一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法
阅读说明：本技术 一种高效提取蝉花虫草子实体中n6-(2-羟乙基)腺苷的方法 (Method for efficiently extracting N6- (2-hydroxyethyl) adenosine from cordyceps sobolifera sporocarp ) 是由 付婷伟 邵颖 陈安徽 彭双双 吕韩 刘妍妍 何晓波 姚泽润 于 2021-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于食用菌活性成分提取技术领域,具体涉及一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法。本发明所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法,在现有技术传统的乙醇提取-树脂分离-制备型色谱分离的提取方法的基础上,通过在乙醇提取步骤中加入肌氨酸的方式进行辅助提取,有助于提高N6-(2-羟乙基)腺苷的提取效率。(The invention belongs to the technical field of extraction of active ingredients of edible fungi, and particularly relates to a method for efficiently extracting N6- (2-hydroxyethyl) adenosine from cordyceps sobolifera fruiting bodies. The method for efficiently extracting the N6- (2-hydroxyethyl) adenosine from the cordyceps sobolifera sporocarp is used for carrying out auxiliary extraction by adding sarcosine in the ethanol extraction step on the basis of the traditional ethanol extraction-resin separation-preparative chromatographic separation extraction method in the prior art, and is beneficial to improving the extraction efficiency of the N6- (2-hydroxyethyl) adenosine.)
技术领域
本发明属于食用菌活性成分提取
技术领域
，具体涉及一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法。背景技术
N6-(2-羟乙基)腺苷(N6-(2-hydroxyethyl)adenosine，HEA)是从蝉花虫草菌丝体中提取的腺苷类衍生物，是虫草的特有成分，已报道的功能包括杀菌、抗癌和抗惊厥等，并具有Ca2+拮抗作用和肌肉收缩活性。HEA是目前已知的第一个生物来源的钙离子拮抗剂，也是腺苷A1受体激动剂，使用DPCPX(腺苷A1受体拮抗剂)可以证明HEA是作用于腺苷A1受体，而虫草独特的药用价值更促使其药理学研究不断发展。目前，HEA的含量是衡量虫草品质的重要指标，但是，无论是天然虫草还是人工虫草，其HEA的含量均十分低，为HEA的提取造成了一定的困难，普遍存在着提取效率较低的问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，以解决现有技术中HEA提取率较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，包括如下步骤：
(1)取蝉花虫草子实体进行粉碎，加入乙醇溶液混匀，并加入肌氨酸进行辅助提取；
(2)收集提取液以树脂进行分离，并以低浓度乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，经浓缩干燥，备用；
(3)将所得浓缩物用低浓度甲醇溶液溶解，注入反相高效液相制备色谱进行分离，收集制备图谱中14.6-15.2min的色谱峰组分，干燥，即得。
具体的，所述步骤(1)中，所述肌氨酸的加入量占所述蝉花虫草子实体用量的3-8wt％。
具体的，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的浓度为30-50v/v％。
具体的，所述步骤(1)中，所述乙醇溶液的用量为所述蝉花虫草子实体用量的2-4倍量。
具体的，所述步骤(2)中，所述树脂为D101大孔树脂。
具体的，所述步骤(2)中，控制所述子实体与所述树脂的用量比为1：8-12g/mL。
具体的，所述步骤(2)中，所述洗脱液为体积浓度15-25v/v％的乙醇溶液，使用量为3-5倍柱体积。
具体的，所述步骤(3)中，所述低浓度甲醇为体积分数10-20v/v％的甲醇溶液，并配置样品浓度为50-150mg/ml。
具体的，所述步骤(3)中，所述反相高效液相制备色谱条件包括：
色谱柱：C18键合相填料柱；
流动相：10-20v/v％甲醇-水溶液；
检测波长：紫外检测器260nm；
流动相流速：160ml/min；
进样量：10ml。
具体的，所述蝉花虫草子实体为N6-(2-羟乙基)腺苷高含量子实体。
本发明所述的N6-(2-羟乙基)腺苷高含量蝉花虫草子实体经由可提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的方法栽培获得，具体包括在液体培养基中进行液体菌种培养以及在固体培养基中进行子实体培养的步骤；
所述固体培养基包括质量比为1：0.8-1.5的固体基质和营养液；
所述固体基质包括如下重量份的组分：玉米渣20-30重量份、麸皮10-20重量份、蝉蛹粉10-20重量份、桑枝碎粒3-8重量份、烟叶茎秆碎粒5-12重量份、EM菌粉0.5-2重量份；
所述营养液包括如下质量含量的组分：碳源20-30g/L、氮源20-30g/L、无机盐5-12g/L，pH6-8。
具体的，所述提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的栽培方法：
所述碳源包括葡萄糖；
所述氮源包括蛋白胨；
所述无机盐包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和硫酸镁的混合物。
具体的，所述子实体培养步骤包括发菌步骤、转色步骤以及子实体管理步骤。
具体的，所述发菌步骤的控制条件包括：控制培养温度15-18℃、湿度60-80％，进行避光培养。
具体的，所述转色步骤的控制条件包括：控制光照条件为200-500lux，控制光周期光暗比为L15-18：D6-9，培养温度15-18℃，湿度60-80％。
具体的，所述子实体管理步骤的控制条件包括：控制光照条件为200-500lux，控制光周期光暗比为L15-18：D6-9，培养温度20-25℃，湿度60-80％。
具体的，所述液体培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖2-6％、鸡蛋清1-2％、蛋白胨1-3％、MgSO4·7H2O 0.05％、KH2PO4 0.05％，自然pH值。
具体的，所述液体菌种培养的条件包括：控制发酵温度20-25℃，搅拌转速150-180rpm。
具体的，还包括在所述液体菌种培养步骤前将所述菌株进行常规活化的步骤。
本发明还公开了由所述栽培方法得到的蝉花虫草子实体。
本发明所述高效提取蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的方法，在现有技术传统的乙醇提取-树脂分离-制备型色谱分离的提取方法的基础上，通过在乙醇提取步骤中加入肌氨酸的方式进行辅助提取，有助于提高N6-(2-羟乙基)腺苷的提取效率。
本发明所述提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷含量的栽培方法，在常规蝉花虫草子实体栽培工艺的基础上，通过对固体培养基基质的筛选，有效的诱导发酵过程中N6-(2-羟乙基)腺苷的积累，提高蝉花虫草子实体中N6-(2-羟乙基)腺苷的含量。本发明所述方法特异性针对于发酵过程中N6-(2-羟乙基)腺苷的积累，相比于一般性针对于腺苷优化的方案，其对于N6-(2-羟乙基)腺苷含量的提高尤为突出。
具体实施方式
在本发明下述制备例中，选用的培育蝉花虫草的菌株为现有技术常规已知菌株即可，下述实施例选用的所述蝉花虫草菌株购于上海抚生实业有限公司。
本发明下述制备例中，所述蝉花虫草经液体培养获得相应的培养液(种子液)，再接种于相应的固体培养基中进行子实体的发酵。下述制备例中，所述液体培养步骤使用的液体培养基包括如下质量含量的组分：葡萄糖4％、鸡蛋清1％、蛋白胨2％、MgSO4·7H2O0.05％、KH2PO4 0.05％，自然pH值。经灭菌后，于无菌条件下，将保存的菌株挖块接种至上述液体培养基中，控制发酵温度22℃，搅拌转速160rpm进行摇瓶培养48h，获得如下实施例中待接种进行子实体固体发酵的种子液，备用。
制备例1
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣20重量份、麸皮20重量份、蝉蛹粉10重量份、桑枝碎粒8重量份、烟叶茎秆碎粒5重量份、EM菌粉2重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖20g/L、蛋白胨30g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L；
按照1：0.8的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例2
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣30重量份、麸皮10重量份、蝉蛹粉20重量份、桑枝碎粒3重量份、烟叶茎秆碎粒12重量份、EM菌粉0.5重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖30g/L、蛋白胨20g/L、磷酸二氢钾4g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸镁4g/L；
按照1：1.5的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例3
本制备例中将上述获得的种子液在固体培养基中进行子实体的培养。
按照如下含量配制所述固体基质：玉米渣25重量份、麸皮15重量份、蝉蛹粉15重量份、桑枝碎粒5重量份、烟叶茎秆碎粒8重量份、EM菌粉1重量份(暂不加入)；
按照如下含量配制所述营养液：葡萄糖25g/L、蛋白胨25g/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁3g/L；
按照1：1.2的质量比将上述固体培养基(除EM菌粉)和营养液相混匀，将配制好的培养基封口，置于高压湿热灭菌锅中，121℃常规灭菌40min。
于室温及无菌条件下，按照10wt％的接种量将上述种子液接种入所述固体培养基中，并加入相应量的所述EM菌粉混匀，随后将接种后的培养基置于栽培室内培养，控制温度17℃，湿度70％，进行避光培养3-5天，至发菌完全。
随后调整光照条件，控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，继续控制培养温度17℃、湿度70％，继续培养5-8天完成转色并可形成子座芽。
随后保持上述光照条件，继续控制光照条件为300lux下，控制光周期光暗比为L16：D8，控制培养温度22℃、湿度70％，继续培养15-20天，采收成熟的子实体，烘干，即得。
制备例4
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述EM菌粉。
制备例5
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述烟叶茎秆碎粒。
制备例6
本制备例所述蝉花虫草子实体的培养方法同制备例3，其区别仅在于，所述固体基质中不含有所述桑枝碎粒。
实施例1
取上述制备例3中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例2
取上述制备例4中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例3
取上述制备例5中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
实施例4
取上述制备例6中采收的蝉花虫草子实体100g进行粉碎，并加入3倍量的40v/v％的乙醇溶液进行混匀，以及加入5g肌氨酸进行辅助提取，常温下提取2h；收集提取液经纱布过滤，收集滤液上D101大孔吸附树脂进行分离，控制树脂的用量为子实体：树脂＝1：10g/ml，以3倍柱体积的体积浓度20v/v％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩，备用；以体积分数为15％甲醇水溶液对上述浓缩物进行溶解，配置成100mg/ml的供试品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤，注入制备型高效液相色谱进行分离，所述制备型高效液相色谱的条件包括：
色谱柱：C18键合相填料；
进样体积：10ml；
洗脱液：体积浓度15％甲醇-水溶液
流动相流速：160ml/min；
检测波长：紫外检测器260nm检测；
收集保留时间分别为14.6-15.2min的色谱峰组分，即为目标产物(N6-(2-羟乙基)腺苷)的流份，其外观为白色粉末，经对照产物正确。
对比例1
本对比例所述HEA的提取方法同实施例1，其区别仅在于，所述提取步骤中不加入所述肌氨酸。
实验例
分别收集上述实施例1-4及对比例1中分离的N6-(2-羟乙基)腺苷，称量并计算其得率，记录于下表1。
表1 N6-(2-羟乙基)腺苷的提取量
重量/g
得率/％
实施例1
8.15
8.15
实施例2
7.73
7.73
实施例3
6.43
6.43
实施例4
6.91
6.91
对比例1
7.41
7.41
可见，本发明所述提取方法可以有效提高蝉花虫草中N6-(2-羟乙基)腺苷的提取效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
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