化合物2。
本发明优选的，所述第三发酵转化的条件具体为：接种量10～30％，更优选20％，温度28～32℃，更优选30℃，转速300～600rpm，更优选400rpm，空气流量0.1～0.4Nm3/h，更优选0.2Nm3/h，压力0.02～0.1MPa，更优选0.05MPa，转化时间为48-72h。
本发明优选的，所述第三种子培养的培养基为：酵母膏粉5～20g/L，更优选10g/L，葡萄糖10～20g/L,更优选15g/L,硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L，磷酸氢二铵0.01～0.1％，更优选0.06％，调pH为7.5。
本发明优选的，所述第三转化培养基为：植物甾醇5～20g/L，更优选10g/L，玉米浆10～80g/L，更优选60g/L，硝酸钠2～6g/L，更优选5.4g/L，磷酸氢二铵0.1～0.8g/L，更优选0.6g/L，调pH为8.0。
本发明优选的，所述第三发酵转化后，进行后处理，得到化合物2’。
所述后处理优选为：
水层调pH至1～2，用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷层，浓缩后固体加入水搅拌，过滤后的固体为化合物2’。
本发明优选的，收集二氯甲烷层后，还包括：加活性炭脱色、过滤，收集滤液，滤液浓缩后固体加入水搅拌，过滤后的固体为化合物2’。
本发明优选的，所述步骤D)中的催化剂为N-羟基邻苯二甲酰亚胺、过氧化苯甲酰化和四水合醋酸钴。
本发明优选的，所述步骤E)中的催化剂为钯碳。
与现有技术相比，本发明提供了保藏编号为CCTCC NO：M 2020987的诱变菌种在制备脱氧胆酸中的应用。本发明提供了一种新的以植物甾醇为原料，通过生物发酵与化学合成相结合的手段，制备脱氧胆酸的方法，该方法未使用动物源提取，可以以工业废水废渣为原料，绿色环保；通过分支杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805诱变菌种生物发酵的方法在植物甾醇侧链一步构建胆酸类化合物的羰基侧链，操作简单，收率高，异构体杂质少，有机溶剂使用量少；通过本发明制备脱氧胆酸类化合物，反应试剂简单易得，反应条件温和，反应收率高，适合工业化大生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的化合物1的碳谱图；
图2为本发明实施例1制备的化合物1的氢谱图；
图3为本发明实施例7制备的脱氧胆酸的碳谱图；
图4为本发明实施例7制备的脱氧胆酸的氢谱图。
生物保藏说明
分类命名：Mycobacterium sp.MT-0265，于2020年12月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020987。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的从植物甾醇制备脱氧胆酸的方法进行详细描述。
以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
本发明实施例所采用的原料及其他化学试剂皆为市售商品。
实施例1化合物1的制备
一 原始菌种转化
1菌种
Mycobacterium sp.NRRL B-3805
2转化工艺
2.1种子培养
一级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.06％，pH＝7.5,100毫升培养基装入500毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从斜面接种，200rpm,30℃培养48小时。
二级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.06％，pH＝7.5,500毫升培养基装入2000毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从一级摇瓶接种，接种量10％，200rpm,30℃培养48小时。
2.2转化
10升发酵罐，装样7升，培养基：豆甾醇20g/L，大豆油160g/L，玉米浆60g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，调pH＝8.0,121℃，灭菌30分钟，冷却到30℃，接种，接种量20％。
转化控制：转速400rpm，空气流量0.2Nm3/h,罐压0.05MPa。
转化约120小时，转化结束，用磷酸调pH至5.0～6.0，加热到80℃，搅拌1小时，静置2小时，分层。
2.3后处理
分层得到的油层，加入甲醇提取三次，每次用油层3倍体积的甲醇，减压浓缩干溶剂，加入豆甾醇0.4倍量的乙酸乙酯50℃回流打浆2小时，冷却到30℃，过滤。
滤液50℃减压浓缩干，加入100毫升氯仿，500毫升水，用氢氧化钠调pH至12～13，常温快速搅拌反应2小时，静置4小时，分层。
分层得到的水相用盐酸调pH至1.0，搅拌30分钟，分层。得到黄色油状物。
得到的油状物加入100毫升乙酸乙酯，5克活性炭，常温搅拌2小时，过滤除炭，减压浓缩，得到1.5克淡黄色油状物，其中含有11.2％浓度的化合物1。
二 菌种诱变及转化
1.1菌体诱变育种
1.2菌种培养
种子培养基：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，pH＝7.5。
固体培养基：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，琼脂粉20g/L，pH＝7.5。
接一环生长良好的斜面种子在装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中活化，30℃，200rpm摇床振荡培养48h；取活化好的一级液体种子10ml，接入装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中进行二级种子培养，30℃，200rpm摇床振荡培养48h。
菌悬液制备：将生长好的二级种子装入10ml离心管中10000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体，用pH6.0的磷酸钾缓冲液离心洗涤两次，再用无菌磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)制成菌悬液，并将浓度稀释至108-109个/ml。1.3亚硝基胍(NTG)诱变处理
取上述菌悬液2ml，0.1mol/L亚硝基胍溶液1ml，0.2mol/L pH＝6.0的磷酸钾缓冲液2ml，加入离心管中，充分混匀，立即置于30℃水浴分别振荡(避光条件下)处理0、10、15、20、25、30、35分钟后，离心收集菌体，用PBS冲洗3次以去除NTG残留，最后向离心管中加入5ml无菌生理盐水，摇匀后取出一定的菌悬液，用生理盐水稀释至一定浓度备用。取100μL上述菌悬液涂布到固体平板培养基上，30℃避光培养，并计算致死率。
致死率＝(0s时的菌落数-不同诱变时间的菌落数)/0s时的菌落数*100％
经计算得出，0、10、15、20、25、30、35分钟平均致死率分别为:0、17.2％、30.4％、45.1％、68.1％、89.7％、95.3％。当致死率在80％时，细菌诱变效果最好，因此30min为最佳处理时间。
将30min作为试验中最佳诱变时间，按上述方法对出发菌株的菌悬液进行诱变处理，在1200个单菌落中选出生长良好的单菌落，用将筛选出的突变菌株和出发菌株进行植物甾醇生物转化，检测其中化合物1生成量。
按照“一、原始菌种转化”中的转化工艺，使用诱变得到的菌种Mycobacteriumsp.-091(CCTCC NO：M 2020987)，豆甾醇投料140克，得到淡黄色膏状物5.1克，其中化合物1含量71.2％。
化合物1的碳谱和氢谱图见图1和图2。
13C NMR(101MHz,DMSO)δ198.44,171.48,123.60,55.81,53.65,42.45,38.60,35.60,35.41,35.26,34.07,32.49,32.15,28.05,24.23,21.05,18.58,17.35,12.24.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.94(s,1H),5.62(s,1H),3.32(s,1H),2.50(dt,J＝3.5,1.7Hz,2H),2.47–2.32(m,2H),2.32–2.03(m,4H),1.97(dd,J＝22.1,11.8Hz,2H),1.79(d,J＝2.8Hz,2H),1.72–1.21(m,11H),1.14(s,3H),0.99(ddd,J＝16.9,12.1,7.3Hz,2H),0.88(d,J＝6.2Hz,3H),0.68(s,3H).
实施例2化合物2的制备
1、种子培养
(1)斜面培养
采用赭曲霉Aspergillus ochraceus ATCC 18500为生产菌种，将保存的菌株在斜面上划线接种，30℃培养6-7天，所述斜面培养基为土豆培养基：土豆块200g/L(煮沸30分钟，四层纱布过滤取滤液)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH6.5.
(2)种子培养
孢子悬液制备：取一支培养6-7天新鲜斜面，用0.05％吐温-80无菌水将斜面孢子洗下，制成孢子悬液，镜检计数孢子浓度为2～3×107个/ml；
摇瓶种子培养：接种量10％，30℃，180rpm培养36～48h。
所述种子培养基组分如下：玉米浆10g/L，葡萄糖30g/L；pH值7.2±0.2。
121℃高压蒸汽灭菌30min，冷却到室温备用。
2、转化
(1)培养基配方：玉米浆10g/L，葡萄糖30g/L；pH值7.2±0.2.
(2)菌体预培养：10升发酵罐，发酵液体积7升，121℃灭菌30分钟，冷却至室温。接种，接种量5％，培养16小时。
(3)转化：火圈保护下，将预处理好的底物70克加入到培养好的菌液中，开始转化。转化参数：空气流量0.4m3/h，转速300rpm，罐压0.05MPa。转化时间：72小时，转化率90.22％。
底物预处理方法：70克化合物1，加入200毫升无菌水，加热到80℃，灭活1小时。
3、后处理
发酵转化完毕，80℃灭活，冷却到25℃，抽滤。滤饼层加入底物量5倍体积的二氯甲烷，常温搅拌30分钟，过滤，滤饼用2倍体积的二氯甲烷搅拌提取并抽滤干。收集二氯甲烷滤液，减压浓缩干溶剂，加少量水，常温搅拌均匀，抽滤，弃滤液，收滤饼，滤饼50℃烘干，得到淡黄色粗品。
粗品精制
向粗品中加入2倍体积的甲苯，升温到60℃，搅拌2小时，趁热过滤，得到40.2克左右类白色固体，主要成分为化合物2，液相检测，其中化合物2含量为96.75％，化合物1含量为1.22％。
实施例3化合物2’的制备
1菌种
菌种名称：Mycobacterium smegmatis NK-XHX-118保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013544。
2转化工艺
2.1种子培养
一级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.06％，pH＝7.5,100毫升培养基装入500毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从斜面接种，200rpm,30℃培养48小时。
二级种子：酵母膏粉10g/L，葡萄糖15g/L,硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.06％，pH＝7.5,500毫升培养基装入2000毫升摇瓶，121℃灭菌30分钟。冷却后从一级摇瓶接种，接种量10％，200rpm,30℃培养48小时。
2.2转化
10升发酵罐，装样7升，培养基：植物甾醇10g/L，玉米浆60g/L，硝酸钠5.4g/L，磷酸氢二铵0.6g/L，调pH＝8.0,121℃，灭菌30分钟，冷却到30℃，接种，接种量20％。
转化控制：转速400rpm，空气流量0.2Nm3/h,罐压0.05MPa。
转化约48～72小时，转化结束，加热到80℃，保温30分钟灭活，冷却到30℃。
2.3后处理
水层用盐酸调pH到1～2，加入二氯甲烷萃取2次，每次加入0.5体积的二氯甲烷，搅拌萃取1小时，静置2小时，分层。分出下层二氯甲烷，加入0.1W活性炭，常温搅拌脱色2小时，过滤，减压浓缩干溶剂，加入少量水搅拌均匀，抽滤，得淡黄色固体71克，主要成分为化合物2’，经过液相检测，目标产物的归一含量为96.1％。
实施例4化合物3的制备
氮气保护下，于反应瓶加入20g化合物2’，加入80g乙酸酐，升温至40℃，加入2g浓硫酸，反应约0.5-1小时，监控原料反应完全，降温，加反应液转移至400ml冰水水析，搅拌1-2小时过滤，滤饼烘干，得化合物3，收率94.3％，纯度98.6％。
实施例5化合物4的制备
于反应瓶加入15g化合物3，100ml环己酮，4.5gN-羟基邻苯二甲酰亚胺，0.0375g过氧化苯甲酰化，0.0375g四水合醋酸钴，升温至50-60℃，鼓入空气反应，待反应完全，浓缩除去环己酮，加入300ml二氯甲烷，过滤除去催化剂，加入三乙胺，醋酐，于20-30℃反应10h，反应完全加入甲醇淬灭，浓缩，加入乙酸乙酯置换出料，烘干得化合物4，收率53.6％，纯度99.2％。
实施例6化合物5的制备
氮气保护下，在反应瓶中加入8g化合物4，40ml四氢呋喃和40ml无水乙醇，0.8g吡啶。搅拌下溶清，然后加入0.8g 10％Pd/C。将体系先用氮气置换，然后用氢气置换，最后氢化常压反应至完全。反应完成后将体系用氮气将氢气置换干净，过滤掉钯炭。滤液转移至反应釜浓缩至粘稠状态，硅胶柱层析，梯度洗脱，二氯甲烷：甲醇＝30:1～15:1，合并纯品，烘干，得化合物5，收率91.1％，纯度99.6％。
实施例7脱氧胆酸的制备
氮气保护下，于反应瓶加入5g化合物5，50ml四氢呋喃，5ml水，分批加入1.4g硼氢化钠，反应完成。滴加10％盐酸溶清，浓缩四氢呋喃，降温过滤，滤饼烘干，加入乙腈和四氢呋喃混合溶剂重结晶，降温过滤，烘干得去氧胆酸，收率85％，纯度99.1％。
脱氧胆酸的碳谱和氢谱图见图3和图4。
13C NMR(101MHz,MeOD)δ176.95,72.64,71.17,46.75,46.20,42.26,36.08,35.83,35.34,35.11,33.94,33.44,30.97,30.75,29.69,26.11,23.52,22.40,16.25,11.89.
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.95(s,1H),3.52(s,1H),2.51–2.11(m,2H),2.03–1.69(m,7H),1.70–1.22(m,14H),1.13(dd,J＝27.3,11.5Hz,2H),1.00(d,J＝5.6Hz,4H),0.93(s,3H),0.71(s,3H).
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。