一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用
阅读说明：本技术 一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用 (Elicitin gene for inducing HR in pythium ultimum and application of expression vector thereof ) 是由 窦道龙 杨坤 景茂峰 李佳露 董小华 于 2020-12-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于基因工程技术领域,公开了一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用。本发明鉴定到来自终极腐霉菌(Pythium ultimum)的三个Elicitin类基因PYOD6、PYOD7和PYOD20,所述PYOD6、PYOD7和PYOD20基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—3所示。本发明从终极腐霉菌中鉴定到三个Elicitin类基因能够产生显著的HR反应,激发植物免疫。(The invention belongs to the technical field of genetic engineering, and discloses an Elicitin gene for inducing HR in pythium ultimum and application of an expression vector thereof. The invention identifies three Elicitin genes PYOD6, PYOD7 and PYOD20 from Pythium ultimum, wherein the nucleotide sequences of the PYOD6, the PYOD7 and the PYOD20 are respectively shown in SEQ ID NO. 1-3 in sequence. According to the invention, three elicidin genes identified from pythium ultimum can generate obvious HR reaction to stimulate plant immunity.)
技术领域
本发明书属于基因工程技术领域，具体涉及一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用。
背景技术
在植物与病原菌的长期协同进化过程中，病原菌为了更好地侵染植物，进化出大量的攻击寄主的武器，例如效应蛋白(effector)。病原菌分泌这些效应蛋白到植物体内为了促进其更好地侵染寄主植物，然而，伴随着植物的共同进化，有些效应蛋白会被植物自身进化的调控抗病相关的基因识别。对病原体的识别通常会触发局部抗性反应，称为超敏反应(HR)，其特征在于感染部位的快速细胞死亡。对于研究植物与病原菌互作而言，这一明显的HR反应也是作为激发植物免疫的重要信号。
终极腐霉菌(Pythium ultimum)是一种病原菌，能够广泛侵染大豆、菜豆、豌豆、甘薯、松苗、咖啡、苹果、柑橘、桃、棉花、菊花、大丽花、南瓜、西瓜、甘蔗、苜蓿、番茄等150余种经济植物，引起苗枯，猝倒、根腐、脚腐、枯萎等多种病害。我们通过大量筛选获得了三个来源于终极腐霉菌能够触发植物过敏性反应(HR)的基因。这三个基因都包含 Elicitin结构域，是典型的免疫激发子。激发HR，触发植物免疫，诱导植物产生抗病反应，有助于研究开发植物诱抗剂。这三个基因的强大功能可以作为开发植物诱抗剂的候选基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用。本发明鉴定到的三个免疫激发子基因可以作为开发免疫诱抗剂的理论知识补充，为防控作物病虫害提供理论指导。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明鉴定到来自终极腐霉菌(Pythium ultimum)的三个Elicitin类基因PYOD6、PYOD7和PYOD20，所述PYOD6、PYOD7和PYOD20基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—3所示。三个Elicitin类基因编码的蛋白质为PYOD6、PYOD7和PYOD20，其氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.4—6所示。
含有上述Elicitin类基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。
含有上述Elicitin类基因的重组表达载体PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN-PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20。
构建所述Elicitin类基因PYOD6、PYOD7和PYOD20基因的重组表达载体PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN-PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20。以植物表达载体PBIN-PLUS为出发载体，将PYOD6、PYOD7和PYOD20基因分别插入PBIN-PLUS的Sma1酶切位点获得。
所述Elicitin类基因及其表达载体可以激发植物免疫反应，为开发免疫诱抗剂提供知识基础，为防控作物病虫害提供理论指导。
一种植物免疫诱抗剂，该诱抗剂含有上述的终极腐霉免疫诱抗蛋白或上述终极腐霉免疫诱抗蛋白的发酵液。
上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在诱导植物产生坏死中的应用。
上述的Elicitin类基因、上述的蛋白或上述的重组表达载体在开发植物免疫诱抗剂中的应用。
上述的Elicitin类基因在培育抗病作物品种中的应用。
一种激发植物免疫的方法，将上述的Elicitin类基因或重组表达载体导入植株中，便能够激发植物免疫反应，提高植物抗性。也是一种构建抗病品种的方法，将上述的基因或重组表达载体导入作物植株中，经过抗性筛选得到阳性转化植株，获得抗病作物品种。
本发明的有益效果：
本发明从终极腐霉菌中鉴定到三个Elicitin类基因，将其插入表达载体PBIN-PLUS。将所述载体导入植物中，能够产生显著的HR反应，激发植物免疫。所述三个PYOD6、PYOD7和PYOD20基因可以作为开发植物免疫诱抗剂的潜在候选者，为防控植物病害理论支撑。
附图说明
图1为PYOD6、PYOD7和PYOD20基因诱导植物HR效果的表型图和HR程度定量标定柱形图。
其中，A为诱导植物HR显著效果的表型图，左一位阴性对照GFP基因处理，左二为阳性对照INF1基因处理，右边三个分别是PYOD6,PYOD7,PYOD20三个基因处理；能够明显看出三个基因PYOD6,PYOD7,PYOD20激发HR反应。B为HR程度定量标定柱形图，与图1A相对应的编号，能够清楚的看到三个基因激发HR程度与阳性对照程度相似，显著高于阴性对照(Student’s t test:****p<0.0001)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1 3个Elicitin类基因的扩增和测序
1.实验菌株
供试菌株终极腐霉(Pythium ultimum)由南京农业大学植病系植物与疫霉互作实验室保存菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为10℃。
2.供试本氏烟草幼苗的准备
本氏烟草(Nicotiana benthamiana)播种于装有蛭石(2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm) 里，放到14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长。使其生长7天，生长出两片真叶后，将其移栽至蛭石黑土提及体积比例为5：1的培养土里生长30天，取相同3，4，5叶位的叶片用作表达实验基因，然后持续观察7天叶片表型是否有明显HR。
3.提取终极腐霉(Pythium ultimum)RNA，并获得目的基因的cDNA
收集终极腐霉菌丝，然后液氮速冻后放入研钵冷却研磨。参照天根公司总RNA抽提纯化试剂盒推荐方法进行终极腐霉总RNA提取和纯化。参照诺唯赞公司RNA反转录试剂盒提供的方法，以Oligo(dT)为引物反转录合成c D N A。以上述c D N A为模板，用相应上下游引物进行PCR扩增(引物序列见表1)。
表1引物序列
name
sequence
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD6-F
CGATAGGGTACCCCCATGTACACCAAGTTCGCC
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD6-R
GGATCCGTCGACCCCGCAAGCTGGCTTGACGGT
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD7-F
CGATAGGGTACCCCCATGTACACCAAGTTCGCC
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD7-R
GGATCCGTCGACCCCGCAAGCTGGCTTGACGGT
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD20-F
CGATAGGGTACCCCCATGAAGTTCCAAGCCGTC
PBIN-PLUS-Sma1-PYOD20-R
GGATCCGTCGACCCCGAAGCAGCTGCCCTCGAA
PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR反应缓冲液；1.5μL1.5mM MgCl2；0.5μL 2.5 mMdNTPs；0.25μL Taq DNA聚合酶(5.0U/μL)；0.5μL引物；0.5μL模板；无菌水补足至25μL。
反应程序为：94℃5min预变性；94℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1:30min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
上述PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、回收，经测序确认无误后，获得的序列为所述3 个Elicitin类基因的核苷酸序列。该Elicitin类基因包括分别来自终极腐霉菌(Pythium ultimum)的三个Elicitin类基因PYOD6、PYOD7和PYOD20，所述PYOD6、PYOD7和PYOD20基因的核苷酸序列依次分别如SEQ ID NO.1—3所示。三个Elicitin类基因编码的蛋白质的氨基酸序列依次分别如SEQ ID NO.4—6所示。后续研究发现其具有诱导植物产生坏死和活性氧积累的强大功能。
实施例2构建PBIN-PLUS:GFP、PBIN-PLUS:INF1、PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN- PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20表达载体
将PBIN-PLUS(BIOVECTOR中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)空载体质粒用SmaI进行酶切。利用诺唯赞公司的同源重组酶将cDNA和载体连接。
反应体系如下：2μL 10×CEⅡ反应缓冲液；2μL上述PCR回收产物；2μL 上述酶切后的空载体；1μL同源重组酶；无菌水补足至10μL。
反应程序为：37℃条件下反应30min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，在Kan抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行菌落PCR鉴定。将鉴定到的阳性克隆测序，正确即获得了PBIN-PLUS:GFP、PBIN-PLUS:INF1、PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN- PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20表达载体。
实施例3表达载体转化农杆菌及功能验证
1、获得农杆菌感受态细胞
在LB固体培养基平板上划线培养农杆菌GV3101菌株，28℃条件下倒置培养18-20h；将单菌落置于LB液体培养基(含有100mg/L Rif)，28℃条件下振荡培养18-20h；100倍体积的不含抗生素的菌液加入菌液中，28℃条件下振荡培养OD600至0.3-0.5；冰上冷却后，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl2溶液使沉淀悬浮，4℃条件下4000r/min离心5min，弃上清；加入20mmol/L的CaCl2溶液再次使菌体沉淀悬浮备用。
2、PBIN-PLUS:GFP、PBIN-PLUS:INF1、PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN-PLUS: PYOD7、PBIN-PLUS:PYOD20表达载体转化农杆菌
利用电转法将PBIN-PLUS:GFP、PBIN-PLUS:INF1、PBIN-PLUS:PYOD6、PBIN- PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20表达载体转化农杆菌细胞；利用70％酒精冲洗电击杯三次，然后完全风干酒精。将100ng表达载体加入农杆菌感受态，冰上放置30min。将农杆菌感受态细胞转移至电击杯中，利用2.5kV的电压进行电击转化。电击完成后将农杆菌感受态细胞加入到400μLLB液体培养基中，28℃振荡培养2h。吸取20μL菌液，均匀涂抹在含有50mm卡那霉素和25mm的利福平固体LB培养基平板上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落进行菌落PCR，获取阳性克隆。
3、在本氏烟草中瞬时表达PBIN-PLUS:GFP、PBIN-PLUS:INF1、PBIN- PLUS:PYOD6、PBIN-PLUS:PYOD7和PBIN-PLUS:PYOD20蛋白
将上述阳性克隆放置于LB液体培养基中，28℃震荡培养30h。将菌液收集，用8000rpm离心2min，利用10mM MgCl2清洗三次。最后用10mM的MgCl2稀释菌液至OD600 值0.3。将菌液与含有沉默抑制子P19的菌液1：1混合。用1mL注射器在本式烟叶片上分别注射所有基因，每个最少5个重复，实验重复三次，结果如图1所示。
PYOD6基因
ATGTACACCAAGTTCGCCATCCTCGCCCTTGCCGCCTTCGCCGCTACGGCCGCCAACGC CGCGTCCACTGCTCCTTGCCCAAGCAGTGAACTCGCCAAGCTTGCTGGCTTGGCGTCGT CGCAGAACGTGTTCCCGTGCCAGGCCGTGTCGGGTGGTTTCAACATGATCCCACCATCG GGTCTGCCAACCACTGAGCAGCGCGCCAAGATGTGCGCGGCGCCAGTGTGCCACGCCC TGATCAAGGAAATCATCGCCCTCAACCCAACCGACTGCGTGCTCTCGCTCGGCAACTTG AACGTGAACGAACTCGCGAACGGCTTCGAGGCTTCATGCACGGCTTCGTCGCCAGCTC CAGCTGTGACCCCAGCGCCAGCGACTTCGGCTCCATCGACCCCATCCACGACGGCCCCT GGCACCCCATCCACGACGGCTCCATCGACCCCATCCACGACGGCGCCAGCCACCAACG GTACCCCAGCCCCAGCTGCCACCACCGTCAAGCCAGCTTGCTAA
PYOD7基因
ATGTACACCAAGTTCGCCATCCTCGCCCTTGCCGCCTTCGCCGCTACGGCCGCCAACGC CGCGTCCACTGCTCCTTGCCCAAGCAGTGAACTCGCCAAGCTTGCTGGCTTGGCGTCGT CGCAGAACGTGTTCCCGTGCCAGGCCGTGTCGGGTGGTTTCAACATGATCCCACCATCG GGTCTGCCAACCACTGAGCAGCGCGCCAAGATGTGCGCGGCGCCAGTGTGCCACGCCC TGATCAAGGAAGTTGTCGCCCTCAACCCAACCGACTGCGTGCTCTCGATCGGCAACTTG AACGTGTACGAACTCGCGAACGGCTTCGAGGCTTCATGCACGGCTTCGTCGCCAGCTCC AGCTGTGACCCCAGCGCCAGCGACTTCGGCTCCATCGACCCCATCCACGACGGCCCCTG GCACCCCATCCACGACGGCGCCAGCCACCAACGGTACTCCAGCCCCAGCTGCCACCAC CGTCAAGCCAGCTTGCTAA
PYOD20基因
ATGAAGTTCCAAGCCGTCCTCTTCGCCGCCGCTGCCGTCTTCGGCCTTGCCGCCGCCTAC GATGAAGTCACCGAGTGCCCAGCCACTGAATTCGTCAAGCTCGCGCCACTTGCGGCCA ACCCGAACTTGAACACCTGCCAAGCGGCATCGGAGGGCTGGCAGATGCTCCCACCAGT GGGTTACCCAACGGACACCCAGCGCGCTGCGATGTGCCTTGAGCCAACGTGCTTCAACT TGATCGACGCCATCAAGGCCCTGAACCCAAGCGACTGCATGTTGGTGTTTGGCGACGTC AAGTTGAACGTAAAGAAGCTCGCTGAAGAGTTCGAGGGCAGCTGCTTCTAA
PYOD6蛋白
MYTKFAILALAAFAATAANAASTAPCPSSELAKLAGLASSQNVFPCQAVSGGFNMIPPSGLP TTEQRAKMCAAPVCHALIKEIIALNPTDCVLSLGNLNVNELANGFEASCTASSPAPAVTPAPA TSAPSTPSTTAPGTPSTTAPSTPSTTAPATNGTPAPAATTVKPAC*
PYOD7蛋白
MYTKFAILALAAFAATAANAASTAPCPSSELAKLAGLASSQNVFPCQAVSGGFNMIPPSGLP TTEQRAKMCAAPVCHALIKEVVALNPTDCVLSIGNLNVYELANGFEASCTASSPAPAVTPAP ATSAPSTPSTTAPGTPSTTAPATNGTPAPAATTVKPAC*
PYOD20蛋白
MKFQAVLFAAAAVFGLAAAYDEVTECPATEFVKLAPLAANPNLNTCQAASEGWQMLPPVG YPTDTQRAAMCLEPTCFNLIDAIKALNPSDCMLVFGDVKLNVKKLAEEFEGSCF*。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种终极腐霉菌中诱导HR的Elicitin类基因及其表达载体的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 513
<212> DNA
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
<400> 1
atgtacacca agttcgccat cctcgccctt gccgccttcg ccgctacggc cgccaacgcc 60
gcgtccactg ctccttgccc aagcagtgaa ctcgccaagc ttgctggctt ggcgtcgtcg 120
cagaacgtgt tcccgtgcca ggccgtgtcg ggtggtttca acatgatccc accatcgggt 180
ctgccaacca ctgagcagcg cgccaagatg tgcgcggcgc cagtgtgcca cgccctgatc 240
aaggaaatca tcgccctcaa cccaaccgac tgcgtgctct cgctcggcaa cttgaacgtg 300
aacgaactcg cgaacggctt cgaggcttca tgcacggctt cgtcgccagc tccagctgtg 360
accccagcgc cagcgacttc ggctccatcg accccatcca cgacggcccc tggcacccca 420
tccacgacgg ctccatcgac cccatccacg acggcgccag ccaccaacgg taccccagcc 480
ccagctgcca ccaccgtcaa gccagcttgc taa 513
<210> 2
<211> 489
<212> DNA
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
<400> 2
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gcgtccactg ctccttgccc aagcagtgaa ctcgccaagc ttgctggctt ggcgtcgtcg 120
cagaacgtgt tcccgtgcca ggccgtgtcg ggtggtttca acatgatccc accatcgggt 180
ctgccaacca ctgagcagcg cgccaagatg tgcgcggcgc cagtgtgcca cgccctgatc 240
aaggaagttg tcgccctcaa cccaaccgac tgcgtgctct cgatcggcaa cttgaacgtg 300
tacgaactcg cgaacggctt cgaggcttca tgcacggctt cgtcgccagc tccagctgtg 360
accccagcgc cagcgacttc ggctccatcg accccatcca cgacggcccc tggcacccca 420
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gcttgctaa 489
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<211> 345
<212> DNA
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
<400> 3
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gacgccatca aggccctgaa cccaagcgac tgcatgttgg tgtttggcga cgtcaagttg 300
aacgtaaaga agctcgctga agagttcgag ggcagctgct tctaa 345
<210> 4
<211> 170
<212> PRT
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
<400> 4
Met Tyr Thr Lys Phe Ala Ile Leu Ala Leu Ala Ala Phe Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ala Asn Ala Ala Ser Thr Ala Pro Cys Pro Ser Ser Glu Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gln Asn Val Phe Pro Cys Gln Ala
35 40 45
Val Ser Gly Gly Phe Asn Met Ile Pro Pro Ser Gly Leu Pro Thr Thr
50 55 60
Glu Gln Arg Ala Lys Met Cys Ala Ala Pro Val Cys His Ala Leu Ile
65 70 75 80
Lys Glu Ile Ile Ala Leu Asn Pro Thr Asp Cys Val Leu Ser Leu Gly
85 90 95
Asn Leu Asn Val Asn Glu Leu Ala Asn Gly Phe Glu Ala Ser Cys Thr
100 105 110
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Ala Pro Ala Thr Ser Ala
115 120 125
Pro Ser Thr Pro Ser Thr Thr Ala Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Ala
130 135 140
Pro Ser Thr Pro Ser Thr Thr Ala Pro Ala Thr Asn Gly Thr Pro Ala
145 150 155 160
Pro Ala Ala Thr Thr Val Lys Pro Ala Cys
165 170
<210> 5
<211> 162
<212> PRT
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
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1 5 10 15
Ala Ala Asn Ala Ala Ser Thr Ala Pro Cys Pro Ser Ser Glu Leu Ala
20 25 30
Lys Leu Ala Gly Leu Ala Ser Ser Gln Asn Val Phe Pro Cys Gln Ala
35 40 45
Val Ser Gly Gly Phe Asn Met Ile Pro Pro Ser Gly Leu Pro Thr Thr
50 55 60
Glu Gln Arg Ala Lys Met Cys Ala Ala Pro Val Cys His Ala Leu Ile
65 70 75 80
Lys Glu Val Val Ala Leu Asn Pro Thr Asp Cys Val Leu Ser Ile Gly
85 90 95
Asn Leu Asn Val Tyr Glu Leu Ala Asn Gly Phe Glu Ala Ser Cys Thr
100 105 110
Ala Ser Ser Pro Ala Pro Ala Val Thr Pro Ala Pro Ala Thr Ser Ala
115 120 125
Pro Ser Thr Pro Ser Thr Thr Ala Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Ala
130 135 140
Pro Ala Thr Asn Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr Val Lys Pro
145 150 155 160
Ala Cys
<210> 6
<211> 114
<212> PRT
<213> 终极腐霉菌(Pythium ultimum)
<400> 6
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Tyr Asp Glu Val Thr Glu Cys Pro Ala Thr Glu Phe Val
20 25 30
Lys Leu Ala Pro Leu Ala Ala Asn Pro Asn Leu Asn Thr Cys Gln Ala
35 40 45
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50 55 60
Thr Gln Arg Ala Ala Met Cys Leu Glu Pro Thr Cys Phe Asn Leu Ile
65 70 75 80
Asp Ala Ile Lys Ala Leu Asn Pro Ser Asp Cys Met Leu Val Phe Gly
85 90 95
Asp Val Lys Leu Asn Val Lys Lys Leu Ala Glu Glu Phe Glu Gly Ser
100 105 110
Cys Phe
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