一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法
阅读说明：本技术 一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法 (Lepidium meyenii glucosinolate extract and preparation method thereof ) 是由 陈晨 周国英 李晶晶 王博 杨路存 熊丰 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法,属于医药技术领域。该独行菜硫代葡萄糖苷提取物是由十字花科独行菜属植物提取制备而成的硫代葡萄糖苷提取物,其中硫代葡萄糖苷总含量大于50％。本发明还提供了一种从独行菜中提取硫苷提取物的方法,该提取方法操作简便,成本低；并且与现有从十字花科植物中提取硫苷提取物相比,采用独行菜提取的硫苷提取物的收率高,得到的硫苷提取物中硫苷含量大,在本发明提取方法下硫苷提取物中硫苷含量大于50％,克服了现有技术从十字花科植物中提取硫苷提取物收率低,含量低的问题,具有良好的应用前景。(The invention provides a Lepidium Sativum glucosinolate extract and a preparation method thereof, belonging to the technical field of medicines. The Lepidium Sativum glucosinolate extract is prepared from Lepidium plant of Brassicaceae, wherein the total content of glucosinolate is more than 50%. The invention also provides a method for extracting the glucosinolate extract from the Lepidium Sativum, and the extraction method is simple and convenient to operate and low in cost; compared with the existing extraction method of the glucosinolate from cruciferous plants, the extraction method of the invention has the advantages that the yield of the glucosinolate extract extracted from the Lepidium meyenii Walp is high, the content of the glucosinolate in the obtained glucosinolate extract is high, the content of the glucosinolate in the glucosinolate extract is more than 50%, the problems of low yield and low content of the glucosinolate extract extracted from the cruciferous plants in the prior art are solved, and the extraction method of the glucosinolate in the Lepidium meyenii Walp has.)
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法。
背景技术
独行菜系十字花科独行菜属多年生草本植物，世界各地均有分布，在中国主要产于内蒙古、西藏、青海等地海拔1800～4250m的村旁、田边、山坡及盐化草甸；全草入药，有清热燥湿，治菌痢、肠炎作用。
硫代葡萄糖苷(Glucosinolates)，简称硫苷，是十字花科蔬菜中的一种重要的次生代谢产物，根据侧链基团的不同，可以把硫苷分为脂肪族、芳香族和吲哚族三大类。已发现的硫苷有120多种。存在于十字花科蔬菜中的约有15种。而存在于芥菜类蔬菜中就有9种。
研究表明，硫苷具有许多生物活性，如杀菌杀虫、抗肿瘤、调节内分泌功能以及改善性功能等。近年来随着世界肿瘤病人逐年增加，对各种新型抗肿瘤药物的需求量急剧上升，市场上具有硫苷类抗癌性质的产品，主要是以化学合成为主。虽然具有一定抗癌的功能作用，但是工序复杂，条件不易控制，不能在医药上大量地推广。因此对硫代葡萄糖苷研究的主要趋势是朝着纯天然提取、安全可靠、医药价值的方向发展。这样可以解决市场上的硫代葡萄糖苷稀有、昂贵的问题，并使其各个方面得到改善，消费者易于接受，不仅可以改善人们的健康问题，而且可以创造巨大的经济价值。
目前已有从天然植物中提取硫代葡萄糖苷，如从十字花科、番木瓜科、辣木科中提取而得，其中以十字花科为主。如：专利CN103416733A公开了一种新鲜西兰花的硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法。文中提到硫代葡萄糖苷溶解于水，理论上可以使用水提取，但是实际上西兰花中有黑芥子酶，在提取过程中硫代葡萄糖苷大量分解，其分解产物又不稳定，无法得到需要的功能产品；而酒精提取得率很低；因此采用灭酶的方法提取。得到的硫代葡萄糖苷含量占产品重量的2.4％-2.7％，100公斤新鲜原料可以获得2.9公斤产品，收率为2.9％。专利CN103421055A从青花菜茎叶废弃物中提取硫代葡萄糖苷，利用阴离子交换柱提取，收率为1.4％。专利CN104055822B公开了恰玛古硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法，提高了硫代葡萄糖苷提取物中硫代葡萄糖苷的平均含量，通过计算提高后硫代葡萄糖苷提取物中硫代葡萄糖苷的平均含量为0.7％。
可见，目前从十字花科中提取硫代葡萄糖苷提取物存在收率低，提取物中硫代葡萄糖苷含量低等问题。同时，目前尚未见从独行菜中提取硫代葡萄糖苷提取物。
发明内容
本发明的目的是提供一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物及其制备方法。
本发明提供了一种独行菜硫代葡萄糖苷提取物，它是由十字花科独行菜属植物提取制备而成的硫代葡萄糖苷提取物，其中硫代葡萄糖苷总含量大于50％。
进一步地，所述的提取物中含有：白芥子苷、黑芥子苷、3-Methylthiopentylglucosinolate，Glucoarabidopsithalianain，3-Ethylsulfinylpropyl glucosinolate。
进一步地，所述的提取物的总离子流图如图1所示，其质谱条件为：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；雾化气(GS1)：55psi；雾化气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：600℃(正)；离子源电压(IS)：5500V(正)；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOFMS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
进一步地，所述的十字花科独行菜属植物为独行菜Lepidium apetalum或宽叶独行菜Lepidium latifolium Linnaeus。
本发明还提供了前述的硫代葡萄糖苷提取物的制备方法，它包括如下步骤：
(1)取独行菜，加入醇溶液提取；
(2)将提取液离心，取上清液；
(3)将上清液经凝胶色谱柱富集，然后使用缓冲液冲洗杂质，再加入硫酸酯酶过夜，再用水冲洗后干燥，即得。
进一步地，步骤(1)中，所述醇溶液为甲醇溶液或乙醇溶液；
和/或，步骤(1)中，所述独行菜与醇溶液的质量体积比为1g：2～20ml；
优选地，步骤(1)中，所述醇溶液为无水甲醇或无水乙醇；
和/或，步骤(1)中，所述独行菜与醇溶液的质量体积比为1g：10～15ml；
更优选地，所述独行菜与醇溶液的质量体积比为1g：12.5ml。
进一步地，步骤(1)中，所述提取为热回流提取；
优选地，步骤(1)中，所述热回流提取的温度为70～85℃；和/或，步骤(1)中，所述热回流提取的时间为1～3小时；
更优选地，步骤(1)中，所述热回流提取的温度为75℃；和/或，步骤(1)中，所述热回流提取的时间为2小时。
进一步地，步骤(3)中，所述凝胶色谱柱为DEAE Sephadex A25或DEAE SepharoseCL-6B；
和/或，步骤(3)中，所述缓冲液为乙酸钠缓冲液；
和/或，步骤(3)中，所述硫酸酯酶为硫酸酯酶水溶液；
优选地，步骤(3)中，凝胶色谱柱用咪唑甲酸盐预冲洗；
和/或，步骤(3)中，所述乙酸钠缓冲液pH为4；
和/或，步骤(3)中，所述硫酸酯酶水溶液的浓度为10～20μg/mL。
进一步地，
步骤(3)中，所述乙酸钠缓冲液的洗脱体积为柱体积的2-5倍；和/或，步骤(3)中，所述硫酸酯酶水溶液的洗脱体积为柱体积的1-3倍；
优选地，步骤(3)中，所述乙酸钠缓冲液的洗脱体积为柱体积的2-4倍；和/或，步骤(3)中，所述硫酸酯酶水溶液的洗脱体积为柱体积的2倍。
本发明还提供了一种组合物，它含有前述的硫代葡萄糖苷提取物。
本发明使用的独行菜为独行菜(学名：Lepidium apetalum)或宽叶独行菜(学名：Lepidium latifolium Linnaeus)。
本发明提供了一种从独行菜中提取硫苷提取物的方法，该提取方法操作简便，成本低；并且与现有从十字花科植物中提取硫苷提取物相比，采用独行菜提取的硫苷提取物的收率高，得到的硫苷提取物中硫苷含量大，在本发明提取方法下硫苷提取物中硫苷含量大于50％，克服了现有技术从十字花科植物中提取硫苷提取物收率低，含量低的问题，具有良好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的
具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明从独行菜中提取的硫苷提取物的总离子流图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
利用高效液相色谱检测干燥后提取物中的硫苷的含量。仪器：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；色谱条件：色谱柱为沃特世ACQUITY UPLC HSS T3(150mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈混合溶液为流动相B，线性梯度洗脱，0min2％B；5min 2％B；15min 15％B；42min 60％B；流速为0.3ml/min；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样量：2μl。
实施例1、本发明独行菜中硫苷提取物的制备
取独行菜500g，粉碎，加5000ml无水甲醇75℃热回流提取，提取时间为1小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sephadex A25凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。该硫苷提取物的收率为5.2％，硫苷提取物中硫苷含量为54％。
实施例2、本发明独行菜中硫苷提取物的制备
取独行菜1kg，粉碎，加15L无水乙醇85℃热回流提取，提取时间为2小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用4倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入3倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。该硫苷提取物的收率为5.4％，硫苷提取物中硫苷含量为55％。
实施例3、本发明独行菜中硫苷提取物的制备
取独行菜10kg，粉碎，加20L无水乙醇80℃热回流提取，提取时间为3小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用3倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入1倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。该硫苷提取物的收率为5.5％，硫苷提取物中硫苷含量为54％。
实施例4、本发明独行菜中硫苷提取物的制备
取独行菜2kg，粉碎，加25L无水乙醇75℃热回流提取，提取时间为2小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。该硫苷提取物的收率为5.4％，硫苷提取物中硫苷含量为54％。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1、独行菜中硫苷提取物的制备工艺的筛选
1、提取溶剂
取独行菜2kg，粉碎，加25L不同提取溶剂75℃热回流提取，提取时间为2小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。
利用高效液相色谱检测干燥后提取物中的硫苷的含量。仪器：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；色谱条件：色谱柱为沃特世ACQUITY UPLC HSS T3(150mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈混合溶液为流动相B，线性梯度洗脱，0min2％B；5min 2％B；15min 15％B；42min 60％B；流速为0.3ml/min；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样量：2μl。
具体提取溶剂和硫苷含量检测结果见表1。
表1.不同提取溶剂得到的提取物中硫苷的含量
提取溶剂
硫苷提取物中硫苷的含量
收率
无水甲醇
55％
5.2％
无水乙醇
57％
5.3％
70％甲醇
43％
4.8％
70％乙醇
38％
4.5％
水
43％
4.8％
从表1可见，使用无水甲醇和无水乙醇作为提取溶剂回流提取时，硫苷提取物中硫苷含量大于55％，收率高于5％；而使用70％甲醇、70％乙醇和水作为提取溶剂回流提取时，硫苷提取物中硫苷含量显著下降，不到45％，同时收率也显著下降，低于5％。因此，独行菜中硫苷提取物采用无水甲醇或无水乙醇作为提取溶剂回流提取效果最佳，硫苷提取物中硫苷含量以及收率都显著高于其他溶剂作为提取溶剂。
2、提取温度
取独行菜2kg，粉碎，加25L无水甲醇或无水乙醇在不同温度下热回流提取，提取时间为2小时，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。
利用高效液相色谱检测干燥后提取物中的硫苷的含量。仪器与色谱条件同“1、提取溶剂”。
具体提取溶剂和提取温度以及硫苷含量检测结果见表2。
表2.不同提取溶剂和提取温度得到的提取物中硫苷的含量
从表2可见，回流提取时，不管使用无水甲醇还是无水乙醇提取，最佳提取温度均为70-85℃，当提取温度为70-85℃时，收率与其他提取温度相似接近，甚至优于其他提取温度，但是硫苷提取物中硫苷含量均大于50％；而温度过高(90℃)或过低(60℃)时，硫苷提取物中硫苷含量显著下降，低于40％。因此，独行菜中硫苷提取物的最佳提取温度为70-85℃，其中提取温度为75℃时含量最高。
3、提取时间
取独行菜2kg，粉碎，加25L无水甲醇或无水乙醇75℃热回流提取不同时间，提取液高速离心后取上清液，上清液经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。
利用高效液相色谱检测干燥后提取物中的硫苷的含量。仪器与色谱条件同“1、提取溶剂”。
具体提取条件(提取溶剂和提取时间)和提取物检测结果(提取物中的硫苷的含量)见表3。
表3.不同提取溶剂和提取时间得到的提取物中硫苷的含量
从表3可见，不管使用无水甲醇还是无水乙醇提取，75℃提取的最佳提取时间为1-3小时，在该提取时间内硫苷提取物中硫苷含量均大于50％；而不管提取时间过长(4h)还是过短(0.5h)，在收率相近的情况下，硫苷提取物中硫苷含量均显著下降，低于35％。因此，从独行菜中提取硫苷提取物的最佳提取时间为1-3小时，其中提取时间为2h含量最高。
试验例2、本发明独行菜提取的硫苷提取物中油苷质谱表征
一、样品实验前处理方法
取独行菜2kg，粉碎，加25L无水乙醇75℃热回流提取，提取时间为2小时，提取液高速离心后取上清液，加入10mmol/L的芥子苷内标，内标加入后经DEAE Sepharose CL-6B凝胶色谱柱富集，用2倍柱体积pH为4的乙酸钠缓冲液冲洗杂质后，加入2倍柱体积浓度为20μg/ml的硫酸酯酶水溶液过夜，再用水冲洗后干燥，即得硫苷提取物。取硫苷提取物溶解后取上清液用于测试。
二、仪器设备
UPLC-Triple-TOF/MS系统：AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(美国Waters公司)，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱，配有电喷雾离子源(美国AB SCIEX公司)；Eppendorf minispan离心机(德国Eppendorf公司)
三、测试条件
色谱条件：色谱柱为沃特世ACQUITY UPLC HSS T3(150mm×2.1mm i.d.,1.8μm)；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以0.1％甲酸乙腈混合溶液为流动相B，线性梯度洗脱，0min2％B；5min 2％B；15min 15％B；42min 60％B；流速为0.3ml/min；柱温为50℃；检测波长为254nm；进样量：2μl。
质谱条件：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；雾化气(GS1)：55psi；雾化气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：600℃(正)；离子源电压(IS)：5500V(正)；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正,使质量轴误差小于2ppm。
四、检测结果及数据分析
从独行菜中提取的硫苷提取物总离子流图见图1。经分析鉴定，独行菜中硫苷类化合物含有白芥子苷、黑芥子苷、3-Methylthiopentyl glucosinolate，Glucoarabidopsithalianain，3-Ethylsulfinylpropyl glucosinolate。根据内标峰面积(出峰时间18.05min)测算出硫苷提取物含量大于50％。
根据上述实施例和试验例可知：从独行菜中提取硫苷提取物时，提取溶剂使用无水乙醇或无水甲醇，提取温度为70-85℃，提取时间为1-3小时时，在具有较高收率的情况下，得到的硫苷提取物中硫苷含量高，提取效果最佳。
综上，本发明提供了一种从独行菜中提取硫苷提取物的方法，该提取方法操作简便，成本低；并且与现有从十字花科植物中提取硫苷提取物相比，采用独行菜提取的硫苷提取物的收率高，得到的硫苷提取物中硫苷含量大，在本发明提取方法下硫苷提取物中硫苷含量大于50％，克服了现有技术从十字花科植物中提取硫苷提取物收率低，含量低的问题，具有良好的应用前景。
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