一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法
阅读说明：本技术 一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法 (Method for improving aerobic stability of silage ) 是由 王加友 王远 孙丽娟 杨德玉 李小明 焦姣 董常鹏 于 2020-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明属于青贮饲料制备技术领域,涉及一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法。将青贮饲料发酵剂种于培养基中在厌氧条件下培养至体系pH为3.95-4.45,且体系内乳酸浓度/乙酸浓度比值为9.69～13.25,将所得培养液离心,收集沉淀将其接种至青贮原料发酵成青贮饲料,即可提高青贮饲料有氧稳定性。本发明通过控制青贮饲料接种培养物的产酸量,乳酸、乙酸的含量及比例,使乳酸浓度/乙酸浓度比值在的比例在9.69-13.25之间,进而在制备青贮饲料过程中可以有效抑制霉菌、酵母菌的生长,大幅度的提高青贮饲料的有氧稳定性,可将开窖后青贮饲料的储存时间延长至40d以上,而且可以提高青贮饲料感官评价评分,改善青贮饲料的品质。(The invention belongs to the technical field of silage preparation, and relates to a method for improving aerobic stability of silage. The silage starter is cultured in a culture medium under an anaerobic condition until the pH value of a system is 3.95-4.45 and the ratio of the concentration of lactic acid to the concentration of acetic acid in the system is 9.69-13.25, the obtained culture solution is centrifuged, and the obtained culture solution is collected, precipitated and inoculated to silage raw materials to be fermented into silage, so that the aerobic stability of the silage can be improved. The invention controls the acid yield of the silage inoculation culture, the content and the proportion of the lactic acid and the acetic acid, so that the ratio of the lactic acid concentration to the acetic acid concentration is 9.69-13.25, the growth of mould and yeast can be effectively inhibited in the silage preparation process, the aerobic stability of the silage is greatly improved, the storage time of the silage after opening the pit can be prolonged to more than 40d, the sensory evaluation score of the silage can be improved, and the quality of the silage is improved.)
技术领域
本发明属于青贮饲料制备技术领域，涉及一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法。
背景技术
青贮是通过利用青贮材料中乳酸菌厌氧发酵，使原料产生有机酸，降低pH值，抑制和杀死各种有害微生物的繁衍，从而达到保存饲料长时间使用的一种贮藏方式。青贮生物饲料是反刍动物重要的饲料来源，青贮饲料能有效保存青贮植物的营养成分，保证原料青绿时的鲜嫩汁液，质地柔软，适口性好，消化率高等优点，是反刍动物(如牛、羊等)的重要的饲料来源。青贮可发生在筒仓、青贮饲料堆、青贮饲料窖、青贮饲料捆、或适于所选植物材料青贮的任何其它方法中。
青贮是解决青饲料不易贮藏的一个有效而经济的方法。但是，自然状态下青贮比较困难，目前普遍采用添加菌剂青贮，通过在青饲料中加入植物乳杆菌、布氏乳杆菌、短乳杆菌、戊糖片球菌等菌株，加快青贮的发酵速度，进而提高青贮饲料的品质。CN106615609B“公开了所提供的布氏乳杆菌可以增加苜蓿及粳稻秸青贮发酵品质，降低蛋白质损失，增加青贮饲料有氧稳定性；专利所述的有氧稳定性时间为最长为422h，有氧稳定性时间较短，不利于对青贮饲料的储存。
CN 106103697 B公开了一种用于处理青贮饲料以增强有氧稳定性的方法，所述方法通过抑制选自酵母、霉菌和孢子形成细菌的微生物的生长提高青贮饲料的发酵和稳定性，并且允许较早的有氧暴露，该发明有氧稳定性时间为30d。该专利中使用的菌种为布氏乳杆菌或短乳杆菌，专利中没有提及菌株筛选评价方法，
CN 106028829 B提供了一种用于处理青贮饲料的方法，其包括将青贮饲料接种剂加入青贮饲料中，所述青贮饲料接种剂能有效防止或降低有氧酸败。该发明中提及的青贮饲料有氧稳定性时间73.05h，有氧稳定性较差，影响青贮饲料开窖后的品质。
上述各方法，虽然能够一定程度上的提高相应的有氧稳定性，但青贮饲料的有氧稳定性时间较短，影响青贮饲料开窖后饲料的品质，不利于青贮饲料的长期储存，进而需要提供一种延长有氧稳定性的方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为为：
一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法，将青贮饲料发酵剂种于培养基中在厌氧条件下培养至体系pH为3.95-4.45，且体系内乳酸浓度/乙酸浓度比值为9.69～13.25，将所得培养液离心，收集沉淀将其接种至青贮原料发酵成青贮饲料，即可提高青贮饲料有氧稳定性。
所述青贮饲料发酵剂接种于培养基中在厌氧条件下培养至体系pH为3.95-4.45，且体系内乳酸浓度/乙酸浓度比值为9.69～13.25，丙酸浓度在小于等于0.92g/L，将所得培养液离心，收集沉淀将其按以1×105cfu/g～5×105cfu/g(青贮饲料)接种至青贮原料中，发酵成青贮饲即可提高青贮饲料有氧稳定性。
所述培养基为改良的MRS培养基。
所述改良的MRS培养基配方为：蛋白胨10.0-20g/L，牛肉膏10.0-16g/L，酵母粉5.0-8.8g/L，葡萄糖20.0-30g/L，乙酸钠2.8-8.6g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，MnSO4·4H2O 0.05g/L，吐温-801mL，pH 6.2～6.4。
所述青贮饲料发酵剂培养后，培养物的细胞数达到5×108cfu/mL-4×109cfu/mL，且发酵液的pH值达到3.95-4.45，乳酸浓度/乙酸浓度比值为9.69～13.25，丙酸浓度在小于等于0.92g/L。
所述青贮饲料原料为全株玉米、不带穗玉米秸秆、苜蓿，也适用于其他可以青贮的其他秸秆类植物。
所述青贮饲料发酵剂为乳酸菌和/或青贮饲料培养物。
所述乳酸菌为布氏乳杆菌、短乳杆菌、棒状乳杆菌、希氏乳杆菌、乳脂明串球菌中的一种或几种。
本发明的优点与积极效果为：
本发明通过控制青贮饲料接种培养物的产酸量，乳酸、乙酸的含量及比例，使乳酸浓度/乙酸浓度比值在的比例在9.69-13.25之间，进而在制备青贮饲料过程中可以有效抑制霉菌、酵母菌的生长，大幅度的提高青贮饲料的有氧稳定性，可将开窖后青贮饲料的储存时间延长至40d以上，而且可以提高青贮饲料感官评价评分，改善青贮饲料的品质。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
下述青贮饲料有氧稳定性测定：青贮发酵结束后，每个处理组随机取3处保存完好的青贮饲料，混匀后取样，取混匀后的饲料800～1000g置于大的塑料封口袋中，直至塑料袋装满，用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，用50℃的普通温度计测定温度变化。样品都置于阴暗处，环境温度根据实际情况确定，温度变化每4h记录1次，当青贮物料的温度超过环境温度2℃时为止。试验中的温度计、牙签等用具使用前均须紫外灭菌。
pH值测定：青贮完成后，打开上述密封袋，分别将各组的青贮饲料混合均匀，准确称取20克青贮饲料，加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，用组织捣碎机搅碎1min静置沉淀，然先后用四层纱布和定性滤纸过滤，滤出草渣得到浸出液，用pH计直接测定浸出液的pH值即青贮饲料的pH值。
高效液相测定有机酸含量的方法：设备型号Agilent 1260，色谱柱Agilent SB-C18；液相条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.08％的磷酸溶液，A:B＝5：95；检测波长200nm，流速0.7mL/min；上样量10μL。
实施例1
取市售青贮玉米秸秆20g，放置于的500mL的三角瓶中(瓶中含180mL无菌水)，密封，置于摇床上以150r/min摇动2h，吸取1mL上清液加入到9mL无菌水中，漩涡振荡，而后利用无菌水进行稀释，稀释成10-4、10-5、10-6、10-7等4个梯度，分别取4个梯度的菌液100μL涂布于改良的固体MRS平板培养基上，30℃厌氧培养48-72h，根据菌落颜色、大小、光泽、是否有透明圈等挑取单菌落，将挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，30℃恒温厌氧培养24-60h，按上述方式重复划线分离培养3次，直至培养物形态单一，即获得纯的培养物。
将该纯培养物，转接至改良的MRS培养基中培养24h后测定发酵液中的pH为4.45，并利用高效液相色谱法测定发酵液中有机酸，该培养物乳酸含量为6.89g/L，乙酸含量为0.52g/L，丙酸为0.36g/L，无丁酸产生，乳酸浓度/乙酸浓度比值为13.25。高效液相测定有机酸含量的方法：设备型号Agilent 1260，色谱柱Agilent SB-C18；液相条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.08％的磷酸溶液，A:B＝5：95；检测波长200nm，流速0.7mL/min；上样量10μL。
挑取该培养物使用改良的MRS液体培养基培养24h，菌落数可达到1.5×109cfu/mL(通过涂布平板菌落计数)，离心收集菌体，待用，用于制备玉米青贮试验。
制备青贮饲料：将该纯培养物接种至玉米秸秆中，具体为：全株玉米于蜡熟期收获切碎至1-3cm长，并将上述离心后获得纯培养物按试验设计用量2×105cfu/g秸秆溶于500g去离子水中，用喷雾器均匀的喷洒在50kg切碎的全株玉米上，并搅拌均匀；装于青贮袋中，抽真空后封口储存于室温环境中，环境温度为22℃-28℃之间，青贮时间45d，试验后测定青贮秸秆的pH值及有氧稳定性，并进行感官评定。试验做3个平行。青贮完成后，青贮玉米秸秆为黄绿色，具有芳香酸味，外形湿润紧密，感官形象较佳；测定青贮玉米pH为3.89，有氧稳定性时间达到45d，大大延长了青贮饲料的储存周期。
实施例2
取市售青贮苜蓿20g，放置于的500mL的三角瓶中(瓶中含180mL无菌水)，密封，置于摇床上以150r/min摇动2h，吸取1mL上清液加入到9mL无菌水中，漩涡振荡，而后利用无菌水进行稀释，稀释成10-4、10-5、10-6、10-7等4个梯度，分别取4个梯度的菌液100μL涂布于改良的固体MRS平板培养基上，30℃厌氧培养48-72h，根据菌落颜色、大小、光泽、是否有透明圈等挑取单菌落，将挑取单菌落在MRS固体培养基上划线，30℃恒温厌氧培养24-60h，按上述方式重复划线分离培养3次，直至培养物形态单一，即获得纯的培养物。
将该纯培养物，转接至改良的MRS培养基中培养24h后测定发酵液中的pH为4.21，并利用高效液相色谱法测定发酵液中有机酸，其中乳酸含量为19.16g/L，乙酸含量为1.98g/L，无丙酸、丁酸产生，乳酸浓度/乙酸浓度比值为9.69。高效液相测定有机酸含量的方法：设备型号Agilent 1260，色谱柱Agilent SB-C18；液相条件：流动相A为乙腈，流动相B为0.08％的磷酸溶液，A:B＝5：95；检测波长200nm，流速0.7mL/min；上样量10μL。挑取该培养物使用改良的MRS液体培养基培养24h，培养温度为30℃，该菌株菌落数可达到2.5×109cfu/mL(通过涂布平板菌落计数)，离心收集菌体，待用，用于制备苜蓿青贮试验。
制备青贮饲料：以2年生、当年第2次刈割(8月份)的紫花苜蓿为青贮原料，刈割后，植株在阳光下萎蔫4h，切碎至1.0-1.5cm。将该纯培养物接种至苜蓿秸秆中，按试验设计用量5×105cfu/g苜蓿溶于500g去离子水中，用喷雾器均匀的喷洒在30kg切碎的苜蓿上，并搅拌均匀；装于青贮袋中，抽真空后封口储存于室温环境中，环境温度为22℃-28℃之间，青贮周期60d，试验后测定青贮苜蓿的pH值及有氧稳定性，并进行感官评定。试验做3个平行。青贮苜蓿，60d后测定pH为3.98，有氧稳定性时间达到42d，大大延长了青贮饲料的储存周期。
实施例3
将市售菌株棒状乳杆菌，在MRS培养基中培养20h后测定发酵液中的pH为3.95，发酵液中有机酸采用高效液相色谱法测定，其中乳酸含量为28.65g/L，乙酸含量为2.61g/L，丙酸为0.92g/L，无丁酸产生，乳酸浓度/乙酸浓度比值为10.98。此菌株使用MRS液体培养基培养20-24h，离心收集菌体，涂布平板菌落计数，该菌株菌落数可达到3.0×109cfu/mL。
青贮试验：全株玉米于蜡熟期收获切碎至1-3cm长，并将离心后的棒状乳杆菌菌体按试验设计用量1×105cfu/g秸秆溶于500g去离子水中，用喷雾器均匀的喷洒在50kg切碎的全株玉米上，并搅拌均匀；装于青贮袋中，抽真空后封口储存于室温环境中，环境温度为22℃-28℃之间，青贮周期45d，试验后测定青贮秸秆的pH值及有氧稳定性，并进行感官评定。试验做3个平行。45d测定青贮玉米的pH值为3.93，青贮玉米外观为黄绿色，有芳香酸味，感官评定较佳；有氧稳定性时间为41.3d，延长了青贮饲料的保质期。
对比例
将市售菌株布氏乳杆菌(保藏号：CGMCC1.15607)采用MRS培养基，在厌氧条件下，培养24h后测定发酵液的pH为4.41，并用高效液相色谱法测定发酵液中有机酸，乳酸浓度/乙酸浓度比值为13.26，其中乳酸含量为8.57g/L，乙酸含量为0.65g/L，丙酸为0.34g/L，无丁酸产生。该菌株使用改良的MRS液体培养基培养24h，涂布平板菌落计数，该菌株菌落数可达到1.3×109cfu/mL，离心收集菌体，用于制备玉米青贮试验。
制备青贮饲料：
全株玉米于蜡熟期收获切碎至1-3cm长，并将上述离心后的菌体按试验设计用量2×105cfu/g秸秆溶于500g去离子水中，用喷雾器均匀的喷洒在50kg切碎的全株玉米上，并搅拌均匀；装于青贮袋中，抽真空后封口储存于室温环境中，环境温度为22℃-28℃之间，青贮周期45d，试验后测定青贮秸秆的pH值及有氧稳定性，并进行感官评定。试验做3个平行。45d后测定青贮秸秆的pH为3.83，有氧稳定性时间为15.5d；青贮秸秆颜色为黄褐色，有浓的酸味，秸秆外观湿润，感官评价较好。
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