抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体、制备方法及应用
阅读说明：本技术 抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体、制备方法及应用 (anti-African swine fever virus p54 protein monoclonal antibody, preparation method and application ) 是由 陈玉梅 王爱萍 蒋敏 赵建国 冯景 石海宁 赵孟孟 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。本发明设计并合成能够模拟保守性p54蛋白NTD的多肽,并将其与BSA偶联作为免疫原,通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备获得抗ASFVp54蛋白单克隆抗体,该抗体能够特异性的识别并结合p54蛋白的N端区域,该识别区域(aa 1-29)区别于现有商品化单抗。本发明提供了上述抗体的重链可变区及轻链可变区基因序列,在此基础上,可以采用常规基因工程或蛋白质工程方法获得本发明的单克隆抗体。该单克隆抗体特异性强,灵敏度高,能与ASFV HLJ/18株病毒发生特异性反应,而与CSFV、PCV2、PRRSV、PEDV及PRV等猪源病毒不发生反应,为进行ASFV病原学和致病机理的研究及ASFV病原的临床检测研究奠定了基础。(The invention relates to an anti-African swine fever virus p54 protein monoclonal antibody, a preparation method and application. The invention designs and synthesizes polypeptide capable of simulating conservative p54 protein NTD, couples the polypeptide with BSA to be used as immunogen, and immunizes BALB/c mice by an immunological method to prepare and obtain the anti-ASFVp 54 protein monoclonal antibody, wherein the antibody can specifically recognize and combine with the N-terminal region of p54 protein, and the recognition region (aa 1-29) is different from the existing commercial monoclonal antibody. The invention provides the heavy chain variable region and light chain variable region gene sequences of the antibody, and on the basis, the monoclonal antibody can be obtained by adopting a conventional genetic engineering or protein engineering method. The monoclonal antibody has strong specificity and high sensitivity, can perform specific reaction with ASFV HLJ/18 strain virus, does not react with swine viruses such as CSFV, PCV2, PRRSV, PEDV, PRV and the like, and lays a foundation for the research on ASFV etiology and pathogenic mechanism and the clinical detection research on ASFV etiology.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种巨大而复杂的DNA病毒，是非洲猪瘟(ASF)的病原体，是Asfarviridae属的唯一已知的成员。ASF是家猪中高度传染性的出血性疾病，其发病率和死亡率高达100％。ASFV最早于1921年在肯尼亚被发现，距现在已近一个世纪。自2007年传播到佐治亚州以来，ASFV已迅速传播遍布非洲，亚洲和欧洲的多个国家，并在这些地区循环爆发。同时，ASFV具有多个天然宿主和贮存库，这进一步加大了ASF的潜在威胁性。鉴于这种跨界动物疾病的巨大风险和威胁，它已被列入世界动物卫生组织(OIE)陆生动物卫生法典，且被定为必须向OIE报告的动物疾病。
由于ASFV在全球范围内的经济重要性，自1960年代末以来，一直在尝试开发一种有效，安全的疫苗来保护猪免受ASFV感染。然而，由于ASFV的复杂结构和对病毒蛋白功能的了解有限，世界上尚未开发出针对ASF的安全有效的疫苗，对非洲猪瘟的控制严格依赖于动物检疫。因此，对ASFV的检测及防控至关重要。
ASFV拥有170-194kb的大型线性双链DNA(dsDNA)基因组，编码150多种蛋白质。尽管已经从病毒体中鉴定出多达68种结构蛋白，但大多数蛋白的功能尚不清楚。ASFV病毒体具有独特的多层结构，细胞内病毒体由核苷(第一层)，内核壳(第二层)，内膜(第三层)和衣壳(第四层)构成。细胞外病毒体具有额外的外部包膜(第五层)。细胞内和细胞外ASFV病毒体都具有传染性。构成病毒颗粒的结构蛋白分布在这些多层结构中，并在病毒感染中发挥各种作用。病毒结构蛋白抗原特性的鉴定对于理解病毒与宿主之间的相互作用是必不可少的，对于改进ASFV血清学诊断和设计亚单位疫苗或病毒载体疫苗是至关重要的。目前，ASFV具有25个基因型，某些基因的遗传多样性和抗原多样性是造成缺乏针对这种致死性猪疾病的交叉保护疫苗这种情况的主要原因之一。抗原性结构蛋白的多样性也可能会对ASFV感染的可靠诊断产生巨大影响。
为了深入研究抗原性结构蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对ASFV病毒感染的准确诊断，本领域仍需要更多能够识别ASFV不同结构蛋白、不同抗原表位的单克隆抗体，为防治ASF提供新方向和新思路。非洲猪瘟病毒p54蛋白的编码序列在不同毒株间具有多态性，但其N端区域(NTD)在各毒株间相对保守，且在病毒形态形成以及入侵等过程中具有重要作用。然而，现有技术和报道中还未见有特异性针对NTD的单克隆抗体。因此，本发明设计并合成能够模拟p54蛋白NTD的多肽，并将其与BSA偶联作为免疫原，以期获得特异性识别p54蛋白NTD的单克隆抗体，为进一步的研究抗原性结构蛋白p54特性以及不同结构域的功能提供工具，为ASF的防控提供新方向和新思路。
发明内容
本发明的目的在于提供抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体能够特异性识别非洲猪瘟病毒p54蛋白上的N端区域(aa 1-29)。
本发明的第二个目的在于提供非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的CDR3；所述单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的CDR1、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR2、氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的CDR3。
具体的，所述单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
具体的，所述单克隆抗体重链恒定区为lgG1型，轻链恒定区为Kappa型。
具体的，上述抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体能够特异性识别非洲猪瘟病毒p54蛋白；更进一步的，上述抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体能够特异性识别非洲猪瘟病毒p54蛋白的N端区域如SEQ ID NO.11所示序列；更近一步的，上述抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体能够特异性识别非洲猪瘟病毒p54蛋白上的具有DSEFFQPV序列的肽段或表位。
本领域技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列基础上，可通过常规蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守型变异体或其片段，而仍能保持与非洲猪瘟病毒p54蛋白上的具有DSEFFQPV序列的肽段或表位特异性结合。
一种核酸分子，所述核酸分子编码上述抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体。
具体的，编码抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体重链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；编码抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体轻链可变区的基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
本发明涉及的抗体核酸分子可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。本领域技术人员显然知晓，在本发明提供的上述核酸分子经一个或多个核苷酸添加、删除、替换、修饰等突变后得到的重链可变区核苷酸序列和/或轻链可变区核苷酸序列的变异序列，其所编码的氨基酸序列组成的单链抗体或嵌合单克隆抗体或改型单克隆抗体或其他形式的单克隆抗体或抗体片段，仍保留与非洲猪瘟病毒p54蛋白上的具有DSEFFQPV序列的肽段或表位特异性结合的能力。
一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述核酸分子。
进一步的，所述重组表达载体选自原核或真核表达载体；更进一步的，所述重组表达载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。
一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述重组表达载体，或基因组中整合有上述核酸分子。
进一步的，所述表达系统为细菌、酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或无细胞表达系统。
制备非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的方法，所述方法包括如下步骤：在适当条件下培养上述宿主细胞。
上述非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明中的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体能特异性的识别非洲猪瘟病毒p54蛋白和非洲猪瘟病毒，可利用本发明的单抗检测非洲猪瘟病毒p54蛋白，也可检测非洲猪瘟病毒。
具体的，所述检测试剂或试剂盒包含抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体。
本发明取得的有益效果：
本发明提供的非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体，是基于设计并合成能够模拟保守性p54蛋白N端区域(NTD,aa 1-29)的多肽，并将其与BSA偶联作为免疫原，通过免疫学方法免疫BALB/c小鼠制备而成，能够特异性的识别并结合p54蛋白的NTD(aa 1-29)，肽段，该识别位点(DSEFFQPV)区别于现有商品化单抗。在此过程中，我们使用生物信息学分析了p54的保守性，通过回顾先前研究和深入分析，发现NTD是p54蛋白内的关键抗原性区域。并经试验证明，针对蛋白p54诱导的抗体主要识别线性表位，抗p54蛋白阳性血清可以特异性识别NTD。此外，成熟病毒体形成所需的p54二聚化，必须通过位于NTD的独特的半胱氨酸残基发生。这表明NTD是制备抗p54蛋白的单克隆抗体(mAb)的新靶标，也是研究AFSV形态发生的关键靶点。以NTD多肽偶联BSA为免疫原制备获得的单克隆抗体特异性强，灵敏度高，重链型为：lgG1，轻链型为：Kappa型，效价不低于1：1.024×106，与其他猪源病毒如经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV 2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等均无交叉反应，可同时用于ELISA、IPMA等多种免疫学检测手段，具有良好的应用前景。
本发明还提供了非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的重链和轻链的可变区氨基酸序列及核苷酸序列，在此基础上，可以采用常规基因工程或蛋白质工程的方法获得本发明的单克隆抗体，进一步的，还可采用一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得其活性片段或保守性变异体，为进一步提升抗体的特异性和亲和力奠定基础。
附图说明
图1为免疫小鼠的血清效价；
图中，21dpi是免疫后21天小鼠血清；42dpi是免疫后42天小鼠血清。
图2为单抗Western blotting鉴定；
图中，孔1为pET28a-P54原核表达产物；孔2为pET28a空载表达产物；
图3为单抗特异性的IPMA鉴定；
图中，A为pcDNATM3.1/myc-HisA/ASFV P54瞬时转染的293T细胞的IPMA鉴定结果；B为未转染的293T细胞对照
图4为IPMA检测单抗与其他猪源病毒的交叉反应性；
图中，A为ASFV HLJ/18株；B为PCV2；C为CSFV；D为PRRSV；E为PEDV；F为PRV。
图5为p54蛋白p54N29 B细胞表位的间接ELISA鉴定结果图；
图中，P1-P3为覆盖p54蛋白1-29位氨基酸的重叠多肽；NC为SMCC-BSA，作为阴性对照，PC为多肽p54N29，作为阳性对照。
图6为截短肽库来确定最小表位图；
图中，A为N端截短多肽与单抗反应结果，B为C端截短多肽与单抗反应结果。
图7为p54蛋白p54N29的B细胞表位关键氨基酸序列的鉴定图。
图中，E1为2DSEFFQPV9抗原表位；F5A,F6A,Q7A,P8A,V9A分别为所述抗原表位对应位点突变成丙氨酸的多肽。
图8为本发明提供的单克隆抗体在IPMA检测中的应用；
图中，A为本发明中所述的单克隆抗体；B为ASFV猪阳性血清作为阳性对照；C为抗PCV2Cap蛋白单克隆抗体作为阴性对照。
图9为本发明提供的单克隆抗体在IFA检测中的应用；
图中，A为本发明中所述的单克隆抗体；B为抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体作为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1免疫原的选择和制备
病毒结构蛋白p54由E183L基因编码，位于病毒包膜的内膜中，P54的N端在毒株间相对保守，且含有唯一的半胱氨酸，在病毒形态形成，活性，以及入侵等过程中具有重要作用。在前期试验中，根据p54蛋白NTD序列合成多肽来模拟NTD，该多肽与ASFV感染临床康复猪血清具有良好的反应，证明p54蛋白NTD区域含有抗原决定簇，可以诱导机体产生针对NTD的抗体。因此，本发明将p54蛋白NTD偶联载体蛋白BSA作为免疫原。具体的，免疫原的制备包括如下步骤：
(1)以中国报道的第一例ASF爆发中的ASFV毒株SY18的p54蛋白序列(GenBank:MH717102.1)为参考，通过固相合成多肽技术合成可以模拟p54蛋白NTD的多肽，命名为NTD，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)多肽偶联载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)
利用水溶性的氨基-巯基交联剂Sulfo-SMCC进行偶联。Sulfo-SMCC具有sulfo-NHS酯和马来酰亚胺两个反应基团，可以在在伯氨基与巯基之间发生反应。首先，在pH7-9的条件下，Sulfo-SMCC与载体蛋白BSA的伯胺基发生反应，形成稳定的酰胺键，得到活化的载体蛋白BSA。其次，活化的BSA经PBS(pH7.2-7.4)透析，至少换三次透析液，每次间隔6个小时。收集透析好的溶液，用PBS调整蛋白浓度至5mg/ml。最后，在pH 6.5-7.5的条件下，活化好的BSA与多肽NTD的巯基发生反应，形成稳定的硫醚键，形成免疫原性载体蛋白BSA与多肽NTD偶联物，以用于抗体生产。
实施例2单克隆抗体的制备
1.动物免疫
(1)将免疫原NTD-BSA中加入弗氏完全佐剂，经乳化后用于首次免疫，；
(2)通过背部皮下多点注射的方法，免疫4～8周龄的雌性BALB/c小鼠2只，免疫剂量10μg/只；
(3)隔3周用弗氏不完全佐剂与免疫抗原乳化后以相同的方法和剂量对BALB/c小鼠进行加强免疫；
(4)三周后，尾静脉采血测定针对NTD的特异性抗体效价，选择效价较高的小鼠(图1)，于细胞融合前3～4天，通过尾静脉注射的方法，用不含佐剂的免疫原对BALB/c小鼠进行超强免疫，免疫剂量是20μg/只。
2.细胞融合及单克隆抗体制备
采用聚乙二醇的方法，将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量8：1的比例进行细胞融合，融合后的细胞用HAT选择培养基进行筛选；于融合后12天，以多肽NTD作为包被抗原，通过间接ELISA法初步筛选阳性杂交瘤细胞；
间接ELISA法步骤：
(1)用CBS液将未偶联NTD多肽稀释成浓度为2μg/mL的包被液包被酶标板，100μl/孔，4℃封闭过夜；
(2)将杂交瘤上清(一抗)用5％的脱脂奶2倍稀释，依次加入酶标板中，50μl/孔，阳性对照为ASFV猪阳性血清，37℃孵育30min；
(3)弃去一抗，用PBST洗板，洗干净，拍干；
(4)将稀释好的HRP标记的羊抗鼠IgG(二抗)加入反应孔中，50μl/孔。37℃孵育30min；
(5)弃去二抗，用PBST冲洗干净，拍干；
(6)每孔加入现配的TMB显色液100μl，暗室反应15min；
(7)每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应；
(8)酶标仪读取每孔的OD450值。
3.通过有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆
用1640/10完全培养基稀释上述阳性杂交瘤细胞至约1.5cells/ml，每孔100μl加入到预铺有100μl饲养细胞的96孔板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养6～8天；进一步通过间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞；进行2～3次亚克隆，直至直到获得稳定分泌抗P54蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，即可获得目的杂交瘤细胞，将筛选得到的阳性单克隆扩大培养，细胞数按1～2×106/管进行冻存。
4.单克隆杂交瘤细胞株稳定性鉴定
将所建立的单克隆杂交瘤细胞株连续培养3个月并反复液氮冻存复苏，从而鉴定杂交瘤细胞的稳定性；结果显示单克隆杂交瘤细胞株稳定性良好。
5.体内诱生腹水法制备单抗
选择经产的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注射500μl灭菌石蜡，一周后，再次腹腔内注射获得的单克隆杂交瘤细胞，注射量为2×105个细胞，再过一周后，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，离心后取上清，用辛酸硫酸铵法对腹水进行纯化。
实施例3抗体的纯化及鉴定
1.饱和硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，操作方法如下：
(1)取5ml单抗腹水,加入5ml PBS缓冲液，再逐滴加入饱和硫酸铵溶液2.5ml，使成为终浓度为20％的硫酸铵溶液，边加边搅拌，充分混匀后，静置30min。
(2)8000r/min，离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
(3)在上清液中加入12.5ml饱和硫酸铵溶液，充分混匀，静置30min。
(4)8000r/min，离心20min，弃去上清。
(5)于沉淀中加入10ml PBS缓冲液,使之溶解，再加入5ml饱和硫酸铵溶液,使之成为33％硫酸铵溶液，充分混匀后，静置30min。
(6)8000r/min，离心20min，弃去上清，以除去白蛋白。
(7)重复步骤5，2～3次。
(8)用5ml PBS缓冲液溶解沉淀，装入透析袋，4℃下用PBS缓冲液透析，换液4次。
(9)8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清即为纯化抗体，测抗体浓度，分装后，-20℃保存。
2.单克隆抗体效价测定
间接ELISA测定方法参照实施例2进行，一抗略有不同：将纯化的单克隆抗体用5％的脱脂奶从1:1000开始进行2倍倍比稀释，依次加入酶标板中，50μl/孔，阳性对照为ASFV猪阳性血清，37℃孵育30min；其他步骤参照实施例2进行，ELISA检测结果显示该单克隆抗体效价为1：1.024×106。
3.亚型鉴定
用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(Sigma，Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Kit)对单抗的亚型进行鉴定，鉴定结果显示单克隆抗体属于IgG1，轻链型为Kappa型。
4.单抗特异性鉴定
单克隆抗体的Western-blotting鉴定：将p54基因(GenBank登录MH717102)的完整编码序列(CDR)，亚克隆到pET-28a质粒中，构建原核表达载体pET28a-p54，将重组克隆pET28a-p54转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，用单克隆抗体进行western印迹检测，结果如图2所示，单抗可与原核表达的ASFV p54蛋白发生特异性反应，而与空载体不反应；
将上述单抗按一定比例稀释后分别加入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-HisA/ASFVP54瞬时转染的293T细胞中，利用IPMA检测方法测定结果如图3所示，单克隆抗体与细胞源ASFV P54蛋白发生特异性反应，而与未转染细胞不反应。
5.与猪源病毒的交叉反应性鉴定
同时将单抗腹水按一定比例稀释后分别加入到PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV感染的细胞，利用IPMA检测方法，测定单克隆抗体与PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV是否具有交叉反应性。IPMA结果如图4所示，单抗只与ASFV HLJ/18株反应，与其它几种病毒(PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、PEDV)的反应结果均为阴性，证明单克隆抗体与ASFV反应的特异性好，与其它几种常见的猪病毒无交叉反应。
实施例4单克隆抗体可变区基因扩增与序列测定
1.引物设计
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
P1：5’-cctggtGAGGAGTCTGGACCTG-3’；
P2：5’-AAATCGAGAAGCACA-3’。
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-CCTGTCAGTCTTGGAGATCAA-3’；
P4：5’-TATCCGTTTGATTTCCAGCTT-3’。
2.PCR扩增
通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体的可变区序列，送上海生工生物有限公司测序。
测序结果如下：本发明的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示，由其推导的对应的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。进一步分析得到单克隆抗体重链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示；单克隆抗体的轻链可变区CDR的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4-6所示。
实施例5单克隆抗体识别抗原表位的鉴定
1.重叠多肽的设计
采用多肽扫描法设计合成3段多肽，覆盖整个NTD，相邻多肽重叠7个氨基酸。多肽段氨基酸序列如表1所示。
表1
命名
定位
氨基酸序列
P1
1-15aa
MDSEFFQPVYPRHYG
P2
9-23aa
VYPRHYGECLSPVTT
P3
18-29aa
LSPVTTPSFFST
2.间接ELISA筛选能与抗体结合的短肽
用CBS缓冲液稀释多肽，包被酶标板，37℃，2h；PBST洗板2～3次；用5％脱脂奶封闭，37℃，2h；以本发明实施例3获得的单克隆抗体作为一抗进行间接ELISA，37℃孵育1h；洗板后，加入HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)，37℃孵育30min；洗板后加入TMB底物显色液，5min后终止显色，用酶标仪读数。结果显示筛选到的单克隆抗体可与多肽P1(1MDSEFFQPVYPRHYG15)发生特异性反应(图5)。
3.单克隆抗体识别抗原表位鉴定。
通过系统性地从两端截短阳性多肽P1建立截短文库，结果如图6所示，其中，A图为N端截短多肽与单抗反应结果，B图为C端截短多肽与单抗反应结果，由图6可知，表位活性所需的最小表位肽为“2DSEFFQPV9”，在确定了最小的表位肽后，设计丙氨酸扫描文库以鉴定表位中的关键残基。所有合成肽的纯度等于或大于95％。并利用ELISA方法确定截短肽库和丙氨酸扫描肽库中各肽与单抗的反应性，确定表位“2DSEFFQPV9”的关键氨基酸为6FQPV9(图7)。
实施例6单克隆抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂或试剂盒中的应用
该实施例提供了一种非洲猪瘟病毒检测试剂，该检测试剂包含本发明提供的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体。并分别采用IPMA和IFA检测方法对该检测试剂的特异性进行了验证。
非洲猪瘟病毒HLJ/18株感染猪原代肺泡巨噬细胞，经甲醇固定处理，制备成单层细胞反应板。该经ASFV HLJ/18株感染的单层细胞反应板由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所友情提供。
1.IPMA方法检测非洲猪瘟感染的细胞，具体步骤如下：
(1)将上述制备的单层细胞反应板从冰箱取出，平衡至室温，用PBST洗涤1次。
(2)将上述检测试剂(包含本发明提供的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体)作为一抗，用5％的脱脂奶1：1000进行稀释，同时设阳性对照为ASFV猪阳性血清，阴性对照为抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体，每孔加样量为50μl。置于37℃温箱中孵育30min。
(3)PBST洗涤3次，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗。阳性对照孔中加入HRP标记的羊抗猪IgG作为二抗。置于37℃温箱中孵育30min。
(4)PBST洗涤3次，加入AEC底物显色液，室温显色10min，置光学显微镜下观察染色结果。
结果判定：非洲猪瘟病毒感染的细胞可观察到典型的红棕色着色，未感染的细胞和阴性对照无红棕色着色。结果如图8所示，表明本发明的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体可特异性的检测被ASFV感染的细胞。
2.IFA检测方法可以参照IPMA检测方法进行，二抗略有不同，将FITC标记的羊抗鼠二抗以1：500稀释后加入相应孔中，其他步骤参照IPMA进行。无需显色底物，结果在荧光显微镜下进行观察。结果判定：非洲猪瘟病毒感染的细胞可观察到典型的绿色荧光，未感染的细胞和阴性对照无荧光。结果如图9所示，表明本发明的抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体可特异性的检测被ASFV感染的细胞。
同时，本发明的单抗还可以用于ELISA检测试剂或ELISA检测试剂盒中，如实施例2，或者将本发明的单抗经标记物标记后用于ELISA检测试剂或试剂盒中，检测ASFV或ASFVp54蛋白；本发明的单抗还可以作为一抗用于Western blotting中，检测ASFV或ASFV p54蛋白，如实施例3；或者将本发明的单抗作为金标抗体或捕获抗体用于免疫层析试纸，检测ASFV或ASFV p54蛋白。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
<110> 河南中泽生物工程有限公司
<120> 抗非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体、制备方法及应用
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 重链可变区CDR1
<400> 1
Gly Phe Ser Ile Thr Arg Asp Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
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Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Asn
1 5
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<211> 40
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<213> 人工序列
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<400> 3
Ala Leu Met Met
1
<210> 4
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR1
<400> 4
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly ASn Thr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR2
<400> 5
Asp Ser Ser Phe
1
<210> 6
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区CDR3
<400> 6
Ser Gln Ser Thr Leu Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 重链可变区
<400> 7
Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Phe Ser Ile Thr Arg Asp Tyr Gly
20 25 30
Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Ala
35 40 45
Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
50 55 60
Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Glu
65 70 75 80
Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu
85 90 95
Met Met Thr Thr Cys Ala Ser Arg Phe
100 105
<210> 8
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区
<400> 8
Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln
20 25 30
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Asn Asp Ser Ser Phe His
35 40 45
Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
50 55 60
Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr Leu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
85 90 95
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ile
100
<210> 9
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区
<400> 9
cctggtgagg agtctggacc tggcctggtg aaaccttctc agtctctgtc cctcacctgc 60
actgtcactg gcttctcaat cacccgtgat tatggctgga actggatccg gcagtttcca 120
ggaaataaac tggagtggat ggcctatata agttatagtg gtagtaatag ctataaccca 180
tctctcaaaa gtcgaatctc tatcactcga gacacatcca agaaccagtt cttcctggag 240
ttgaattctg tgactactga ggacacagcc acatattact gtgcccttat gatgacgacg 300
tgtgcttctc gattt 315
<210> 10
<211> 312
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区
<400> 10
cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac 60
agtaatggaa acacctattt agattggtac ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc 120
ctgatcaacg actcaagttt ccaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt 180
ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggaatt 240
tatttctgct ctcaaagtac acttcttcct ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa 300
atcaaacgga ta 312
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> NTD
<400> 11
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu
1 5 10 15
Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr
20 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区引物P1
<400> 12
cctggtgagg agtctggacc tg 22
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 重链可变区引物P2
<400> 13
aaatcgagaa gcaca 15
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区引物P3
<400> 14
cctgtcagtc ttggagatca a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 轻链可变区引物P4
<400> 15
tatccgtttg atttccagct t 21
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P1肽
<400> 16
Met Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly
1 5 10 15
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P2肽
<400> 17
Val Tyr Pro Arg His Tyr Gly Glu Cys Leu Ser Pro Val Thr Thr
1 5 10 15
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> P3肽
<400> 18
Leu Ser Pro Val Thr Thr Pro Ser Phe Phe Ser Thr
1 5 10
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<221> 抗原表位
<400> 18
Asp Ser Glu Phe Phe Gln Pro Val
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