一种乳油乳剂疫苗的电解质破乳剂、破乳方法及应用
阅读说明：本技术 一种乳油乳剂疫苗的电解质破乳剂、破乳方法及应用 (Electrolyte demulsifier of missible oil emulsion vaccine, demulsification method and application ) 是由 贺笋 李蕊 赵毅 谢仁军 张禹 刘宏 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明涉及疫苗破乳方法,具体的涉及一种乳油乳剂疫苗的电解质破乳剂、破乳方法及应用,该电解质破乳剂包括质量比为1:2～5:1～4的NaCl、KCl和Na-2SO-4,该三种电解质组合成的混合电解质与单独应用NaCl、KCl或Na-2SO-4作为破乳剂或者使用有机破乳剂取得的破乳效果相比,能够得到更多的水相层,水相层中含有更多的免疫抗原,且具有安全、快速的特点,更适合用于疫苗检测。(The invention relates to a demulsification method of a vaccine, in particular to an electrolyte demulsifier of an emulsifiable concentrate emulsion vaccine, a demulsification method and application, wherein the electrolyte demulsifier comprises NaCl, KCl and Na with the mass ratio of 1: 2-5: 1-4 2 SO 4 The mixed electrolyte synthesized by the three electrolytes is independently applied with NaCl, KCl or Na 2 SO 4 Compared with the demulsifying effect obtained by using an organic demulsifying agent or an demulsifying agent, the water phase layer containing more immune antigens can be obtained, and the water phase layer has the characteristics of safety and rapidness and is more suitable for vaccine detection.)
技术领域
本发明涉及疫苗破乳领域，具体而言，涉及一种乳油乳剂疫苗的电解质破乳剂、破乳方法及应用。
背景技术
现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用动物进行检验，由于国家实行100％的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，而且动物攻毒对实验设施要求高(BSL3级实验室)、耗时长(一个月以上)、资金花费大。如果采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。所以，疫苗质量的检测，尤其是，用于牛的口蹄疫疫苗质量的检测一直困扰着兽药监测部门和相关生产企业。因此，需要尽快研制体外检验技术，代替现有的动物试验。
当前国家对疫苗的检验正逐步过渡到对疫苗内含抗原的检测，而当前较为普遍的方法为疫苗破乳后对抗原进行检测，通过将疫苗进行破乳处理，使抗原转移至水相中，继而对其进行后续的检测分析，然而现有的破乳方法及破乳剂并不适用于所有的油佐剂疫苗，使用传统破乳剂对油佐剂疫苗进行破乳，虽然能将疫苗破乳，但是其水相中的抗原含量极低，并且不同破乳剂的破乳效率与破乳效果层次不齐。
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)俗称“口疮”、“鹅疮”、“蹄癀”，是由口蹄疫病毒引起的一种人和动物共患的急性、烈性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为A类动物传染病，我国将其划归为一类传染病，鉴于口蹄疫危害的严重性，口蹄疫疫苗质量对疫情的防控至关重要。口蹄疫疫苗是水包油包水(W/O/W) 复合型乳剂，其质量方法的检测主要是通过破乳测水相中146S含量以及蛋白含量来判断疫苗质量，采用常规的有机试剂破乳，其有机试剂会残留于回收的水相中，对后续检测造成一定的影响，并且目前破乳的试剂主要是有正戊醇、氯仿、甲醇、正己醇、苯甲醇等有机溶剂，对储存条件要求较高，需储存在阴凉、通风、远离火种、热源，并且周围的环境温度不能超过37℃；这些有机溶剂具有一定的毒性，在使用过程中对人体造成一定的伤害；采用有机溶剂破乳，其耗时较长，需30min以上才能分离乳剂疫苗中的水相，并且溶解于水相中的有机溶剂会干扰后续蛋白的检测。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种油乳剂疫苗的电解质破乳剂，该电解质破乳剂由NaCl、KCl和Na2SO4组成，与单一电解质相比，破乳效果显著，提高了分离水相和免疫抗原的获得量。
本发明还提供了一种破乳方法，该破乳方法采用由NaCl、KCl和Na2SO4组成的电解质破乳剂对乳油乳剂疫苗进行破乳，具有安全、快速的特点，且用于破乳的电解质对存储环境无特殊要求。
本发明还提供了上述电解质破乳剂在乳油乳剂疫苗破乳中的应用以及上述破乳方法在检测乳油乳剂疫苗内抗原含量中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种乳油乳剂疫苗的电解质破乳剂，该电解质破乳剂包括质量比为1:2～5:1～4的NaCl、KCl和Na2SO4。这三种电解质组成的破乳剂与单独应用NaCl、 KCl或Na2SO4作为破乳剂取得的破乳效果相比，能够得到更多的水相层，水相层中含有更多的免疫抗原，上述三种电解质组成形成的混合电解质与其他组合电解质用作破乳剂取得的破乳效果相比，能够实现更好的破乳效果。
优选地，所述的NaCl、KCl和Na2SO4的质量比为1:3.5～4:1.5～2。
进一步优选地，所述的NaCl、KCl和Na2SO4的质量比为1:3.8:1.7，采用此质量比配制的混合电解质表现出了更加的优异的破乳性能，且不会对待检测的免疫抗原造成破坏。
本发明还提供了上述电解质破乳剂在乳油乳剂疫苗破乳中的应用。
优选地，所述的乳油乳剂疫苗包括口蹄疫疫苗。
本发明提供了一种乳油乳剂疫苗的破乳方法，所述破乳方法包括将上述的电解质破乳剂加入乳油乳剂疫苗，混匀后，乳油乳剂疫苗在电解质破乳剂作用下分为三层，实现乳油乳剂疫苗的破乳。乳油乳剂疫苗中加入电解质，将大幅度的增加乳油乳剂疫苗中相反电性离子浓度，压迫乳剂粒表面的双电层，乳剂粒表面的zate电位降低，使乳剂失稳，从而达到乳液中油水相分离的目的，当乳油乳剂疫苗完全分为三层时，电解质破乳剂才完成了完全破乳。
优选地，所述三层由上到下依次为油相层、脂类层和疫苗抗原水相层。
优选地，上述电解质破乳剂与乳油乳剂疫苗的质量体积比为10～17g/L，电解质的浓度过低会导致抗原降解，电解质浓度过高会使得疫苗破乳不完全。
进一步优选地，所述电解质破乳剂与乳油乳剂疫苗的质量体积比为11～14g/L；优选为13g/L。
优选地，上述混匀的方法包括旋涡振荡、超声或搅拌中的一种或两种以上组合；优选为旋涡振荡。
优选地，上述混匀后还包括离心处理的步骤，离心处理可以大大地提高破乳效率。
优选地，所述离心处理的步骤包括在4℃、10000～20000rpm条件下，离心 2～10min，使得含有抗原的水相层与油相层、脂类层完全分离。
进一步优选地，所述离心步骤为在4℃、12000rpm条件下，离心5min，该离心条件下，仅需5min即可完成破乳，口蹄疫疫苗的抗原水相回收率高，同时又不会因为转速太高引起抗原降解。
本发明还提供了上述的破乳方法在乳油乳剂疫苗内抗原检测中的应用。
优选地，所述的乳油乳剂疫苗包括口蹄疫疫苗。
上述破乳效果能够通过检测破乳得到的免疫抗原水相层的体积进行评估，还可以通过检测分离得到的疫苗抗原水相层中免疫抗原的含量进行评估，免疫抗原含量的检测方法包括采用蔗糖梯度离心法分离水相层中的免疫抗原。例如采用所述的蔗糖梯度超速离心法包括将分离的口蹄疫疫苗抗原水相层置于15％～45％蔗糖密度梯度，以13000rpm离心，使分离的水相中的免疫抗原沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量，即可测得口蹄疫疫苗中抗原含量。
上述计算146S含量的公式为：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7L为固定参数)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明还提供了一种由质量比为1:2～5:1～4的NaCl、KCl和Na2SO4组成的电解质破乳剂，该电解质破乳剂的破乳效果与单一电解质破乳剂或有机溶剂破乳剂相比，破乳效果显著，提高了分离水相和免疫抗原的获得量。
本发明提供的电解质对乳油乳剂疫苗破乳的方法，该方法采用无毒的电解质破乳剂，加入到疫苗中混匀后，能够在短时间内将疫苗分为三层，完成疫苗的完全破乳，具有安全、快速的优点，且与有机物破乳剂相比电解质破乳剂对存储环境无特殊要求。
本发明提供的电解质对乳油乳剂疫苗破乳的方法，仅额外添加了三种无机盐，无其他杂质组分，不会对抗原的后续检测造成干扰。
本发明提供的破乳方法用于检测乳油乳剂疫苗内抗原含量时，具有快速、安全，且检测结果准确、可靠的优点。
附图说明
图1为实施例1中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图2为对比例1中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图3为对比例2中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图4为对比例3中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图5为对比例4中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图6为对比例5中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图7为对比例6中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图8为对比例7中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图9为对比例8中口蹄疫疫苗破乳后分层结果图；
图10为对比例9中采用的标准曲线。
图中，a为油相层，b为脂类层，c为口蹄疫抗原水相层。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1～5
本组实施例提供了5组电解质破乳剂的组成，如下表所示：
表1实施例1～5中电解质破乳剂的组成表
实施例1
实施例2
实施例3
实施例4
实施例5
NaCl(mg)
3.1
2.5
2.5
2.5
2
KCl(mg)
11.7
7.5
10
12.5
10
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>(mg)
5.2
10
7.5
5
8
实验例1
按照实施例1提供的配比称取3.1mgNaCl、11.7mg KCl和5.2mg Na2SO4充分混匀后，加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批) 中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图 1所示，由图中可以清楚地看出，2ml离心管中口蹄疫疫苗经过破乳并离心5min后，即分为了清晰的三个分层，实现了口蹄疫抗原水相层的完全分离，且三层界限清晰、分布稳定。
提取下层口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的口蹄疫抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S 含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表2所示。
表2实验例1中三组平行实验结果
实验编号
1
2
3
回收水相层体积(mL)
0.74
0.73
0.72
146S含量(μg/mL)
8.2
7.9
8.2
实验例2
首先称取实施例2中的配比加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表3所示。
表3实验例2中三组平行实验结果
实验例3
首先称取实施例3的配比加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表4所示。
表4实验例3中三组平行实验结果
实验编号
7
8
9
回收水相层体积(mL)
0.64
0.63
0.64
146S含量(μg/mL)
7.6
8.0
7.8
实验例4
首先称取实施例4的配比加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表5所示。
表5实验例4中三组平行实验结果
实验编号
10
11
12
回收水相层体积(mL)
0.68
0.68
0.69
146S含量(μg/mL)
7.8
7.5
7.6
实验例5
首先称取实施例5的配比加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表6所示。
表6实验例5中三组平行实验结果
实验编号
13
14
15
回收水相层体积(mL)
0.61
0.65
0.64
146S含量(μg/mL)
7.8
8.0
7.9
对比例1
首先称取1.4mgNaCl、5.3mg KCl和2.4mg Na2SO4充分混匀后，加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图2所示，由于电解质用量不足，疫苗无法完全破乳，使得油相层与脂类层之间存在未完全分离的浑浊层，且脂类层与口蹄疫抗原水相层之间的分层非常不稳定。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表7所示。
表7对比例1中三组平行实验结果
实验编号
16
17
18
回收水相层体积(mL)
0.62
0.64
0.63
146S含量(μg/mL)
3.2
3.4
3.5
对比例2
首先称取5.4mgNaCl、20.4mg KCl和9.2mg Na2SO4充分混匀后，加入到2ml 口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图3所示，电解质加入量过高，不仅使得分层形成的三层之间存在浑浊分层，而且还在离心管底部形成了大量的沉积电解质，电解质沉淀过程中形成部分结合水，使得分离得到的口蹄疫抗原水相层体积减小，同时电解质沉淀层中还含有口蹄疫抗原沉淀，造成额外的浪费。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如对比表8所示。
表8对比例2中三组平行实验结果
实验编号
19
20
21
回收水相层体积(mL)
0.45
0.42
0.44
146S含量(μg/mL)
5.0
4.8
4.8
对比例3
首先称取3.1mgNaCl、1.5mg KCl和15.4mg Na2SO4充分混匀后，加入到2ml 口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图4所示，本对比例中Na2SO4加入过多，使得电解质离子比例失衡，导致口蹄疫疫苗无法实现破乳分离，大部分还保留了口蹄疫疫苗本身的乳白色，分离得到的口蹄疫抗原水相层体积过少，明显无法用于正常的疫苗质量检测。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表9所示。
表9对比例3中三组平行实验结果
实验编号
22
23
24
回收水相层体积(mL)
0.3
0.32
0.31
146S含量(μg/mL)
7.6
7.8
7.5
对比例4
MgCl2的用量按口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批) 质量份加入0.75％后，用旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管底部仅可见少许水相，且其分层现象不明显，如图5所示，证明无法选择MgCl2简单替换本发明所选电解质用于口蹄疫疫苗的破乳。
对比例5
NaSO4的用量按口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批) 质量份加入0.75％量后，用旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心 5min，静置后离心管底部仅可见少许水相，且其分层现象不明显，并未实现破乳，如图6所示，证明无法选择NaSO4作为单一电解质破乳剂，简单替换本发明所选电解质用于口蹄疫疫苗的破乳。
对比例6
NaCl的用量按口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批) 质量份加入0.75％量后，用旋涡振荡混匀，然后再在4℃、12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管底部仅可见少许浑浊的水相，并未实现疫苗的破乳，如图7所示，证明无法选择NaCl作为单一电解质破乳剂，简单替换本发明所选电解质用于口蹄疫疫苗的破乳。
对比例7
首先称取5mgNaCl、15mgKCl充分混匀后，加入到2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中，而后旋涡振荡混匀，然后再在4℃、 12000rpm条件下，离心5min，静置后离心管内混合液分为三层，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图8所示，由图中可以看出，由于电解质仅选择了NaCl和KCl，口蹄疫疫苗破乳并不完全，脂类层和口蹄疫抗原水相层之间分层不明显，且十分不稳定。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量如表10所示。
表10对比例7中三组平行实验结果
实验编号
25
26
27
回收水相层体积(mL)
0.35
0.36
0.35
146S含量(μg/mL)
7.8
7.6
7.8
对比例8
在2ml口蹄疫疫苗(天康生物：口蹄疫OA二价灭活疫苗，202005批)中加入 0.17mL的正戊醇(疫苗体积与破乳试剂体积比为9:1)充分挣摇混合，4℃静置30min 分层后，3000r/min、4℃离心5min，从上至下依次为油相层、脂类层和口蹄疫抗原水相层，如图9所示，正戊醇是目前疫苗破乳常用的破乳剂，能够实现对口蹄疫疫苗的完全破乳。
提取口蹄疫抗原水相层，并测量回收体积，而后对所得口蹄疫抗原水相层进行蔗糖梯度超速离心，其中蔗糖密度包括15％、25％、35％和45％，共计4个梯度，以13000rpm的加速度离心，使分离得到的疫苗抗原水相层中的146S沉降至相应梯度，抽取梯度离心得到的相应梯度的体积，根据259nm检测吸光值计算146S含量。
计算公式：146S含量(μg/mL)＝梯度离心得到的相应梯度的体积×OD259nm值×128.7/梯度离心样品体积，(其中：128.7为固定参数)。
重复上述操作3次，得到三组平行实验，其得到的口蹄疫抗原水相层回收体积和146S含量。
表11对比例8中三组平行实验结果
试验编号
28
29
30
回收水相层体积(mL)
0.62
0.67
0.65
146S含量(μg/mL)
0.78
0.8
0.79
对比例9
采用BCA法测实验例1中电解质破乳后回收水相中的蛋白含量及对比例8中正戊醇破乳后回收水相中的蛋白含量。配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂A，1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀；将蛋白标准品用双蒸水依次按1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、 0.0313mg/mL依次稀释后，取25μL加入96孔板，每个测定要做3个平行；分别取25μL待测样品，即盐破乳后回收水相中及正戊醇破乳后回收水相加入96孔板中，每个测定做3个平行；向带测样品孔和蛋白标准品孔中加入200μLBCA工作液，混匀后37℃温浴30min，冷取至室温；酶标仪562nm波长下测定吸光度OD值；而后依据得到的OD值从标准曲线中读取待测样品中蛋白浓度，所述的标准曲线如图10所示。
表12电解质破乳与正戊醇破乳蛋白含量测定结果
OD值
蛋白含量(μg/mL)
乳化前水相
/
36.1
盐破乳法
0.142
38.7
正戊醇破乳法
0.165
63.3
由表12可以看出，采用电解质破乳，不仅水相抗原的回收率高，回收获得的水相抗原不会对蛋白检测造成干扰，即测定破乳回收后水相中的蛋白含量与乳化前水相中的蛋白含量无明显差异；而采用正戊醇破乳，存在水相体积及蛋白含量虚高的情况，而且采用电解质破乳获得的抗原水相可长期保存，稳定性较好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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