具体实施方式

在以下的具体实施方式中将给出其他特征和优点，对本领域的技术人员而言，这些特征和优点根据所作描述就可以容易地看出，或者通过实践如以下描述连同权利要求和附图所述的实施方式而被认识。

文中所用的术语“和/或”在用于两项或更多项的罗列时，表示所列项中的任何一项可以单独使用，或者可以使用所列项中的两项或更多项的任意组合。例如，如果组合物描述为含有组分A、B和/或C，则组合物可仅含有A；仅含有B；仅含有C；含有A和B的组合；含有A和C的组合；含有B和C的组合；或含有A、B和C的组合。

在本文中，相对的术语，例如第一和第二，顶部和底部等仅用于区分一个实体或行为与另一个实体或行为，而非必须要求或暗示这些实体或行为之间的任何实际的这种关系或顺序。

本领域技术人员和制造或使用本公开的技术人员能够对本公开进行修改。因此，应理解，附图所示和上文所述的实施方式仅用于例示的目的，并且不旨在限制本公开的范围，根据专利法的原则(包括等同原则)所解释的，本公开的范围由所附权利要求限定。

出于本公开的目的，术语“连接”(所有形式的：连接、连接着的、相连接的等)一般意味着两个部件彼此直接或间接地结合。这种结合本质上可以是静止的或者本质上是可移动的。这种结合可以通过两个部件与任何另外的中间构件彼此一体地形成为单个整体来实现，或者通过该两个部件来实现。除非另有说明，否则这种结合本质上可以是永久性的，或者本质上可以是可移除的或可释放的。

如本文所用，术语“约”指量、尺寸、公式、参数和其他数量和特征不是精确的且无需精确的，但可按照要求是大致的和/或更大或者更小，如反映公差、转化因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员所知的其他因子。当使用术语“约”来描述范围的值或端点时，应理解本公开包括所参考的具体值或者端点。无论说明书中的范围的数值或端点是否使用“约”列举，范围的数值或端点旨在包括两种实施方式：一种用“约”修饰，另一种未用“约”修饰。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。

本文所用的术语“基本”、“基本上”及其变化形式旨在表示所述的特征等于或近似等于一数值或描述。例如，“基本上平面的”表面旨在表示表面是平面或大致表面。此外，“基本上”旨在表示两个数值相等或近似相等。在一些实施方式中，“基本上”可以表示彼此相差在约10％之内的值，例如彼此相差在约5％之内的值，或彼此相差在约2％之内的值。

本文所用的方向术语，例如上、下、右、左、前、后、顶、底，仅仅是参照绘制的附图而言，并不用来表示绝对的取向。

本文所用的术语“该”、“一个”或“一种”表示“至少一个(一种)”，并且不应局限为“仅一个(一种)”，除非有明确相反的说明。因此，例如，提到的“一个部件”包括具有两个或更多个这类部件的实施方式，除非上下文有另外明确的表示。

如本文所用的术语“下一代测序”或“NGS”定义为包括一种DNA测序技术类型，其利用对来自生物样品的许多DNA小片段进行平行测序来确定基因序列。NGS可用于对基因组中的每个核苷酸，或者小部分的基因组(例如外显子或预选的基因子集)进行测序。

在过去的几十年中，在对人类遗传变异进行分类并将这些变异与疾病易感性，对特定疗法的反应性，对危险药物副作用的易感性以及其他医学上可操作的特征相关联方面取得了非凡的进步。NGS的进展已经降低了每兆碱基的成本并增加了测序的基因组的数目和多样性。全基因组测序进展的关键是使用流动池将生物DNA样品产生的数百万个DNA片段分配到流动池的表面上，以便可对几乎所有固定的片段同时测序。一些NGS技术，尤其是短读测序技术，包括将DNA片断共价固定到流动池的表面上进行测序。对于测序效率和质量来说，重要的是实现将DNA分子稳定、可重复和最佳地附接到流动池表面上的能力。

本公开的实施方式一般涉及核酸分析，更具体地，涉及用于例如大规模平行基因组分析(例如，下一代测序，NGS)的微流体流动池装置的制造和使用方法。许多重要的分子应用，例如DNA微阵列、NGS或基于DNA的生物传感器可以使用合成的DNA探针分子，其附接于包括平坦二维表面的固体载体，例如玻璃、二氧化硅或硅载片，以及附接于三维表面，例如微珠和微米颗粒/纳米颗粒。DNA探针分子在微流体表面上的固定化通常可使用多种方法来实现，例如，静电相互作用、共价偶联、包埋等。用于将DNA探针共价附接于表面的一种技术涉及使用双官能链接分子，利用酰胺键将DNA探针分子与存在胺的表面连接。例如，许多基于光学检测的基因测序方法的共同点是使用含有高密度寡核苷酸引物或探针的表面，其中，DNA引物共价附接于该表面。然而，基于酰胺键的共价附接相对于剧烈的测序循环一般伴随着相对较低的稳定性，因此只能实现较短的读取长度。

本公开提供了用于将胺封端的DNA引物分子共价连接到固体载体上的材料和方法，以用于核酸分析，尤其是基因测序。本公开还提供了用于共价捕获胺封端的DNA探针片段的反应性表面。可精确控制片段密度和位置，以使得可在空间上控制多克隆簇的合成和生长，并且有效地测序且具有提高的质量和精确度。

根据本公开的各个方面，提供了流动池制品10。流动池制品10包括具有一个或多个层16的基材14；设置在基材14中的流体通道18，其中，所述流体通道18包括至少一个反应性表面22，其具有偶联剂26，所述偶联剂26具有利用酰亚胺键共价附接于聚合物38的第二官能团34(例如，伯胺)和共价附接于流体通道18的基材14的第一官能团30，被共价附接的聚合物38可用式(I)表示：

R₁是已经与马来酐共聚的不饱和单体的残基；R₂是H、烷基、低聚(乙二醇)和/或二烷基胺。m、n和o各自为1至10,000。X是二价NH、O和/或S。Z是第一官能团30。

现在参考图1，其根据本公开的一些方面提供了与多个核酸引物分子42共价连接的流动池制品10的示意图。固体载体或基材14操作性地连接到偶联剂26，其中，偶联剂26包括共价附接于基材14的第一官能团30和共价附接于聚合物38的第二官能团34。在一些方面中，偶联剂26的第一官能团30包括氨基硅烷和/或氨基有机磷酸酯。聚合物38包括连接头基团36，其可以用于共价连接第二官能团34以形成聚合物连接35。在一些方面中，相同类型的连接头基团36可以用于使用相同或不同类型的聚合物连接35共价连接多个核酸引物分子42和第二官能团34。作为对传统使用的更具反应性的酰胺或酯连接的替代，在一些方面中，用于本文公开的实施方式中的聚合物连接35可以包括酰亚胺官能团，其可通过伯胺与酐官能团之间的缩合反应形成。在一些方面中，连接头基团36是琥珀酐基团，第二官能团34是伯胺，并且对应的聚合物连接基团35是酰亚胺。完全合成的流动池制品10除了通过聚合物38共价连接到基材14的至少一个核酸引物分子42之外，还包括使用偶联剂26共价结合到聚合物38的基材14。DNA结合的流动池制品10将定位成面向或延伸到流体通道18中，以提供反应性表面22，用于捕获或结合期望的DNA片段。

在一些方面中，聚合物38可以包括含有酐官能性的聚合物。在一些方面中，聚合物38可以包括聚(乙烯-共-马来酐)(EMA)、聚乙烯-接枝-马来酐、聚丙烯-接枝-马来酐、聚(乙烯/马来酐)、聚(乙烯-共-丙烯酸乙酯-共-马来酐)、聚(异丁烯-共-马来酐)、聚(马来酐-共-1-十八烯)、聚(苯乙烯-共-马来酐)、聚(苯乙烯-共-马来酸)，或它们的组合。上文所列的每种共聚物可以包括交替共聚物(例如ABABAB)，嵌段共聚物(例如AAABBBAAABBB)和/或无规共聚物(例如ABBABAABAB)结构。例如，在一些方面中，聚合物38可以包括聚(乙烯-共-马来酐)，其中，乙烯和马来酐单体以交替、无规或嵌段结构结合在一起。在一些方面中，m与n的相对比(m:n)为约0.5至约10。

在一些方面中，用于共价结合和连接偶联剂26的聚合物38以下式(II)表示：

其中：R₁是已经与马来酐共聚的不饱和单体的残基；R₂是H、烷基、低聚(乙二醇)和/或二烷基胺；n和o各自为1至10,000的整数；并且X是二价NH、O和/或S。当乙烯与马来酐共聚时，不饱和单体的残基R₁将会是例如双基乙基基团。一旦具有式(II)的聚合物38与第二官能团34反应，则聚合物38的改性结构由下式(I)表示：

其中：R₁、R₂和X全部如上式(II)中所列；m、n和o各自为1至10,000的整数；并且Z是第一官能团30。在一些方面中，例如，对于流动池系统，可以使用并入到聚合物骨架中的反应性琥珀酐官能，通过与核酸引物分子42的胺基团形成酰亚胺连接，将核酸引物分子42共价结合、连接和附接到具有式(I)的聚合物38。

在一些方面中，本公开还可以提供具有经DNA探针分子改性的表面的流动池，其中，DNA探针分子的密度可得到精确控制，从而可实现优异的DNA杂交，后续的多克隆簇形成和测序。通过在特定浓度的第二调节小分子(例如，表面改性分子50)的存在下用胺封端的DNA探针分子孵育经聚合物改性的流动池表面，DNA探针分子可共价附接于涂覆有胺反应性聚合物的流动池表面。

仍然参考图1，可以使用表面改性分子50来控制偶联剂26和/或核酸引物分子42偶联反应到聚合物38的程度(例如量或广度)，这可控制或确定所附接的核酸引物分子的密度。核酸引物分子42与表面改性分子50的比值可以决定位于反应性表面22处的核酸引物分子42的量或密度。在一些方面中，取决于给定应用所需的密度，核酸引物分子42与表面改性分子50的摩尔比(P:S)例如可以是0.01:1、0.1:1、1:1、1:2、1:5、1:10；1:20、1:50、1:100、1:1000、1:10,000等比值，包括介于其中的数值和范围。例如，在可以使用桥式扩增方法实现成簇的一些方面中，核酸引物分子42的密度可以相对较低(例如，每平方微米的流体通道18表面积具有10,000或100,000个核酸引物分子42)。当使用模板行走方式实现成簇时，核酸引物分子42的密度可以相对较高(例如，每平方微米的流体通道18表面积具有250,000或500,000个核酸引物分子42)。

在一些方面中，表面改性分子50可以是含胺的小分子。在一些方面中，R₂可以是表面改性分子50。表面改性分子50例如可包括乙醇胺、N,N-二甲基乙二胺、N,N-二乙基乙二胺、(2-氨基乙基)-三甲基铵、胺封端的聚乙二醇和/或低聚乙二醇。表面改性分子50还可防止在测序期间生物分子与聚合物38的表面非特异性结合，并且在测序循环中减少背景信号。在另一些方面中，表面改性分子50可在聚合物涂覆期间引入，或者可在核酸引物分子42官能化步骤期间引入。在一些方面中，表面改性分子50可包括，例如但非必需限于单氨基、二氨基和三氨基硅烷，例如，y-氨基丙基硅烷、3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、3-氨基丙基二甲基甲氧基硅烷、3-氨基丙基(二乙氧基)甲基硅烷、氨基丙基倍半硅氧烷(APS)、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺、N1-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺、乙二胺、丙胺、烯丙基胺、乙醇胺、(2-氨基乙基)三甲基铵或其组合。

在一些方面中，核酸引物分子42例如可以是胺封端的核酸或核酸片段。在一些方面中，核酸引物分子42可具有表面密度，例如，每个聚合物38的链具有1至10,000个核酸引物分子42。在另一些方面中，核酸引物分子42可具有密度，例如，每平方微米的流体通道18的表面积具有1至500,000个核酸引物分子42。在另一些方面中，当需要多克隆成簇进行测序时，核酸引物分子42的密度例如可以是每平方微米(μm2)的流体通道18的表面积具有1,000至500,000个核酸引物分子42。替代性地，当需要单个分子分析进行测序时，核酸引物分子42的密度例如可以是每平方微米的流体通道18的表面积具有1至约1000个核酸引物分子42。在一些方面中，核酸引物分子42例如可以是5’-胺封端的dA30、3’-胺封端的dA30、胺封端的dT30和类似的探针分子。在另一些方面中，核酸引物分子42可以被RNA探针分子取代以用于对RNA进行测序。

在一些方面中，流动池制品10例如可包括使用例如本领域已知的技术结合在一起的至少两个固体基材14，这些技术包括，例如激光辅助工艺、胶带、聚酰亚胺粘合剂、压敏粘胶带或其组合。在一些方面中，这两个基材14可由相同材料制成，或者在另一些方面中，这两个基材可由不同材料制成。根据应用，基材14例如可以是塑料、玻璃、硅、熔凝二氧化硅或石英。流动池制品10限定了腔室、腔体和/或液体通道18。流动池制品10可包括，例如用于介质流动的端口，其将液体引导到腔室中以及从腔室中引导出[参见Illumina.com；亿明达测序技术公司(Illumina Sequencing Technology)，聚焦：测序]。在一些方面中，基材14可以包含玻璃、玻璃陶瓷、硅、熔凝二氧化硅、石英、热塑性塑料或热固性塑料。

现在参考图2，其根据本公开的一些方面提供了包括与附接于基材14的偶联剂26共价结合的聚合物38的中间微流体装置44的示意图。图2所示的中间微流体装置46包括涂覆在将位于流体通道18内的基材表面上的聚合物38。位于中间微流体装置44的流体通道18中的基材14的表面可以首先用偶联剂26涂覆。如所例示的，在一些方面中，偶联剂26可以包括氨基硅烷。使用氨基硅烷作为偶联剂26提供了待用作第一官能团30的硅烷和待用作第二官能团34的胺。一旦作为第一官能团30的硅烷共价连接(例如，形成共价键)到基材14的表面，则用作第二官能团34的胺可以共价连接到聚合物38。在一些方面中，用于连接胺的聚合物38上的琥珀酐部分或连接头基团36(参见图1)可以缩合以形成酰亚胺连接或酰亚胺键，其中，在缩合反应中生成水分子。所得到的聚合物38共价连接到偶联剂26以在基材14上形成包含三种不同类型的官能团的涂层：1)将偶联剂26共价连接到聚合物38的酰亚胺基团；2)并入到聚合物骨架中的胺反应性酐基团(例如，琥珀酐基团)，其支持偶联剂26和DNA片段42的附接；和3)用于促进调节DNA密度和表面性质的改性剂官能团(例如，酯、胺、羧酸、羧酸酯和/或硫代酯)。

仍然参考图2，偶联剂26可以包括氨基硅烷，同时固体基材可以是玻璃、玻璃陶瓷、硅、熔凝二氧化硅、热塑性材料、热固性材料和/或石英。氨基硅烷可以包括同时含有伯胺和硅烷官能团的分子，通常，伯胺和硅烷官能团利用例如烷基、烷氧基和/或二醇基彼此连接。在一些方面中，氨基硅烷可以包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、3-(2-氨基乙基)-氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基甲基二烷氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷、4-氨基-3,3-二甲基丁基三甲氧基硅烷、N-(6-氨基己基)氨基甲基三乙氧基硅烷或其组合。在一些方面中，氨基硅烷的硅烷可包括，例如，倍半硅氧烷或其混合物。在另一些方面中，氨基硅烷例如可包括3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷，并且倍半硅氧烷例如可以是氨基丙基倍半硅氧烷。

现在参考图3，其根据本公开的一些方面提供了包括与偶联剂26共价结构的聚合物38的中间微流体装置44a的示意图，所述偶联剂26附接于基材14上的金属氧化物层46。中间微流体装置44a包括涂覆在基材表面上的聚合物38。在一些方面中，中间微流体装置44a的基材14的表面可以首先用金属氧化物层46来涂覆，其中，金属氧化物层46可以接着用偶联剂26来涂覆。如所例示的，在一些方面中，偶联剂26可以包括氨基有机磷酸酯。使用氨基有机磷酸酯作为偶联剂26提供了待用作第一官能团30的有机磷酸酯和待用作第二官能团34的胺。一旦第一官能团30或有机磷酸酯共价连接(例如，形成共价键)到基材14的金属氧化物层46的表面，则第二官能团34或胺可以共价连接到聚合物38。在一些方面中，用于连接胺的聚合物38上的琥珀酐部分或连接头基团36(参见图1)可以缩合以形成酰亚胺连接或酰亚胺键，其中，在缩合反应中生成水分子。

仍然参考图3，偶联剂26可以包括氨基有机磷酸酯，其中，固体基材14连接或涂覆有金属氧化物层46。用于金属氧化物层46的金属氧化物可以包括，例如但不限于Al₂O₃、ZnO₂、Ta₂O₅、Nb₂O₅、SnO₂、MgO、氧化铟锡、CeO₂、CoO、Co₃O₄、Cr₂O₃、Fe₂O₃、Fe₃O₄、In₂O₃、Mn₂O₃、NiO、a-TiO₂(锐钛矿)、r-TiO₂(金红石)、WO₃、Y₂O₃、ZrO₂。在一些方面中，金属氧化物层46在可见波长范围(例如，400nm至750nm)内是透明的。例如，金属氧化物层46在可见波长范围内的透射率可以为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。

在一些方面中，氨基有机磷酸酯可以包括具有伯胺和有机磷酸酯官能团中的至少一种或两种的分子。氨和有机磷酸酯官能团可以利用例如烷基、烷氧基和/或二醇基彼此连接。氨基有机磷酸酯可以包括3-氨基丙基磷酸二氢酯、4-氨基苯基磷酸酯、2-氨基乙基磷酸二氢酯、2-(3-氨基丙基)氨基乙基硫代磷酸酯或其组合。

现在参考图4A-4C，其根据本公开的一些方面，提供了具有聚合物涂层的流体通道表面的扫描电子显微图像。微流体通道18的表面具有稳定的聚合物涂层，其经过了胺封端的dA30引物DNA部分处理，所呈现的三幅该表面的扫描电子显微图像包括：与dA30反应后，(A)表面的低分辨率SEM图像，其示出了两个区域：左(a)和右(b)；(B)表面A的左边部分的高分辨率SEM图像，其显示出聚合物作为纳米颗粒存在；和(C)表面A的右边部分的高分辨率SEM图像，这些图显示出，大多数聚合物纳米颗粒是打开的以在表面上形成均匀的dA30-聚合物涂层。

仍然参考图4A-4C，一旦使用初始的酰亚胺键共价附接到表面，则聚合物38可以为纳米颗粒形式，尤其是单链纳米颗粒形式，而不是扩展的聚合物链形式。纳米颗粒涂层方案能够通过用在有机溶剂的混合物中的聚合物孵育带胺表面来实现，其中，每个单独的聚合物自组装成纳米颗粒。有机溶剂的混合物包含以下物质，基本上由以下物质组成，或者由以下物质组成：聚合物可溶性溶剂，例如，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)；和聚合物不溶性溶剂，例如，异丙醇(IPA)。如图4A和4B所示，通过偶联剂，主要利用酰亚胺键共价附接于表面的聚合物包括独立的纳米颗粒，基本上由独立的纳米颗粒组成，或由独立的纳米颗粒组成。然而，一旦通过DNA引物(此处为5’-氨基-C6-dA30)官能化，则聚合物纳米颗粒变成打开并覆盖整个表面以形成均匀的涂层，如图4A和4C所示。由于DNA是带负电荷的，因此，DNA分子之间的自排斥将造成聚合物分子扩展而覆盖整个表面，即使附接的聚合物纳米颗粒之间存在空间也如此。还值得注意的是在附接于基材后，聚合物纳米颗粒分布良好。不囿于任何理论，认为这是由于聚合物颗粒在溶剂中的公知的拥挤效应。通过使用dA30官能化表面合成，连同基于模板行走的成簇和可逆的终止子DNA合成化学进行的测序显示出，经EMA纳米颗粒涂覆的表面能够实现平均75个读数，而经扩展的EMA聚合物链涂覆的表面仅允许平均几个读数(<10bp)。通过控制聚合物38的浓度和用于涂覆的反应持续时间，可以控制共价附接于基材的聚合物纳米颗粒的密度。用于涂覆过程的低浓度聚合物38可得到附接的较低密度的聚合物纳米颗粒。基于聚合物拥挤效应和被连接的DNA引物分子诱导扩展后每个聚合物的有限的表面覆盖，可将经聚合物涂覆的基材视作图案化表面，即使聚合物纳米颗粒可具有不同尺寸(如图4B所示)。因此，当所附接的聚合物纳米颗粒的密度低时(例如，1个聚合物纳米颗粒/10,000nm2、或1个聚合物纳米颗粒/20,000nm2、或1个聚合物纳米颗粒/40,000nm2、或1个聚合物纳米颗粒/100,000nm2、或1个聚合物纳米颗粒/250,000nm2、或1个聚合物纳米颗粒/1000,000nm2)，可在被单个聚合物纳米颗粒覆盖的区域内产生单个簇，因此有效地形成无规但分离良好的簇阵列。这对于高密度的图案化测序应用来说特别有用。

现在参考图5A-5B，其根据本公开的一些方面，提供了具有8个通道的流动池制品的照片图(5A)和荧光图(5B)，每个通道包括附接于聚合物涂层的胺封端的dA30，基本上由其组成或者由其组成。图5A示出了整个流动池的照片图，并且图5B示出了在与Cy3-标记的dT30杂交后，具有8个通道的整个流动池的共聚焦荧光图，每个通道包括附接于反应性聚合物涂层的胺封端的dA30，基本上由其组成，或者由其组成。

具体地，首先用y(伽马)-氨基丙基硅烷涂覆所有通道，随后共价附接丙胺衍生化的聚(乙烯-交替-马来酐)。

之后，在100微M的乙醇胺的存在下，用50微M的5’-胺封端的dA30孵育所有通道，随后如下所述进行进一步处理。从顶部到底部，通道1至8为：通道1、2、7和8：用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三次；通道3和6：用0.05M NaOH孵育5分钟，用PBS清洗三次；以及通道4和5：用60℃水清洗五次，每次1分钟。最后，所有通道均用1微M的Cy3标记的dT30孵育45分钟。在用PBS清洗三次并干燥后，使用共聚焦显微技术扫描整个流动池。将采集的所有荧光图像组装在一起以形成如图所示的整个流动池的荧光图像。

现在参考图6，提供了显示出针对用于将偶联剂共价结合到用于附接DNA的聚合物涂层的酰胺连接和酰亚胺连接，测序读取长度的比较性差异的图。该图例示了两种聚合物涂层的测序读取长度的比较性差异：附接的一种聚合物使用酰胺键连接；附接的另一种聚合物使用酰亚胺键连接。

在本公开的一些方面中，使用两步顺序反应方案在含酐的聚合物38和偶联剂26的胺末端基团之间形成酰亚胺键。首先，聚合物的酐基团与表面上的胺基团反应以形成酰胺键，随后通过热处理(120至150℃持续几个小时)环合以形成酰亚胺键。如图6所示，通过使用dA30官能化表面合成，连同基于模板行走的成簇和可逆的终止子DNA合成化学进行的测序显示出，经酰亚胺键共价附接于带胺表面的聚合物允许平均75个读数，而经酰胺键共价附接于带胺表面的聚合物仅允许平均25个读数。考虑到酰亚胺键对抗苛刻处理(例如，NaOH、剧烈洗涤、室温到高温的温度循环)的高稳定性，进一步优化DNA附接(例如，密度和分布)可进一步显著增加读取长度(例如，对于单次末端测序高至200个读数)。此处，微流体通道表面经过相同的涂层和官能化方案处理，但是利用3小时的120℃热处理来驱动酰亚胺键形成。

在本公开的一些方面中，提供了制造流动池制品10的方法。所述方法包括：使设置在基材14中的流体通道18与偶联剂26接触，以将第一官能团共价附接于流体通道18；使式(II)的聚合物38与偶联剂26接触以将聚合物38共价附接于第二官能团34，从而在系连的聚合物上形成酰亚胺连接；

其中：R₁是已经与马来酐共聚的不饱和单体的残基；R₂是H、烷基、低聚(乙二醇)和/或二烷基胺；n和o各自为1至10,000的整数；并且X是二价NH、O和/或S。所述方法还可以包括：使核酸引物分子42与系连的聚合物38(参见式(II))接触以将核酸引物分子42共价附接于系连的聚合物38。在一些方面中，使核酸引物分子42与系连的聚合物38接触可以任选地包括表面改性分子50的存在，以将核酸引物分子42共价附接于使用偶联剂26连接到基材14的聚合物38，从而形成流动池制品10。在一些方面中，控制附接于聚合物38的核酸引物分子42的密度可以通过相对于核酸引物分子42使用各种比例的表面改性分子50来实现。

应理解，阐述和教导前述流动池制品10的描述可以任何组合来使用，这些描述同样可很好地适用于流动池制品10的制造方法和使用方法。

在一些方面中，制造流动池制品的方法还可包括：通过提前确定和选择(例如通过化学计量)聚合物与核酸引物分子42的比值来控制核酸引物分子42的密度。

在本公开的另外的方面中，本公开提供了用于对核酸进行测序的方法，所述方法包括：提供流动池制品10，所述流动池制品10具有：具有一个或多个层的基材14；设置在基材14中的流体通道18，其中，所述流体通道18包括至少一个反应性表面22，所述反应性表面22包括偶联剂26，所述偶联剂26具有共价附接于流体通道18的基材14的第一官能团30和共价附接于具有酰亚胺官能连接的式(I)的聚合物的第二官能团34：

其中：R₁是已经与马来酐共聚的不饱和单体的残基；R₂是H、烷基、低聚(乙二醇)和/或二烷基胺；m、n和o各自为1至10,000；X是二价NH、O和/或S；并且Z是第一官能团30。用于对核酸进行测序的方法还包括：使核酸引物分子42与系连的聚合物38接触，以将核酸引物分子42共价附接于系连的聚合物38。

在一些方面中，一旦生产了流动池制品10，则可实施用于对核酸片段进行测序的方法。所述方法还包括：使核酸引物分子42与式(I)的聚合物38接触以将核酸引物分子42共价附接于式(I)的聚合物38；使用核酸引物分子42捕获DNA片段，其中，每个DNA片段包含与核酸引物分子42互补的序列；以及将核苷酸添加到核酸引物分子42的端部以合成针对被捕获的每个DNA片段的互补DNA序列，其中，互补DNA序列通过核酸引物分子42共价连接到式(I)的聚合物38。在一些方面中，用于对核酸片段进行测序的方法还可以包括：使来自DNA片段的互补DNA序列变性；从流动池制品收集DNA片段；使用通过核酸引物分子42共价连接到式(I)的聚合物的互补DNA序列来合成目标DNA片段；以及从流动池制品10收集目标DNA片段。

在一些方面中，捕获来自样品的DNA片段——每个DNA片段包括与核酸引物分子42互补的序列——以及从引物分子42的端部共价添加核苷酸的步骤可以用于合成针对每个捕获的片段的互补DNA序列。如应用所期望的，这些互补的DNA片段可单独或分开地共价连接到系连的聚合物。然后可以使双链DNA、互补DNA序列和捕获的DNA片段变性并且可收集并除去对应的链。在一些方面中，在除去了DNA片段后，可以使用聚合酶链反应使每个互补DNA或DNA片段本地扩增以形成单克隆簇。取决于用于荧光成像的光学系统的分辨率，所得到的簇可以具有50nm至1000nm直径的尺寸。所述合成方法提供了可对基于合成测序的下一代测序(NGS)技术特别有用的技术，在该技术中，一般先形成多克隆簇再进行测序。在核酸引物分子42和DNA分子连接于基材14的流体通道18之后，可使用例如桥式扩增、排他性扩增或模板行走方法来实现簇生成。

应理解，阐述和教导前述流动池制品10的描述可以任何组合来使用，这些描述同样可很好地适用于用于对核酸片段进行测序的方法。

本公开能够实现将胺封端的核酸引物分子42(例如，5’-胺-dA30或5’-胺-dT30)迅速地共价连接到基材14。所述连接例如可在1小时内完成。

相比于使用双官能连接或其他手段的连接，本公开将核酸引物分子42更稳定地附接到基材上。这部分是由于聚合物层对带胺表面(例如APTES)的多价、牢固的锚定，以及部分是由于酰亚胺键的形成。由于DNA测序常需要运行许多个反应循环，并且涉及一些苛刻的处理，例如在测序读取之前的NaOH清洗以使任何双链DNA变性，因此，这种稳定键合附接是重要的。使用通过琥珀酐官能团与构建到偶联剂26和/或核酸引物分子42中的伯胺反应所形成的酰亚胺连接提供了化学抗性和稳定的共价化学连接，该共价化学连接抵抗由于测序化学所用的这些苛刻的化学处理引起的降解损失或表面分离。

本公开还提供了精确控制核酸引物分子42与含有与探针互补的衔接子序列的靶DNA片段之间的杂交(并最终使其更有效杂交)的方法。这主要是由于聚合物链的柔性所致，即使在涂覆后也如此。相反，对于基于双官能连接的DNA附接，这些DNA分子极靠近表面，因此阻止了有效杂交。

本公开还提供了对附接于表面的核酸引物分子42的密度的精确控制，这允许实现DNA杂交效率和随后的成簇效率的用户决定性调整。这种控制可以两种不同化学反应中的任一种来实现。第一种，用表面改性分子50(例如，丙胺等)使胺反应性聚合物部分改性和衍生化。这种官能化可有助于控制聚合物38在用于涂覆的溶液中的溶解度以及一旦附接于基材14的偶联剂26时的反应位点。第二种，在所需浓度的表面改性分子50(例如，乙醇胺或类似试剂)的存在下，可以用胺封端的核酸引物分子42孵育经胺反应性聚合物38改性的表面。该步骤控制了共价连接反应，进而控制了附接的核酸引物分子42的密度。这两种不同反应的组合允许对附接于基材14的流体通道18的核酸引物分子42或DNA/RNA引物分子进行优异的密度控制，并最终对所形成的簇的密度进行控制，并具有优异的测序效率。

本公开还可适用于使用纳米图案化流动池的NGS。纳米图案化可使用最先进的光刻法或纳米压印法来实现。在一些方面中，流动池制品10可以包括具有胺反应性聚合物涂层和共价结合的核酸引物分子42的离散点的阵列。纳米图案化可例如使用最先进的光刻法或纳米压印技术来实现。在替代性实施方式中，低密度的聚合物纳米颗粒涂层可用作无规图案化表面，以使得形成的簇可受每个聚合物纳米颗粒限制，并且彼此很好地分离。

本公开还可以适用于使用基于核酸的生物传感器的不同生物分子分析技术，其中，附接的核酸引物分子42的密度对促成生物试验的成功可能是重要的。

本领域技术人员应理解，所述装置和其他部件的构造可以不限于任何特定材料。除非本文有另外说明，否则本文所公开的装置的其他示例性实施方式可以由各种材料形成。

出于本公开的目的，术语“连接(couple)”(以其所有形式：连接的、连接着、相连接等)一般意味着两个部件彼此(电气或机械地)直接或间接地结合。这种结合本质上可以是静止的或者本质上是可移动的。这种结合可以通过两个部件(电学或机械部件)与任何另外的中间构件彼此一体地形成为单个整体来实现，或者通过该两个部件来实现。除非另有说明，否则这种结合本质上可以是永久性的，或者本质上可以是可移除的或可松脱的。

同样重要的是应注意，如示例性实施方式中所示，装置的元件的构造和布置仅是说明性的。尽管在本公开中仅详细描述了本发明创造的一些实施方式，但是审阅本公开的本领域技术人员易于理解，可以进行许多修改(例如，改变各种元件的大小、尺寸、结构、形状和比例；参数值；安装布置；材料的使用；色彩、取向等)而不会实质上背离本文所述主题的新颖教导和优点。例如，以整体形成示出的元件可以由多个零件构成，或者以多个零件示出的元件可以整体地形成，可以颠倒或以其他方式改变界面的操作，可以改变系统的结构、和/或构件、或连接件、或其他元件的长度或宽度，可以改变各元件之间的调节位置的性质或数目。应注意，系统的元件和/或组装件可以由多种材料中的任何一种构造，这些材料在各种颜色、纹理和组合中的任何一种上提供足够的强度或耐久性。因此，所有这些修改均旨在包括在本发明的范围之内。可以对所需的示例性实施方式及其他示例性实施方式的设计、操作条件和布置进行其他替代、修改、改变和省略，而不背离本发明的精神。

应理解，所述方法中的任何描述的过程或步骤可以与所公开的其他过程或步骤组合以得到本装置的范围内的结构。本文公开的示例性结构和方法用于例示的目的，而不应解释为限制。

还应理解的是，可以对上述结构进行各种变化和修改而不脱离本公开的构思，并且还应进一步理解的是，这些构思旨在由所附权利要求涵盖，除非这些权利要求通过其语言描述另有说明。

上述描述被认为仅是所示实施方式的描述。本领域技术人员和作出或使用所述装置的技术人员能够对所述装置进行修改。因此，应理解，附图所示和上文所述的实施方式仅用于例示的目的，并且不旨在限制所述装置的范围，根据专利法的原则(包括等同原则)所解释的，所述装置的范围由所附权利要求限定。