一种天麻大分子线性直链葡聚糖及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种天麻大分子线性直链葡聚糖及其制备方法和应用 (Rhizoma gastrodiae macromolecule linear straight-chain glucan and preparation method and application thereof ) 是由 李红燕 解万翠 杨锡洪 宋琳 车红霞 董秀芳 于 2020-12-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种天麻大分子线性直链葡聚糖及其制备方法和应用,属于中药学领域。本发明通过将天麻块茎干燥、粉碎、乙醇脱脂。于室温进行提取,提取液离心、浓缩后,进行醇沉,沉淀复溶,采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析,透析液浓缩后,经离子交换树脂和凝胶排阻色谱进一步分离纯化,得到天麻大分子线性直链葡聚糖。该多糖只由葡萄糖组成,为α-D-1,4连接的均聚葡聚糖,是一种新的葡聚糖。其在400μg/mL时,可显著促进巨噬细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬能力,促进巨噬细胞释放NO和细胞因子TNF-α和IL-6,增强机体免疫力。(The invention discloses a gastrodia elata macromolecule linear straight-chain glucan and a preparation method and application thereof, and belongs to the field of traditional Chinese pharmacology. The invention dries and crushes the tuber of the gastrodia tuber and degreases the tuber by ethanol. Extracting at room temperature, centrifuging the extractive solution, concentrating, precipitating with ethanol, dissolving precipitate, dialyzing with dialysis bag with molecular weight cutoff of 8000-14000Da, concentrating the dialysate, and separating and purifying with ion exchange resin and gel exclusion chromatography to obtain rhizoma Gastrodiae linear dextran. The polysaccharide is composed of glucose only, is alpha-D-1, 4 connected homopolyglucan, and is a novel glucan. When the concentration is 400 mu g/mL, the compound can obviously promote the proliferation of macrophages, enhance the phagocytic capacity of the macrophages, promote the macrophages to release NO and cytokines TNF-alpha and IL-6, and enhance the immunity of organisms.)
技术领域
本发明涉及中药学领域，特别是涉及一种天麻大分子线性直链葡聚糖及其制备方法和应用。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Blume)为兰科天麻属真菌异养型多年生草本植物，天麻味甘、性平，归肝经。药用其干燥块茎，在我国主产于云、贵、川、藏四省区。天麻主要用于治疗高血压、眩晕、头痛、口眼歪斜、肢体麻木、小儿惊厥、癫痫抽搐、破伤风，是我国传统名贵中药之一。现代药理研究发现，天麻还具有增智健脑、清除自由基、延缓衰老的作用，对老年性痴呆有一定的疗效。多糖作为天麻块茎中重要的组成物质，对其进行研究具有重要的理论和应用价值。
据文献报道，天麻多糖含有木吡喃糖、吡喃葡萄糖等单糖，是一种非均一多糖，其主要结构是α-D-吡喃型葡萄糖(天麻多糖的结构表征.食品研究与开发，2010，31-52.)。朱晓霞等对川产天麻多糖结构进行解析，发现天麻多糖分子量为4.97×105u，其主要由葡萄糖组成，还含有少量鼠李糖和甘露糖，核磁共振波谱解析发现其主链为α-1,4-吡喃型-D-葡萄糖(天麻多糖的结构表征，食品研究与开发，31(9)，52-56，2010)。刘明学等从天麻中提取得到带有1,6-连接支链的α-1,4-D-葡聚糖，其对氧自由基具有一定的清除能力(天麻多糖分离、结构分析与自由基清除作用研究，食品科学，30(3)，29-32)。李超等研究发现天麻多糖GBP-I和GBP-II均由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成(天麻多糖的分离及其单糖组成分析，中国农学通报，24(7)，89-92，2008)。天麻葡聚糖(Glc：Gal＝96:4)对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有较好的保护作用(天麻葡聚糖对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的影响，上海中医药杂志，43(12)，2009)。陈君诚发现天麻多糖RGP-1a和RGP-1b具有显著的清除DPPH和羟基自由基的能力，还可刺激巨噬细胞释放NO和增强巨噬细胞的吞噬能力(天麻和沙枣两种植物多糖的分离纯化及其生物活性研究，西北农林科技大学，硕士论文，2016)。天麻多糖能抑制肝癌H22细胞的增殖，与环磷酰胺联用可降低环磷酰胺对免疫系统的伤害(天麻多糖通过影响小鼠免疫系统抑制肿瘤生长，免疫学杂志，2014，30(6)，566-568)。孙亚男从天麻中提取得到多糖WPGB-A-H，其分子量为28.84kDa，单糖组成分析发现WPGB-A-H由葡萄糖和甘露糖组成。(天麻多糖分离纯化及理化性质研究，西南大学，硕士论文，2007)。硫酸酯化天麻多糖能显著抑制神经胶质瘤细胞生长的活性，并可有效抑制神经胶质瘤细胞的迁移(硫酸酯化天麻多糖抗脑胶质瘤活性的研究，中国药师，227-231，23(2)，2020)。研究发现，水不溶性的天麻葡聚糖，葡聚糖含量为92.1％，其能提高免疫抑制小鼠的免疫球蛋白含量，升高免疫抑制小鼠的胸腺指数(天麻多糖对小鼠免疫功能的影响，中国民族民间医药杂志，(85)，112-114，2007)。天麻多糖可缓解环磷酰胺对小鼠体液免疫功能的抑制作用(天麻多糖对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠体液免疫功能的影响，中国老年学杂志，36，1027-1028，2016)。王瑞敏等研究发现天麻多糖在体外具有较好的抗氧化活性(不同提取方法对天麻多糖抗氧化活性的影响，食品科技，40(3)，208-213，2015)；从云南天麻中提取得到天麻多糖PGEB-3-H的分子量为28.8kDa，其结构为α-1,4连接为主链带有少量α-1,6分支的葡聚糖。活性研究发现，PGEB-3-H可降低高脂血症大鼠甘油三酯水平，可通过提高脑内乙酰胆碱含量改善小鼠记忆能力(云南特有食药用菌活性多糖研究，西南大学，博士论文，2008)。Zhu等通过热水提方法从天麻Gastrodia elata Blume中提取得到多糖PGE，其分子量为1.54×103kDa，结构研究发现PGE由1,4连接的葡萄糖组成线性骨架，存在1,3和1,46连接葡萄糖的分支，活性研究发现PGE对血管紧张素转化酶的半数抑制浓度为0.66mg/mL(Structural characterization and ACE inhibitory activities of polysaccharidefrom Gastrodia elata Blume，Natural Product Research,33,1721-1726,2019)。
以上研究中提取所得的天麻多糖均有葡萄糖等多种单糖组成，为结构复杂的杂聚多糖，为其开发利用带来了一定的困难，并且其分子量均较小，影响其分离提取过程，使得其分离时易出现杂质。目前尚未有大分子量天麻线性葡聚糖的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大分子量线性葡聚糖，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
第一方面，提供了一种天麻大分子线性直链葡聚糖，所述天麻大分子线性直链葡聚糖的结构如下：
[→4)-α-D-Glcp-(1→]n
其中n为正整数。
优选的，所述天麻大分子线性直链葡聚糖的分子量范围为1000-4000kDa，平均分子量为2000kDa。
第二方面，提供了所述的天麻大分子线性直链葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：
1)多糖提取：天麻块茎经干燥、粉碎、乙醇脱脂。于室温进行提取，提取液离心、浓缩后，进行醇沉，沉淀复溶后，冷冻干燥，得天麻冷水提粗多糖；
2)多糖纯化：天麻粗多糖采用截留分子量为8000-14000的透析袋透析，透析液浓缩后，经离子交换树脂和凝胶排阻色谱进一步分离纯化，得到天麻大分子线性直链葡聚糖。
优选的，步骤1)中，多糖提取的具体步骤包括：天麻块茎经干燥、粉碎，用80％乙醇加热回流脱脂，室温干燥，得天麻块茎脱脂粉末；取天麻脱脂粉末，加入去离子水使料液比为1:20～60(g/v)，室温静置1～6h后，进行搅拌提取，提取液离心，离心后的沉淀反复提取2～3次，合并离心后的上清液减压浓缩，加入2～6倍体积的无水乙醇进行醇沉，4℃冰箱中静置过夜，醇沉沉淀减压抽滤，沉淀复溶于水后，冷冻干燥，得天麻粗多糖。
优选的，天麻块茎脱脂粉末与去离子水的质量体积比为1g：40ml。
优选的，步骤2)中，多糖纯化的具体步骤包括：天麻粗多糖溶于水后，采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋进行透析，分别经Q-Sepharose fast flow阴离子交换树脂和Sephacryl S-400凝胶过滤色谱分离纯化，硫酸-苯酚检测收集多糖组分，经浓缩冻干后，得天麻大分子线性直链葡聚糖。
优选的，所述的天麻块茎为云南昭通天麻块茎。
第三方面，提供所述的天麻大分子线性直链葡聚糖在制备增强免疫功能的药物或食品或保健品中的应用。
第四方面，提供了一种药物组合物，包括所述的天麻大分子线性直链葡聚糖以及药学上可接受的辅料。
第五方面，提供了一种保健食品组合物，包含所述的天麻大分子线性直链葡聚糖以及食品中可接受的辅料。
本发明公开了以下技术效果：
本发明中发明人从天麻中提取得到一种大分子量线性直链葡聚糖，该多糖只由葡萄糖组成，为α-D-1,4连接的均聚葡聚糖，是一种新的葡聚糖。本发明提供的多糖结构简单，利于开发利用，并且其分子量大，便于分离。其在400μg/mL时，可显著促进巨噬细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进巨噬细胞释放NO和细胞因子TNF-α和IL-6，增强机体免疫力。本发明提供的天麻α-D-1,4-葡聚糖为均聚多糖，通过本发明提供的制备方法制得的天麻α-D-1,4-葡聚糖，糖链的结构完整性好，体外显示出较好的免疫增强活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是天麻α-D-1,4-葡聚糖的纯度鉴定图；
图2是天麻α-D-1,4-葡聚糖的核磁共振谱图；
图3是天麻α-D-1,4-葡聚糖的碳谱图；
图4是天麻α-D-1,4-葡聚糖的1H-13C HMQC谱图；
图5是天麻α-D-1,4-葡聚糖的单糖组成图；
图6是天麻α-D-1,4-葡聚糖孵育小鼠巨噬细胞的存活率图；
图7是天麻α-D-1,4-葡聚糖的巨噬细胞吞噬指数图；
图8是天麻α-D-1,4-葡聚糖培养细胞的TNF-α产生量图；
图9是天麻α-D-1,4-葡聚糖培养细胞的IL-6产生量图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所使用的材料与试剂，如无特殊说明，均可由商业途径获得。
实施例1
1、天麻α-D-1,4-葡聚糖的提取
A.将天麻块茎干燥、粉碎，所得粉末用80％乙醇脱脂24h，室温干燥后，取100g的天麻粉末加入3000mL的蒸馏水，室温浸泡2h后，搅拌提取3h，离心，残渣重复提取2次，合并上清液后浓缩，加入3倍体积95％的乙醇醇沉，沉淀冷冻干燥，得天麻冷水提粗多糖。
B.取天麻粗多糖配制成1％的溶液，加入等体积的二氯甲烷/正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1，体积比)，搅拌除蛋白，重复脱蛋白2次，除蛋白后的多糖溶液浓缩，采用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液浓缩后，采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂纯化多糖，以0～1mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，硫酸-苯酚法进行检测，收集水洗脱组分，浓缩后采用凝胶柱色谱Sephacryl S-400进一步纯化，硫酸-苯酚法检测，收集多糖组分，得天麻α-D-1,4-葡聚糖。
实施例2
1、天麻α-D-1,4-葡聚糖的提取
A.将天麻块茎干燥、粉碎，所得粉末用80％乙醇脱脂24h，室温干燥后，取100g的天麻粉末加入2000mL的蒸馏水，室温浸泡1h后，搅拌提取3h，离心，残渣重复提取3次，合并上清液后浓缩，加入2倍体积95％的乙醇醇沉，沉淀冷冻干燥，得天麻冷水提粗多糖。
B.取天麻粗多糖配制成1％的溶液，加入等体积的二氯甲烷/正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1，体积比)，搅拌除蛋白，重复脱蛋白2次，除蛋白后的多糖溶液浓缩，采用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液浓缩后，采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂纯化多糖，以0～1mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，硫酸-苯酚法进行检测，收集水洗脱组分，浓缩后采用凝胶柱色谱Sephacryl S-400进一步纯化，硫酸-苯酚法检测，收集多糖组分，得天麻α-D-1,4-葡聚糖。
实施例3
1、天麻α-D-1,4-葡聚糖的提取
A.将天麻块茎干燥、粉碎，所得粉末用80％乙醇脱脂24h，室温干燥后，取100g的天麻粉末加入6000mL的蒸馏水，室温浸泡6h后，搅拌提取3h，离心，残渣重复提取3次，合并上清液后浓缩，加入6倍体积95％的乙醇醇沉，沉淀冷冻干燥，得天麻冷水提粗多糖。
B.取天麻粗多糖配制成1％的溶液，加入等体积的二氯甲烷/正丁醇混合液(氯仿：正丁醇＝4:1，体积比)，搅拌除蛋白，重复脱蛋白2次，除蛋白后的多糖溶液浓缩，采用截留分子量8000-14000Da的透析袋透析，透析液浓缩后，采用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂纯化多糖，以0～1mol/L的氯化钠溶液进行洗脱，硫酸-苯酚法进行检测，收集水洗脱组分，浓缩后采用凝胶柱色谱Sephacryl S-400进一步纯化，硫酸-苯酚法检测，收集多糖组分，得天麻α-D-1,4-葡聚糖。
实施例4
多糖结构表征：
(1)采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖的相对分子量和纯度，纯度鉴定结果如图1所示，其为单一对称的色谱峰，说明所得多糖为结构均一的多糖，其相对重均分子量为2000kDa。所用仪器为Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱柱为Shodex Ohpak SB804，流动相为0.1％叠氮钠，流速为1.0mL/min，柱温为35℃。
(2)天麻多糖的核磁共振氢谱(图2)、碳谱(图3)以及1H-13C HMQC(图4)谱图中可以得出氢信号和碳信号之间的相互关联性，5.39-100.5(H1/C1)，3.96-74.1(H3/C3)，3.84-72.2(H5/C5)，3.77,3.83-61.2(H6/C6)，3.65-77.8(H4/C4)，3.65-72.0(H2/C2)。该多糖的单糖组成图如图5所示。
以上分析结果表明，天麻多糖结构为α-D-1,4-葡聚糖。
实施例5
增强免疫力实验
1、实验材料
受试样品为天麻α-D-1,4-葡聚糖，阴性对照品为磷酸盐缓冲溶液，阳性对照为脂多糖LPS，细胞株为小鼠巨噬细胞RAW264.7,0.25％胰蛋白酶，MTT，酶标仪。
2、实验方法
2.1细胞存活率实验
小鼠巨噬细胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃含5％二氧化碳的培养箱中，细胞贴壁长满后，用0.25％胰蛋白酶进行消化，将细胞接种于96孔细胞培养板(细胞密度为5000个/孔)，细胞贴壁后加入不同浓度的天麻α-D-1,4-葡聚糖样品溶液使其终浓度为25、50、100、200和400μg/mL，阳性对照为5μg/mL的脂多糖溶液，阴性对照为磷酸盐缓冲溶液，设置3个复孔，孵育细胞24h后，加入MTT孵育细胞4h，吸取上清液，加入DMSO，采用酶标仪于570nm波长处测定各孔的OD值，细胞存活率(％)＝[OD加药组-OD空白组]/[OD阴性对照组-OD空白组]。结果如图6所示，各组细胞存活率无显著差别。
2.2细胞吞噬活性实验
取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的天麻多糖样品溶液使其终浓度为25、50、100、200和400μg/mL，阳性对照为5μg/mL的脂多糖溶液，阴性对照为磷酸盐缓冲溶液，设置3个复孔，孵育细胞24h后，弃去培养基PBS清洗2次，加入中性红溶液，继续培养细胞1h，吸弃上清液，并用预冷的PBS清洗细胞2次，加入细胞裂解液，室温裂解细胞过夜，于540nm处测定吸光度值，计算巨噬细胞吞噬指数，吞噬指数＝OD样品组/OD空白组。结果如图7所示，各组吞噬指数相对阴性对照均显著上升。
2.3细胞因子TNF-α和IL-6释放实验
将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后加入不同浓度的天麻多糖样品溶液使其终浓度为25、50、100、200和400μg/mL，阳性对照为5μg/mL的脂多糖溶液，阴性对照为磷酸盐缓冲溶液，设置3个复孔，孵育细胞24h后，收集细胞上清液，ELISA法检测细胞产生的TNF-α和IL-6的含量。结果如图8和图9所示，各组TNF-α和IL-6的含量相对于阴性对照均提高，其中TNF-α的含量随天麻多糖浓度增加而升高，IL-6的含量随天麻多糖浓度增加而降低。
本发明从天麻提取得到一种大分子量线性葡聚糖，该多糖只由葡萄糖组成，为α-D-1,4连接的均聚葡聚糖，是一种新的葡聚糖。其在400μg/mL时，可显著促进巨噬细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬能力，促进巨噬细胞释放NO和细胞因子TNF-α和IL-6，增强机体免疫力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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