1,3-β-D葡聚糖衍生物、试剂盒及制备方法及测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法
阅读说明：本技术 1,3-β-D葡聚糖衍生物、试剂盒及制备方法及测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法 (1, 3-beta-D glucan derivative, kit, preparation method and method for determining content of 1, 3-beta-D glucan ) 是由 鲁衡 高燕 孙金超 石云齐 于 2020-11-25 设计创作，主要内容包括：1,3-β-D葡聚糖衍生物、试剂盒及制备方法及测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法。本发明提供一种结合了磁微粒分离技术、生物素-亲和素放大技术和化学发光分析技术的1,3-β-D葡聚糖磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。同时用1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物制备了生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物和酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物,这样就构建了2个体系(1、生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物+抗体酶标试剂+定标液；2、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物+生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗+定标液)可以进行样本中1,3-β-D葡聚糖的测试,这样不同企业在开发试剂盒时就会有更灵活的选取,并且只需要通过制备1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物这个中间体就能实现。(1, 3-beta-D glucan derivative, kit and preparation method thereof, and method for determining content of 1, 3-beta-D glucan. The invention provides a 1, 3-beta-D glucan magnetic particle chemiluminescence immunoassay kit combining a magnetic particle separation technology, a biotin-avidin amplification technology and a chemiluminescence analysis technology. Meanwhile, the 1, 3-beta-D glucan antigen derivative and the enzyme-labeled 1, 3-beta-D glucan antigen derivative are prepared by using the 1, 3-beta-D glucan antigen derivative, so that 2 systems (1, biotinylation 1, 3-beta-D glucan antigen derivative, an antibody enzyme-labeled reagent and a calibration solution; 2, enzyme-labeled 1, 3-beta-D glucan antigen derivative, biotinylation 1, 3-beta-D glucan mouse monoclonal antibody and the calibration solution) are constructed, the 1, 3-beta-D glucan in a sample can be tested, and different enterprises can select the kit more flexibly during development and can realize the test only by preparing the intermediate of the 1, 3-beta-D glucan antigen derivative.)
技术领域
本发明属于生物化学检测领域，更具体的涉及一种1,3-β-D葡聚糖衍生物及其制备方法以及采用磁微粒化学发光法，测定1,3-β-D葡聚糖含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
1,3-β-D葡聚糖是一种多糖，广泛存在于除接合菌外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁成分的50％以上，是真菌细胞壁上的特有成分。真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，1,3-β-D葡聚糖可从细胞壁释放，使血液及其他体液中含量增高；而在浅部真菌感染时，1,3-β-D葡聚糖未被释放，故其在体液中的含量不增高，可通过对血液或非血液标本中1,3-β-D葡聚糖的检测，了解机体是否感染侵袭性真菌。
1,3-β-D葡聚糖目前主要检测方法为鲎试剂检测法，即俗称的G试验法，原理如下：实验时在标本中加入鲎试剂，其中的G因子被1,3-β-D葡聚糖激活，成为活化G因子，它使凝固酶原变成凝固酶，从而使凝固蛋白原变成凝固蛋白，标本就好有浊度，凝固越多透光率越差，再通过测定标本的透光率就可以测得标本中1,3-β-D葡聚糖的含量。但是鲎试剂法特异性不高，而且对于反应条件比较苛刻，例如实验室要求洁净无尘埃流通、反应最适pH值为6-8、反应结果受温度及反应时间长短影响很大。因此，针对上述缺点，免疫检测方法开始广泛应用于检验科，就是通过抗原抗体的特异性结合来判断待检测物是否存在的方法。
免疫法检测方便快速，对检测环境和反应条件要求不高，且特异性极强，灵敏度也要高于鲎试剂法。目前1,3-β-D葡聚糖免疫检测主要为elisa法，即通过显色的方法判断样本中待测物含量的高低，但由于elisa反应抗原抗体包被的量受96孔板限制，且抗原抗体反应在一个近似二维的平面上，因此，反应速度慢，完全反应时间长。另外，最终信号是基于颜色深浅的计算，色深有一定的限制。因此，elisa法测试低浓度和高浓度样本时灵敏度和线性略有不足。在临床检验上针对低值样本很可能出现假阴性的检测结果，针对高值样本可能出现测值不准的情况。
磁微粒化学发光法，可以通过对磁珠-抗体-抗原复合物的清洗降低样本中其他成分非特异性吸附的影响，有效提高灵敏度。其次，磁微粒是纳米级别，比表面积很大，反应速度就比较快，时间短。再次，由于发光是检测的光子数，因此对低浓度和高浓度样本检测不是色深可以比的，所以检测范围可以扩大很多。
通过上述比较，不难看出用磁微粒化学发光法检测1,3-β-D葡聚糖是比较合适的方法。但是，由于1,3-β-D葡聚糖本身不含可以用于偶联生物素和碱性磷酸酶的氨基，因此，需要先将其与含有氨基的化合物偶联制备成衍生物，然后再通过包被和标记制备试剂盒。鉴于国内化学发光大多数采用碱性磷酸酶(ALP)或者辣根过氧化物酶(HRP)的发光系统(酶促化学发光)，而固相有些公司采用生物素-链霉素亲和素磁微粒、FITC-抗FITC磁珠体系，有些公司采用磁珠直接包被的系统。在这种情况下，我们就需要1,3-β-D葡聚糖衍生物上的基团既可以偶联生物素、FITC或者磁珠等用于磁微粒体系的固相偶联，又可以偶联酶(ALP或HRP)等用于发光标记，极大的提升了建立反应体系的灵活性。因此，发明一种既可用于固相偶联，又能用于发光标记的1,3-β-D葡聚糖衍生物对开发1,3-β-D葡聚糖试剂盒来说是关键。
发明内容
为了解决背景技术中存在的问题，克服现有1,3-β-D葡聚糖试剂盒不能既可用于固相偶联，又能用于发光标记的1,3-β-D葡聚糖衍生物的缺陷，本技术方案最大的特点是提供了一种1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物及其制备方法，通过制备衍生物，可以根据需要灵活地将1,3-β-D葡聚糖抗原与生物素或者酶间接地连接，解决了开发此项目的关键问题即偶联问题，可以方便地建立1,3-β-D葡聚糖的磁微粒酶促化学发光体系。
本发明的技术解决方案是：
一种1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物的其制备方法，步骤为：
P1：将1,3-β-D葡聚糖和琥珀酸酐分别用DMF缓冲液进行溶解，得到1,3-β-D葡聚糖-DMF溶液和琥珀酸酐-DMF溶液；
P2:将1,3-β-D葡聚糖-DMF溶液加入琥珀酸酐-DMF溶液，65℃反应6h；反应完毕后加入三丁胺和氯甲酸异丁酯，室温反应30min，得到1,3-β-D葡聚糖-琥珀酸酐的DMF溶液；加入赖氨酸溶液，室温反应3h；
P3：将反应物用水透析过夜，调节PH值析出沉淀，然后将沉淀室温放置1h，4℃放置3h，在4℃离心10-15min，用Na2CO3缓冲液溶解沉淀，得到1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物。
一种1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，所述的衍生物由上述方法制得。
一种测定1,3-β-D葡聚糖含量的试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、抗体酶标试剂、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗、定标液、质控品。该试剂盒的制备方法如下：
(1)生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物的制备步骤如下：
通过1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物分子量(605)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素-NHS，将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，加入1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物中，充分混匀后室温反应2h；用透析袋透析反应产物；用缓冲液将透析产物稀释至工作液浓度。
(2)抗体酶标试剂的制备过程：
将1,3-β-D葡聚糖鼠单抗和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应18h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液配置成工作液浓度；进一步的1,3-β-D葡聚糖鼠单抗采用0.1*的PBS进行透析，然后用2IT进行活化，得到活化后的抗体；碱性磷酸酶用SMCC进行活化，得到活化后的碱性磷酸酶。
(3)酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物的制备过程：
将权利要求2所述的1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物和碱性磷酸酶分别活化后，将二者混合2-8℃反应18h小时；将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后用缓冲液配置成工作液浓度；进一步的1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物采用0.1*的PBS进行透析，然后用2IT进行活化，得到活化后的抗原。碱性磷酸酶用SMCC进行活化，得到活化后的碱性磷酸酶。
(4)生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗的制备过程：
通过1,3-β-D葡聚糖鼠单抗分子量(150000)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素-NHS，将生物素-NHS用DMSO进行溶解后，加入1,3-β-D葡聚糖鼠单抗中，充分混匀后室温反应2h，用透析袋透析反应产物，用缓冲液将透析产物稀释至工作液浓度。
(5)分装上述生物素1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，抗体酶标试剂、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗、定标液和质控品。
一种测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法，其特征在于，步骤如下：
P1：取样本、定标液、质控品15μl，加入生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物30ul，加入抗体酶标试剂30μl，孵育15min；
P2：向P1步骤中加入链霉素亲和磁珠30μl，孵育5min；
P3:磁分离2min，去上清；
P4:洗涤3次，每次300μl洗液；
P5:加入底物200μl，测值。
进一步的，所述磁珠为链霉亲和素磁珠。
一种测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法，其特征在于，步骤如下：
P1:取样本、定标液、质控品15μl，加入酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物30μl，加入生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗30μl，孵育15min；
P2：向P1步骤中加入链霉素亲和磁珠30μl，孵育5min；
P3:磁分离2min，去上清；
P4:洗涤3次，每次300μl洗液；
P5:加入底物200μl，测值。
进一步的，所述磁珠为链霉亲和素磁珠。
本发明的目的是提供一种结合了磁微粒分离技术、生物素-亲和素放大技术和化学发光分析技术开发了一种简便、稳定、特异性高的1,3-β-D葡聚糖磁微粒化学发光免疫检测试剂盒。
本发明同时用1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物制备了生物素1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物和酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，这样就构建了2个体系(1、生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物+酶标1,3-β-D葡聚糖鼠单抗+定标液；2、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物+生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗+定标液)可以进行样本中1,3-β-D葡聚糖的测试。对于企业来讲，由于酶促发光体系需要对各个抗试剂组分进行优化，不同情况下可能需要对1,3-β-D葡聚糖抗原进行生物素、酶标甚至蛋白等不同情况的偶联，这样不同企业在开发试剂盒时就会有更灵活的选取，并且只需要通过制备1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物这个中间体就能实现。
本发明的优点：
本发明相对于的鲎试剂法及酶免方法，优点如下：整个反应体系克服了鲎试剂特异性不高，而且对于反应条件比较苛刻的缺点，继承了酶免法特异性高的优点，同时改善了酶免法灵敏度低，线性范围窄的缺点，简化了实验操作流程。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅做示例说明。其中使用的试剂盒、缓冲液等试剂仅仅为该具体实施例中具体选择的试剂，应理解，本领域技术人员可根据需要选择其他公司的相应试剂以实现本发明的目的。
实施例
一种1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，所述的1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物制备步骤为：
1)配制0.1M的HCl溶液；
2)分别配制PH＝9.0的0.01M和PH＝9.5的0.15M的NaHCO3缓冲液；
3)称量约10mg的1,3-β-D葡聚糖，并用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)缓冲液溶解至10mg/mL；
4)称量琥珀酸酐50mg用10ml DMF溶解至5mg/mL；
5)称量赖氨酸20mg用1mL PH＝9.0的0.01MNaHCO3缓冲液溶解至20mg/mL；
6)取0.5mL1,3-β-D葡聚糖-DMF溶液加入到10mL琥珀酸酐-DMF溶液中，65℃反应6h；
7)反应完毕后加入1.2mL三丁胺，0.65mL氯甲酸异丁酯，室温反应30min；
8)将1mL浓度20mg/mL的赖氨酸溶液加入到之前反应完成的1,3-β-D葡聚糖-琥珀酸酐的DMF溶液中，室温反应3h；
9)将反应物用水透析过夜(透析分子量为500)；
10)将透析液用0.1MHCl调节PH至4.8-5.1，使溶液产生最多沉淀，将沉淀放置室温1h，4℃3h；
11)将沉淀在4℃离心10-15min，用PH＝9.5的0.15M的Na2CO3缓冲液溶解沉淀至2mg/mL。
一种测定1,3-β-D葡聚糖含量的试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、抗体酶标试剂、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗、定标液和质控品。该试剂盒的制备方法如下：
所述试剂盒中主要组分按照如下制备方法制得：
(1)生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物制备步骤如下：
1)量取0.5ml1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物(1mg)；
2)通过抗原分子量(605)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素(19.4mg)；
3)称取19.4mg左右的生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为30mg/mL；
4)在抗原中加入DMSO溶解的生物素，充分混匀后室温反应2h；
5)用截留分子量为1000的透析袋透析步骤4)中的反应产物，透析缓冲液为PH＝9.0的0.1M的NaHCO3缓冲液；
6)用抗试剂缓冲液将混合物稀释至0.5μg/ml作为工作液使用。
(2)抗体酶标试剂，制备步骤如下：
1)将0.5mg1,3-β-D葡聚糖鼠单抗用0.1*PBS进行透析，然后用2IT进行活化；
2)将0.5mg碱磷酶用SMCC进行活化；
3)将活化后的1,3-β-D葡聚糖鼠单抗和活化后的碱磷酶进行混合，2-8°反应18小时；
4)将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后；
5)用抗试剂缓冲液将抗体-碱磷酶稀释至0.1μg/ml作为工作液；
(3)酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，制备步骤如下：
1)将0.5mg1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物用0.1*PBS进行透析，然后用2IT进行活化；
2)将0.5mg碱磷酶用SMCC进行活化；
3)将活化后的1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物和活化后的碱磷酶进行混合，2-8°反应18小时；
4)将反应物用层析柱进行纯化，收集I峰II峰进行混合后；
5)用抗试剂缓冲液将1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物-碱磷酶偶联物稀释至0.3μg/ml作为工作液；
(4)生物素化1,3-β-D葡聚糖抗体，制备步骤如下：
1)量取0.5mg1,3-β-D葡聚糖鼠单抗；
2)通过抗体分子量(150000)和生物素-NHS分子量(587)进行计算，按照摩尔比1：20的投料量称量生物素；
3)称取1mg左右的生物素-NHS，并用DMSO进行溶解至终浓度为20mg/ml；
4)在抗体中加入DMSO溶解的生物素0.04mg，充分混匀后室温反应2h；
5)用截留分子量为10000的透析袋透析步骤4)中的反应产物，透析缓冲液为PH＝9.0的0.1M的NaHCO3缓冲液；
6)用抗试剂缓冲液将1,3-β-D葡聚糖鼠单抗-生物素偶联物稀释至0.5μg/ml作为工作液使用。
(5)定标液和质控品的制备，制备步骤如下：
1)配制1,3-β-D葡聚糖定标液缓冲液：0.05M的PH＝7.4的PBS缓冲液中加入5％的BSA，0.1％防腐剂。
2)将1,3-β-D葡聚糖抗原用定标液缓冲液进行稀释，配制0.5ng/mL的定标点。
3)用牛血清做为缓冲液配制浓度为0ng/mL和3ng/mL的浓度点作为质控品。
(6)分装上述生物素1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物，抗体酶标试剂、酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物、生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗、定标液和质控品。
一种测定1,3-β-D葡聚糖含量的方法，步骤如下：
P1：取样本、定标液或质控品15μl，加入生物素化1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物30ul，加入如权利要求3-6所述的抗体酶标试剂30μl，孵育15min；
P2：向P1步骤中加入链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；
P3:磁分离2min，去上清；
P4:洗涤3次，每次300μl洗液；
P5:加入底物200μl，测值。或者采用如下方法进行检测：
P1:取样本、定标液、质控品15μl，加入酶标1,3-β-D葡聚糖抗原衍生物30μl，加入如权利要求3-6所述的生物素化1,3-β-D葡聚糖鼠单抗30μl，孵育15min；
P2：向P1步骤中加入链霉亲和素磁珠30μl，孵育5min；
P3:磁分离2min，去上清；
P4:洗涤3次，每次300μl洗液；
P5:加入底物200μl，测值。
为了检验这2种体系下对样本测值的差异，我们在这2种体系下分别测试了同一组样本，并与给值进行了比对，数据如下表所示：
表1不同体系下测值与给值对比以及测值之间对比
由结果可以看出，如果给值<1是阴性，>1是阳性，对比系统与体系1、对比系统与体系2和体系1与体系2之间的给值和测值相比，阴性和阳性结果符合率为100％。不同体系测值与给值符合率都是100％，说明2种体系测值一致。因此，本发明的技术方案完全可行，且灵活性更大。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种羧甲基壳聚糖衍生物及其制备方法