具体实施方式

除非另有说明，否则本文中所使用的科学与技术术语应具有那些本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非本文中另有要求，否则单数术语应包括复数，且 复数术语应包括单数。通常，本文中所描述的细胞及组织培养、分子生物学、免疫学 及蛋白质与核酸化学所涉及的命名法与其技术均是本领域已知且常用的。

本发明的方法与技术通常依据本领域已知的传统方法进行，且说明于本说明书所摘录和讨论的多种一般性及较专业性参考书中，除非另有说明。参见例如：Sambrook 等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))及Ausubel等人的Current Protocols inMolecular Biology(Greene Publishing Associates(1992))，及Harlow与Lane的Antibodies： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor， N.Y.(1990))，其内容已以引用的方式并入本文中。酶反应与纯化技术是根据制造商的 说明书进行，通常可依本领域已知的方法或依本文说明的方法进行。与本文中描述的 分析化学、合成有机化学、及医学与医药化学相关的命名法，及实验方法与技术是本 领域已知且常用的。化学合成法、化学分析法、医药制法、调配法与药物递送法，及 患者的治疗法均采用标准技术。

除非另有说明，否则下列术语具有如下定义：

“抗体”(Ab)应包括，但不仅限于，糖蛋白免疫球蛋白，其特异性结合抗原并且 至少包括通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链，或其抗原结合部分。每 个H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。

抗体“重链恒定区”，又称CDs，包含CH1、CH2和CH3三个结构域以及位于 CH1结构域与CH2结构域之间的铰链区。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL) 和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为 高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，它们之间散在着较为保守的称作框架区(FR) 的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端向羧基端按以下顺序 排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与 抗原相互作用的结合结构域。

术语“铰链区”意指使CH1结构域与CH2结构域连接的重链恒定区的部分。铰链 区包括约25个残基，并且是柔性的，从而允许2个N末端抗原结合区独立移动。铰 链区可以再分成3个独特结构域：上部、中间和下部铰链结构域(Roux等人(1998) J.Immunol.161：4083)。已制备了一些改变的抗体分子，其中铰链区中的半胱氨酸 残基数目进行了增加，以促进抗体分子形成固定构象，提高激动型抗体的免疫调节活 性(专利号WO2015145360A1)。

“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如， 效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。因此， Fc区是构成(comprising)抗体重链恒定区中除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的部 分的多肽。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的第二(CH2) 和第三(CH2)恒定结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽 链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。对于IgG，Fc区包含免疫球蛋白结构 域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以 变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧 基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。人IgG Fc区的CH2 结构域从大约氨基酸231延伸至大约氨基酸340，而CH3结构域位于Fc区的CH2 结构域的C末端侧，即，它从IgG的大约氨基酸341延伸至大约氨基酸447。如本文 所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。Fc还可以指处于分离状态的这个区 域，或者处于包含Fc的蛋白多肽中的这个区域，这样的多肽例如“包含Fc区的结合 蛋白”，又称“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘附素)。

“Fc受体”或“FcR”是结合免疫球蛋白Fc区的受体。结合IgG抗体的FcR包括 FcγR家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。人Fcγ受体家族 包括几个成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIIA (CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)。其中，FcγRIIB是唯一的抑制性Fcγ受体，其它 均为活化型Fcγ受体。大多数天然效应器细胞类型共表达一种或多种激活性FcγR和 抑制性FcγRIIB，而自然杀伤(NK)细胞选择性地表达一种激活性Fcγ受体(在小鼠中是 FcγRIII，在人中是FcγRIIIA)，但在小鼠和人类中不表达抑制性FcγRIIB。这些Fcγ 受体的分子结构不同，也因此对各IgG抗体亚类具有不同的亲和力。在这些Fcγ受体 中FcγRI是高亲和力受体，而FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA是低亲和力受体。基因 多态性也存在于这些不同的Fcγ受体中并影响它们的结合亲和力。最常见的基因多态 性是FcγRIIA的R131/H131和FcγRIIIA的V158/F158等多态形式。这些多态形式中 有的被发现与多种疾病有相关性，一些特定治疗抗体的效果也依赖于病人是否带有特 定的Fcγ受体基因多态形式。

本发明抗体及其片段或者结构域的氨基酸的序号是以IgG Eu编号为依据的。

术语“抗原结合位点”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。抗体的抗原结合位点包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是非如本文中定义 的高变区残基的这些可变区区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N末端到C 末端包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3 是最有助于抗原结合的和定义抗体性能的区域。CDR和FR根据Kabat等，SEQ ID NO:uences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的标准定义和/或来自“高变环”的残基确定。

抗体通常以高亲和力特异性结合其关联抗原(同样地，本发明的蛋白也可以特异性结合其表位识别分子)，这表现为10^-5-10^-11M或更小的解离常数(KD)。任何大于大 约10^{- 4}M^-1的KD通常被认为指示非特异性结合。如本文所使用的，与抗原“特异性结 合”的抗体是指以高亲和力与抗原和基本上相同的抗原结合的抗体，这意味着KD为 10^-7M或更小，优选地10^-8M或更小，甚至更优选地5×10^-9M或更小，最优选地 10^-8-10^-10M或更小，但是不会以高亲和力与无关抗原结合。如果抗原与给定抗原显示 高度的序列同一性，例如，如果它与给定抗原的序列显示至少80％，至少90％，优 选至少95％，更优选至少97％，或甚至更优选至少99％的序列同一性，则该抗原与 给定抗原是“基本上相同的”。

免疫球蛋白可能来自任何通常已知的同种型。IgG同种型在某些物种中可以被 分细为亚类：人类中的IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，小鼠中的IgG1,IgG2a,IgG2b和 IgG3。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。“抗体” 包括例如天然存在的和非天然存在的抗体；单克隆和多克隆抗体；嵌合和人源化抗体； 人或非人抗体；全合成抗体；和单链抗体。

“激动型抗体”是与受体结合并激活受体的抗体，激动型抗体的功能实例是与肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族中受体结合并诱导表达TNF受体的细胞凋亡。测定 细胞凋亡诱导作用的试验描述在WO98/51793和WO99/37684中，该两篇文献特别在 此引入作为参考。本发明具体的实施例中抗CD40的激动型抗体能够通过结合免疫细 胞表面传递免疫激活信号的靶标分子并激活其控制的重要免疫激活信号通路，进而增 强抗肿瘤免疫应答间接杀死肿瘤细胞。一些已经进入临床研究阶段的激动型抗体的实 例可以参考专利PCT/CN2017/087620。

“激动活性”是指通过使抗体与抗原分子结合，激发该抗原分子产生信号，诱导 某些特异性生理活性变化的活性。抗原分子包括受体分子和其它具有信号或生理功能 的分子。上述特异性生理活性包括，例如：增殖活性、生存活性、分化活性、转录活 性、膜转运活性、结合活性、蛋白分解活性、磷酸化/脱磷酸化活性、氧化还原活性、 转移活性、核酸分解活性、脱水活性、细胞死亡诱导活性及凋亡诱导活性等，但不限 于这些。本文中描述的激动活性并不限于激动型抗体。在一些实施方案中，激动活性 的降低可增强抗体的其他活性，例如抑制活性。

“母本”指在蛋白质改造过程中，改造的对象。在一些实施例中，所述母本为未 被改造的抗体。

“变体”指在蛋白质改造过程中，母本经过修饰后所获得的蛋白。具体的可以是 通过对母本氨基酸的突变、缺失和/或添加而衍生出来的，且保留母本中固有的一些 或所有功能的蛋白质。

“修饰”是指通过化学基团(包括氨基酸或氨基酸组成的片段、非天然氨基酸、 糖基、乙酰基等)的引入和/或除去，而使蛋白质结构和/或功能发生改变的现象。本 发明所指的对抗体或者其片段的“修饰”包括对抗体或者其片段中的氨基酸进行突变、 删除、侧链修饰(例如糖基化、乙酰化等)和/或插入额外的氨基酸等。

“柔性”是指具有分子(内)运动性，在本发明中主要指蛋白质的结构易变性。如文中所述，当铰链区具有“柔性”时，意思是其连接的两个N-末端抗原结合区可以独 立地移动。同时，文中也用“灵活”和“僵硬”来描述抗体的柔性程度，“灵活”意 味着抗体柔性强，而“僵硬”意味着抗体柔性弱。生物大分子的柔性可以通过本发明 所提供的柔性检测方法来进行检测，具体的，可以采用本发明提供的小角X射线散 射方法或者TR-FRET的方法进行检测。

在本专利中，当所述变体比母本具有更强柔性时，通常具有更差的激动活性； 当所述变体比母本具有更弱柔性时，通常具有更好的激动活性。但是，对于不同的抗 体，其激动活性最优的变体所需的柔性的最佳值或最佳值范围是不同的，当柔性达到 最佳值或落入最佳值范围时，其激动活性最强，在此基础上增加或者减弱柔性，激动 活性都可能减弱。在人类的IgG中，通常IgG3的柔性是强的，包含IgG3的CH1-铰 链区的抗体其激动活性通常是差的，而IgG2和IgG1的柔性相对较低，因而包含IgG2 和IgG1的CH1-铰链区的抗体的激动活性通常会比包含IgG3的CH1-铰链区的抗体的 激动活性要强。因而IgG1或IgG2的CH1-铰链区都是可以选择的天然的IgG CH1- 铰链区。事实上，尽管IgG2的柔性比IgG1要低，并且在一些抗体的实施例中，采用 IgG2 CH1-铰链区确实能够提供比IgG1 CH1-铰链区和IgG3CH1-铰链区更好的激动 活性，但在另外一些抗体的实施例中，柔性居中的IgG1 CH1-铰链区能够提供比IgG2 CH1-铰链区和IgG3 CH1-铰链区更好的激动活性。因此，出于增强抗体的激动活性的 目的，需要将抗体的柔性调节到一个相对低的区间；较佳的，该抗体的柔性程度不应 超过人IgG1的柔性程度，但柔性程度也不能过低；可以从具有较低柔性的抗体中进 一步通过活性筛选获得激动活性最优的变体。相反，出于降低抗体的激动活性的目的，需要将抗体的柔性调节到一个相对高的区间；较佳的，该抗体的柔性程度应大于或相 当于天然IgG3的柔性程度。

“回转半径(Radius of gyration,Rg)”又称惯性半径，是指物体微分质量假设的集 中点到转动轴间的距离，可以大概描述分子结构有多紧密。Rg反应了蛋白质的体积 和形状，可用于衡量蛋白质结构的延展广度。Rg越大，说明体系越膨胀，对于本发 明的抗体来说，其柔性越强。本专利中，通过对小角度X射线散射所获得的参数来 估算Rg。

本文的″肿瘤坏死因子受体超家族″或″TNF受体超家族″，是指可与TNF家族的 细胞因子结合的受体多肽。一般而言，这些受体是在其胞外区具有一个或多个半胱氨 酸丰富的重复序列的I型跨膜受体。TNF基因家族中细胞因子的实例包括：肿瘤坏死 因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β或淋巴毒素)、CD30配体、CD27配体、CD40 配体、OX-40配体、4-1BB配体、Apo-1配体(也称作Fas配体或CD95配体)、Apo-2 配体(也称作TRAIL)、Apo-3配体(也称作TWEAK)、osteoprotegerin(OPG)，APRIL、 RANK配体(也称作TRANCE)，和TALL-1(也称作BlyS、BAFF或THANK)。TNF 受体超家族中受体的实例包括：1型肿瘤坏死因子受体(TNFR1)、2型肿瘤坏死因子 受体(TNFR2)、p75神经生长因子受体(NGFR)、B细胞表面抗原CD40、T细胞抗原 OX-40、Apo-1受体(也称作Fas或CD95)、Apo-3受体(也称作DR3、sw1-1、TRAMP 和LARD)、称作″跨膜激活剂和CAML-相互作用子(interactor)″或″TACI″的受体、BCMA蛋白、DR4、DR5(或者，也称作Apo-2；TRAIL-R2，TR6，Tango-63，hAPO8， TRICK2或KILLER)、DR6、DcR1(也称作TRID、LIT或TRAIL-R3)、DcR2(也称作TRAIL-R4或TRUNDD)、OPG、DcR3(也称作TR6或M68)、CAR1、HVEM(也称作 ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1、CD30、淋巴毒素β受体(LTBr)、 4-1BB受体和TR9(EP988,371A1)。

本发明所述的“对抑制性Fcγ受体以及活化性Fcγ受体的亲和力比值”或者“I/A比值”等于抗体重链恒定区与抑制性Fcγ受体(例如：人FcγRIIB)的亲和力值除于抗 体重链恒定区与同种属的活化性Fcγ受体(例如：包括人FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、 FcγRIIIB)的最高亲和力值。

所述的“亲和力”是指两个分子之间的结合能力的大小，通常地可以用KD来衡 量。“KD”指两个分子(例如：特定抗体和抗原或者配体和受体)相互作用的平衡解 离常数。

“人”抗体是指这样的抗体，其可变区具有来自人种系免疫球蛋白序列的框架区和CDR区。而且，如果抗体含有恒定区，则恒定区也来自人种系免疫球蛋白序列。 本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通 过体外随机或定点突变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用 的，术语“人抗体”，不意图包括来自其它哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被 嫁接到人框架序列上的抗体。术语“人”抗体和“完全人”抗体被同义使用。

“人源化”抗体是指其中非人抗体CDR结构域以外的一些、大部分或全部的氨基 酸被来自人免疫球蛋白的相应氨基酸所替换的抗体。在人源化形式抗体的一个实施方 案中，CDR结构域以外的一些、大部分或全部氨基酸被来自人免疫球蛋白的氨基酸 代替，而一个或多个CDR区域内的一些、大部分或全部氨基酸都不变。允许对氨基 酸进行小的添加、删除、插入、取代或修饰，只要它们不会消除抗体结合特定抗原的 能力即可。“人源化”抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。

“嵌合抗体”是指可变区来自一个物种而恒定区来自另一个物种的抗体，例如可变区来自小鼠抗体而恒定区来自人抗体的抗体。

“柔性连接序列”是指具有柔性结构的氨基酸序列。本发明具体的实施例中“柔性连接序列”被用于添加、插入、取代或修饰抗体铰链区，以使铰链区具有柔性，或增 加原有铰链区柔性的氨基酸序列。Joshua S.Klein等提供了一系列柔性连接序列 (Design andcharacterization of structured protein linkers with differing flexibilities，Protein Engineering,Design&Selection vol.27no.10pp.325–330,2014)，这些序列一并引用作为本发明具体的柔性连接序列的实例。

此外，发明人发现，通过突变(修饰)抗体的上部和/或中部铰链结构域(例如 改变位阻较小的氨基酸数量和/或占比，或改变上部铰链结构域的长度)，可以调节 抗体柔性。发明人还发现，这种对抗体柔性的调节与抗体的激动活性密切相关；下调 柔性可提高激活型抗体的激动活性，反之则可以调低激动型抗体的激动活性。本文中， 位阻较小的氨基酸可选自：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、缬氨酸(V)、 苏氨酸(T)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)。优选地，位阻较小的氨基酸选自G或 S。本文所位阻较大的氨基酸包括芳香族氨基酸和杂环基氨基酸。在一个或多个实施 方案中，位阻较大的氨基酸选自脯氨酸(P)、羟脯氨酸(O)、天冬酰胺(N)、天 冬氨酸(D)、焦谷氨酸(U)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、组氨酸(H)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、色氨 酸(W)。

当所述调节是上调抗体柔性或者降低抗体激动活性时，所述突变使铰链区的上部和/或中部铰链结构域中位阻较小的氨基酸数量和/或占比增加，或使上部和/或中部 铰链结构域的长度增加。所述突变选自以下一种或多种，(1)在上部铰链结构域中 插入1个、2个、5个或至少6个位阻较小的氨基酸，(2)从上部和/或中部铰链结 构域中删除位阻较大的氨基酸，(3)将上部和/或中部铰链结构域中位阻较大氨基酸 突变为位阻更小的氨基酸。例如，(1)中所述的氨基酸插入位于上部铰链结构域的 N端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸后、或 上部铰链结构域和中间铰链结构域之间。(1)中所述的插入包括1个、2个、5个或 至少6个选自G和S的氨基酸。在具体实施方案中，(1)是在上部铰链结构域和中 间铰链结构域之间插入G、GS、SG、GSGSG、SGSGS、GGGGS、GGGSG、GGSGG、GSGGG、SGGGG、GSGSG、GSSGG、GGSSG、GSGGS、GGSGS、GGGSS、SGGSG、 SGSGG、SSGGG、SGGGS、SGSGS、SGGSS、SSGGS、SGSSG、SSGSG、SSSGG、 GSSGS、GSGSS、GGSSS、GSSSG、GSSSS、SGSSS、SSGSS、SSSGS、SSSSG或 (GSGSGS)_n，其中_n为1、2或3。在具体实施方案中，(2)是从上部和/或中部铰链 结构域的C端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨 基酸开始删除位阻较大的氨基酸。在具体实施方案中，(3)包括将上部和/或中部铰 链结构域中空间位阻大的氨基酸残基例如(R、K、D)取代成空间位阻小的氨基酸残 基(例如G、S)；在一些实施方案中，(3)还包括将上部和/或中部铰链结构域突 变为IgG3或mIgG2a的相应区域，或将铰链区突变为IgG3或mIgG2a的铰链区，或 将CH1-铰链区突变为IgG3或mIgG2a的CH1铰链区。在一个或多个实施方案中， 突变之后所述抗体的柔性大于或相当于IgG3。在一个或多个实施方案中，突变后的 所述抗体的回转半径(Rg)大于

当所述调节是下调抗体柔性或者提升抗体激动性活性时，所述突变使铰链区的上部和/或中部铰链结构域中位阻较小的氨基酸数量和/或占比降低，或使上部和/或中 部铰链结构域的长度减小。所述突变选自以下一种或多种，(1)在上部铰链结构域 中插入3或4个位阻较小的的氨基酸，(2)从上部和/或中部铰链结构域中删除位阻 较小的氨基酸，(3)将上部和/或中部铰链结构域中位阻较小氨基酸突变为位阻更大 的氨基酸，(4)在上部和/或中部铰链结构域中插入位阻较大的氨基酸。此时，(1) 中所述插入位于上部铰链结构域的N端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至 少第4个或至少第5个氨基酸后、或上部铰链结构域和中间铰链结构域之间。(1) 中所述插入包括插入3或4个位阻较小的氨基酸，其中n是正整数，例如插入3或4 个选自G和S的氨基酸。在具体实施方案中，(1)是在上部铰链结构域和中间铰链 结构域之间插入GSG、GGS、SGG、GSS、SGS、SGG、GGGS、GGSG、GSGG、 SGGG、GGSS、GSGS、SGGS、GSSG、SSGG、SGSG、SSSG、SSGS、SGSS或GSSS。 在具体实施方案中，(2)是从上部和/或中部铰链结构域的C端至少第1个、至少第 2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸开始删除位阻较小的氨基酸。在 具体实施方案中，(3)包括将上部和/或中部铰链结构域中空间位阻小的氨基酸残基 例如(G、S)取代成空间位阻大的氨基酸残基(例如R、K、D)；在一些实施方案 中，(3)包括将上部和/或中部铰链结构域突变为IgG1、IgG2或IgA2的相应区域， 或将铰链区突变为IgG1、IgG2或IgA2的铰链区，或将CH1-铰链区突变为IgG1、IgG2或IgA2的CH1-铰链区。在具体实施方案中，(4)是在上部和/或中部铰链结构域的 N端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸后、或 上部铰链结构域和中间铰链结构域之间插入至少1个、至少2个、至少3个、例如 1-20个、1-15个或1-10个位阻较大的氨基酸。在一个或多个实施方案中，突变后的 抗体的柔性不超过人IgG1的柔性。在一个或多个实施方案中，突变后的抗体的回转 半径(Rg)为优选地为或者小于IgG1(例如人IgG1)的Rg。

本发明所述“生物大分子”是指作为生物体内主要活性成分的各种有机分子， 它们通常分子量较大(分子量达到上万或更多)，常见的生物大分子包括蛋白质、核 酸、脂类、糖类，以及由这些分子或分子片段相互结合而形成的产物或体系，如糖蛋 白、脂蛋白、核蛋白等。

“表位”又称为抗原决定族，是存在于抗原/蛋白表面的，决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团，是抗原的可以被免疫系统(特别是抗体、B细胞或T细胞)识别的 部分。一个抗原分子可具有一种或多种不同的表位，其大小相当于相应抗体的抗原结 合部位，每种表位只有一种抗原特异性。

“表位识别分子”是指能够与表位进行特异性结合的分子。

“荧光共振能量转移”(FRET)是指在不同的荧光基团中，若一个荧光基团(供 体荧光分子，Donor)的荧光发射光谱与另一个基团(受体荧光分子，Acceptor)的吸收 光谱有一定的重叠，当两个基团间的距离合适时(一般小于50nm，较优地小于10nm)， 即可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即供体荧光猝灭和受体荧光增强。

“半径”(R0)，也称福氏半径，表示在FRET中，50％的供体荧光 分子(Donor)失活，转移能量至受体荧光分子(Acceptor)时，供体和受体之间的 距离。

本发明所述“TR-FRET”是时间分辨荧光共振能量转移的简称，时间分辨荧光 共振能量转移分析(Time-Resolved Fluoresence Resonance Energy Transfer assay, TR-FRET分析)，主要的作用原理是由时间分辨荧光分子作为供体荧光分子，在一定 的作用距离下可将能量转移至邻近的受体荧光分子，而此受体荧光分子即会受到激发 产生特定波长的荧光信号(即本发明所述的“TR-FRET信号”)供实验者检测。具 体地，由发射光半衰期较长的镧系元素作为供体荧光分子，在一定的作用距离下可将 供体荧光分子发射光能量(A)能量转移至邻近的受体荧光分子，而此受体荧光分子 即会受到激发产生特定波长的发射荧光信号(B)((B/A)比值即本发明所述的 “TR-FRET信号”)供实验者检测。

本发明所述“供体荧光分子”和“受体荧光分子”可以通过直接标记表位识别分 子(例如：抗原)，而后分别结合在蛋白(例如：抗体)的两个表位(例如：抗原结合位点)； 也可以通过间接标记表位识别分子达到同样效果，或者通过直接或者间接标记其它可 以结合表位的分子达到同样的效果。

本发明TR-FRET分析所采用的供体荧光分子和配体荧光分子可以按如下方式 来选择配对：

1)当供体荧光分子为Eu时，与之配对的受体荧光分子可以选自于APC，D2， XL665，Fluorescein，GFP，Rhodamine6G，Tetramethylrhodamine，Sulforhodamine 101，Merocyanine 540，Atto565，Cy3，Atto550Cy3.5，Dy547，Dy548，Dy549，Dy554， Dy555，Dy556，Dy560，mCherry，mStrawberry，Alexa680，Alexa700，Alexa750， Alexa647，Cy5，Cy5.5，Cy7，Dy647，Dy648，Atto590中的任意一种；

或者，

2)当供体荧光分子为Tb时，与之配对的受体荧光分子可以选自于：D2，XL665，Fluorescein，GFP，Lucifer yellow，Acridine yellow，Proflavine，Atto465，Nitrobenzoxadiazole，Courmarin 6，Alexa750，Cy7，Nile red，Alexa488，Dy495，Dy490，Dy648，Dy647，Oregon green，Atto488，Atto495，Alexa514，Atto520，Cy2，Rhodamine6G，Alexa700，Alexa680，Atto532，Alexa532，APC，EGFP，YFP，mPlum，Atto425， Alexa430，Coumarin 343，Acridine Orange，Tetramethylrhodamine，Sulforhodamine 101，Merocyanine 540，Atto565，Cy3，Cy5，Att0590，Atto550，Cy3.5，Cy5.5，Dy547， Dy548，Dy549，Dy554，Dy555，Dy556，Dy560，Alexa647，mCherry，mStrawberry 中的任意一种。

本发明包含如下实施方案：

项目1、一种提高激动型抗体的激动活性的方法，其特点在于，对所述激动型抗 体的重链恒定区进行修饰，以降低所述激动型抗体的柔性。优选地，所述修饰选自以 下一种或多种，(1)在上部铰链结构域中插入1、2、5或至少6个位阻较小的氨基 酸，(2)从上部和/或中部铰链结构域中删除位阻较大的氨基酸，(3)将上部和/或 中部铰链结构域中位阻较大氨基酸突变为位阻更小的氨基酸。更优选地，(1)是在 上部铰链结构域的N端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少 第5个氨基酸后、或上部铰链结构域和中间铰链结构域之间插入1、2、5或至少6 个位阻较小的氨基酸，优选地，所述至少6个是6、12或18个，(2)是从上部和/ 或中部铰链结构域的C端至少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至 少第5个氨基酸开始删除位阻较大的氨基酸，(3)包括将上部和/或中部铰链结构域 突变为IgG3或mIgG2a的相应区域，或将铰链区突变为IgG3或mIgG2a的铰链区， 或将CH1-铰链区突变为IgG3或mIgG2a的CH1-铰链区。更加优选的是，(1)中的 插入是插入1、2、5或至少6个选自G和S的氨基酸，或者(1)是在上部铰链结构 域和中间铰链结构域之间插入G、GS、SG、GSGSG、SGSGS、GGGGS、GGGSG、 GGSGG、GSGGG、SGGGG、GSGSG、GSSGG、GGSSG、GSGGS、GGSGS、GGGSS、 SGGSG、SGSGG、SSGGG、SGGGS、SGSGS、SGGSS、SSGGS、SGSSG、SSGSG、 SSSGG、GSSGS、GSGSS、GGSSS、GSSSG、GSSSS、SGSSS、SSGSS、SSSGS、 SSSSG或(GSGSGS)_n，其中n为1、2或3。

项目2、如项目1所述的方法，其特点在于，修饰之后所述激动型抗体的柔性不 超过人IgG1。

项目3、如项目1所述的方法，其特点在于，对所述重链恒定区中的CH1-铰链 区进行修饰。

项目4、如项目1所述的方法，其特点在于，将所述重链恒定区中的铰链区被柔 性更弱的序列替换，优选地所述序列为人IgA2的铰链区序列。

项目5、如项目1-4任一所述的方法，其特点在于，对所述抗体的修饰不显著降 低所述抗体对其特异性靶向的抗原的亲和力。

项目6、如项目1-4所述的方法，其特点在于，进一步对所述重链恒定区中Fc 段进行修饰，以提高所述激动型抗体和FcγRIIB的亲和力或者所述激动型抗体的I/A 比值。

项目7、如项目1-4所述的方法，其特点在于，修饰后的所述激动型抗体的回转 半径(Rg)为优选地为或者小于人IgG1的Rg。

项目8、如项目1-4任一所述的方法，其特点在于，所述抗体特异性识别TNF 受体超家族中受体。

项目9、如项目1-4任一所述的方法，其特点在于，所述抗体为抗CD40抗体或 者抗DR5抗体。

项目10、一种降低抗体的激动活性的方法，其特点在于，对所述激动型抗体的 重链恒定区进行修饰，提高所述抗体的柔性。优选地，所述修饰选自以下一种或多种， (1)在上部铰链结构域中插入3或4个位阻较小的氨基酸(2)从上部和/或中部铰 链结构域中删除位阻较小的氨基酸，(3)将上部和/或中部铰链结构域中位阻较小氨 基酸突变为位阻更大的氨基酸，(4)在上部和/或中部铰链结构域中插入位阻较大的 氨基酸；更优选地，(1)是在上部铰链结构域的N端至少第1个、至少第2个、至 少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸后、或上部铰链结构域和中间铰链结构域 之间插入3或4个位阻较小的氨基酸，(2)是从上部和/或中部铰链结构域的C端至 少第1个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸开始删除位阻 较小的氨基酸，(3)包括将上部和/或中部铰链结构域突变为IgG1、IgG2或IgA2的 相应区域，或将铰链区突变为IgG1、IgG2或IgA2的铰链区，或将CH1-铰链区突变 为IgG1、IgG2或IgA2的CH1-铰链区，(4)是在上部铰链结构域的N端至少第1 个、至少第2个、至少第3个、至少第4个或至少第5个氨基酸后、或上部铰链结构 域和中间铰链结构域之间插入至少1个、至少2个、至少3个、例如1-20个、1-15 个或1-10个位阻较大的氨基酸。更加优选的是，(1)中的插入是插入3或4个选自 G和S的氨基酸，或者，(1)是在上部铰链结构域和中间铰链结构域之间插入GSG、 GGS、SGG、GSS、SGS、SGG、GGGS、GGSG、GSGG、SGGG、GGSS、GSGS、 SGGS、GSSG、SSGG、SGSG、SSSG、SSGS、SGSS或GSSS。

项目11、如项目10所述的方法，其特点在于，修饰之后所述激动型抗体的柔性 大于或相当于IgG3。

项目12、如项目10所述的方法，其特点在于，对所述重链恒定区中的CH1-铰 链区进行修饰，以提高所述激动型抗体的柔性。

项目13、如项目12所述的方法，其特点在于，在所述CH1-铰链区中插入柔性 连接序列，优选地所述柔性连接序列为包含G、S的柔性连接序列，更优地所述柔性 连接序列为GSGSGS，或者将所述CH1-铰链区替换为人IgG3的CH1-铰链区。

项目14、如项目10-13任一所述的方法，其特点在于，对所述抗体的修饰不显 著降低所述抗体对其特异性靶向的抗原的亲和力。

项目15、如项目10-13所述的方法，其特点在于，修饰后的所述激动型抗体的 回转半径(Rg)大于

项目16、如项目10-13所述的方法，其特点在于，进一步对所述重链恒定区中 Fc段进行修饰，以降低所述激动型抗体和FcγRIIB的亲和力或者所述激动型抗体的 I/A比值。

项目17、如项目1-16任一所述的方法，其特点在于，所述抗体为人抗体、嵌合 抗体或者人源化抗体。

项目18、一种抗体的激动活性的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供一种激动型抗体作为母本，并提供在母本基础上CH1-铰链区经过修饰 的所述母本的变体，其中将母本的CH1-铰链区替换为人IgG1的CH1-铰链区的抗体 被称为人IgG1变体；

2)对母本以及变体的柔性进行检测；

3)根据柔性检测结果，从所有激动型抗体中筛选出柔性不高于人IgG1变体的 抗体，这些抗体具有较好的激动活性。

项目19、如项目18所述的筛选方法，其特点在于，还包括对所述母本以及变体 和FcγRIIB的亲和力和/或所述激动型抗体的I/A比值进行检测，比较检测结果，筛 选出FcγRIIB的亲和力以及I/A比值不低于人IgG1变体的抗体，这些抗体具有较好 的激动活性。

项目20、如项目18所述的筛选方法，其特点在于，所述步骤2)包括：

1)提供一种能够与所述激动型抗体的抗原结合部分特异性结合的抗原；

2)将抗原分别标记能够实现荧光共振能量转移的一对供体荧光分子和受体荧光分子，获得供体荧光标记抗原以及受体荧光标记抗原；

3)在所述激动型抗体中分别加入所述供体荧光标记抗原以及受体荧光标记抗原；

4)对供体荧光分子进行激发，检测受体荧光分子发射出的荧光信号，所述荧光 信号的强度与所述激动型抗体的柔性程度呈正相关性。

项目21、如项目18所述的筛选方法，其特点在于，所述步骤2)包括：

1)运用小角X射线散射的方法检测所述抗体母本以及变体的以下参数中的任意一种或者多种：回转半径(Rg)、Dimensionless Kratky plots(或Kratky plots)特征、P(R)/I(0)(或P(R))分布、P(R)/I(0)(或P(R))大尺寸分布、EOM方法计算的回转半 径(Rg)、EOM方法计算的最大原子间距离(Dmax)分布、EOM方法计算的Rflex 或Rσ数值；

2)所述回转半径(Rg)越大、Dimensionless Kratky plots(或Kratky plots)曲线上扬程度越高、EOM方法计算的回转半径(Rg)和最大原子间距离(Dmax)分布 越宽、Rflex和Rσ数值越大，抗体柔性越强；反之，抗体柔性越弱。

项目22、一种生物大分子的柔性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供所述生物大分子；

2)提供能够与所述生物大分子的两个单独的表位分别进行特异性结合的两种表位识别分子；

3)将两种表位识别分子分别标记供体荧光分子和受体荧光分子，所述供体荧光分子和所述受体荧光分子互相匹配，并能够实现荧光共振能量转移；

4)将标记后的两种表位识别分子与所述生物大分子混合；

5)对供体荧光分子进行激发，检测受体荧光分子发射出的荧光信号，所述荧光 信号的强度与所述抗体的柔性程度呈正相关性。

项目23、如项目22所述的检测方法，其特征在于，所述生物大分子为蛋白、核 酸、脂类分子、糖类分子或者他们相互结合的形成的复合体。

项目24、如项目22所述的检测方法，其特征在于，所述生物大分子存在所述两 个单独的表位之间的距离介于所述供体荧光分子和配体荧光分子的R0和2R0之间的 构象。

项目25、如项目22所述的检测方法，其特征在于，所述生物大分子为抗体，所 述表位为抗体的抗原结合位点，所述表位识别分子为抗原。

项目26.如项目22所述的检测方法，其特征在于，所述供体荧光分子为Tb， 与之配对的所述受体荧光分子选自于D2，XL665，Fluorescein，GFP，Lucifer yellow， Acridineyellow，Proflavine，Atto465，Nitrobenzoxadiazole，Courmarin 6，Alexa750， Cy7，Nilered，Alexa488，Dy495，Dy490，Dy648，Dy647，Oregon green，Atto488， Atto495，Alexa514，Atto520，Cy2，Rhodamine6G，Alexa700，Alexa680，Atto532， Alexa532，APC，EGFP，YFP，mPlum，Atto425，Alexa430，Coumarin 343，Acridine Orange，Tetramethylrhodamine，Sulforhodamine 101，Merocyanine 540，Atto565，Cy3， Cy5，Att0590，Atto550，Cy3.5，Cy5.5，Dy547，Dy548，Dy549，Dy554，Dy555， Dy556，Dy560，Alexa647，mCherry，mStrawberry中的任意一种；或者，所述供体 荧光分子为Eu，与之配对的所述受体荧光分子选自于APC，D2，XL665，Fluorescein，GFP，Rhodamine6G，Tetramethylrhodamine，Sulforhodamine 101，Merocyanine 540， Atto565，Cy3，Atto550Cy3.5，Dy547，Dy548，Dy549，Dy554，Dy555，Dy556， Dy560，mCherry，mStrawberry，Alexa680，Alexa700，Alexa750，Alexa647，Cy5，Cy5.5，Cy7，Dy647，Dy648，Atto590中的任意一种。

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例

材料与方法

1.小鼠

FcγR缺陷(FcγRα^-/-)和FcγR人源化(FcγRα^-/-/hFcγRI⁺/hFcγRIIAR131⁺ /hFcγRIIB⁺/hFcγRIIIAF158⁺/hFcγRIIIB⁺，或“hFCGRTg”)小鼠(Mouse modelrecapitulating human Fcgamma receptor structural and functional diversity,Proc Natl Acad Sci U S A,vol.109,no.16,pp.6181-6186,2012)以及OT1小鼠(Inhibitory Fcgamma receptor is required for the maintenance of tolerancethrough distinct mechanisms,J Immunol,vol.192,no.7,pp.3021-3028,2014)由Jeffrey Ravetch博士(洛 克菲勒大学)友情提供。对于FcγR人源化小鼠，使用繁殖小鼠和过继传输其骨髓细 胞的嵌合体小鼠并确认能给出相同的结果。为了产生骨髓嵌合体小鼠，使用RS 2000pro X射线生物辐照器(Rad Source Technologies,Inc,美国)对8-10周龄的野生 型C57BL/6小鼠(SLAC，中国上海)进行8Gy的致死照射，并通过尾静脉注射转 移2×10⁶供体骨髓细胞。移植2个月后，收集骨髓重建小鼠的外周血，通过流式细 胞术分析确认B细胞和CD11b⁺细胞中人FcγRIIA/B表达水平的重建超过95％。所 有小鼠在上海交通大学医学院动物科学部的无特定病原体动物设施中饲养和维持。所 有动物护理和研究均按照机构和NIH指南进行，并已获得SJTUSM机构动物护理和 使用委员会(Protocol RegistryNumber：A-2015-014)的批准。

2.抗体

不同重链恒定区的抗小鼠CD40抗体(1C10克隆)，抗人CD40抗体(专利号： US7,338,660的克隆21.4.1和3.1.1)和抗小鼠DR5抗体(MD5-1克隆)根据已经发 表的方法生产(Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumoractivities of agonistic CD40 antibodies,Science(New York,NY),vol.333,no.6045,pp. 1030-1034,2011；Apoptotic and antitumor activity of death receptorantibodies require inhibitory Fcγreceptor engagement,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,vol.109,no.pp.10966-10971,2012)。简而言之，抗CD40 和抗DR5抗体的重链表达构建体通过将人IgG恒定区序列亚克隆到具有1C10和DR5 重链基因可变结构域的哺乳动物表达载体中，即，抗CD40抗体的重链表达构建体通 过将人IgG或者鼠IgG恒定区序列亚克隆到具有1C10重链基因可变结构域的哺乳动 物表达载体中，或者，抗DR5抗体的重链表达构建体通过将人IgG恒定区序列亚克 隆到具有DR5重链基因可变结构域的哺乳动物表达载体中(InhibitoryFcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities ofagonistic CD40 antibodies,Science(New York,NY),vol.333,no.6045,pp.1030-1034,2011；Apoptotic and antitumor activity of death receptor antibodies requireinhibitory Fcγreceptor engagement,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,vol.109,no.pp.10966-10971,2012)，或者直接通过定点诱变(Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant andanti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies,Science(New York,NY),vol.333,no.6045,pp.1030-1034,2011)产生。基于 IMGT数据库http://www.imgt.org/中的人IgG序列，通过基因合成(Biosune,上海， 中国)获得人IgG2、3、4恒定区序列(CD序列)。嵌合恒定区的序列G3(H2)和G2(H3) 也是基于IMGT序列合成的，其中“G1-G3”分别为IgG1-3重链恒定区的CH2-CH3 区域，“H1-H3”分别指IgG1-3重链恒定区的CH1-铰链区。V11(H1)是先前描述的 携带G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变的人IgG1重链恒定区变体(Engineered antibody Fc variant with selectively enhanced FcgammaRIIb bindingover both FcgammaRIIa(R131)and FcgammaRIIa(H131),Protein Eng Des Sel,vol.26,no.10, pp.589-598,2013)。V11(H2)和V11(H3)分别使用人IgG2和IgG3重链恒定区的CH1-铰链区以及V11变体的CH2-CH3区域。V11(H1)-V11(H3)根据序列合成。基于IMGT 数据库http://www.imgt.org/中的鼠IgG序列，通过基因合成(Biosune,上海，中国) 获得鼠IgG1、2a恒定区序列(CD序列)。嵌合恒定区的序列G1(H2a)是根据IgG1 和IgG2序列通过融合分子克隆方法获得。抗CD40和抗DR5抗体轻链表达构建体已 经在本发明先前发表的文章和专利中描述了(Inhibitory Fcgamma receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies,Science(New York, NY),vol.333,no.6045,pp.1030-1034,2011；Apoptotic and antitumor activity of death receptorantibodies require inhibitory Fcgamma receptor engagement,Proc Natl Acad SciU S A,vol.109,no.27,pp.10966-10971,2012)。为了产生抗体，将抗体重链和轻链表 达载体瞬时转染到293T细胞中，使用蛋白G Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare) 纯化分泌到上清液中的抗体，透析到磷酸盐缓冲液(PBS)中。通过内毒素鲎试剂测 定法(ThermoScientific)分析LPS(内毒素)水平，并确认其<0.1EUμg^-1。对抗体产 物进行SEC分析以评估多聚体聚集物的水平，并且使用不存在可辨别多聚体的抗体。

用于诱变产生IgG2(GS)3重链的正向引物(IgG2(GS)3f)和反向引物(IgG2(GS)3r)分别是：

IgG2(GS)3f：5'ggtagcggaagcggtagttgttgtgtcgagtgcccaccg3'(SEQ ID NO:1)；

igg2(gs)3r：5'actaccgcttccgctacctttgcgctcaactgtcttgtc3'(SEQ ID NO:2)。

用于诱变产生igg2v1或者v11h2v1重链的正向引物(igg2v1f)和反向引物(igg2v1r)分别是：

igg2v1f：

5'acagttgagcgcaaaggttgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca3'(SEQ ID NO:3)；

igg2v1r：

5'gcactcgacacaacaacctttgcgctcaactgtcttgtccacctt3'(SEQ ID NO:4)。

用于诱变产生igg2v2或者v11h2v2重链的正向引物(igg2v2f)和反向引物(igg2v2r)分别是：

igg2v2f：

5'aagacagttgagcgcaaaggtagctgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca3'(SEQ ID NO:5)；

igg2v2r：

5'gcactcgacacaacagctacctttgcgctcaactgtcttgtccacctt3'(SEQ ID NO:6)。

用于诱变产生igg2v3或者v11h2v3重链的正向引物(igg2v3f)和反向引物(igg2v3r)分别是：

igg2v3f：

5'aagacagttgagcgcaaaggtagcggatgttgtgtcgagtgcccaccgtgccca3'(SEQ ID NO:7)；

igg2v3r：

5'tgggcactcgacacaacatccgctacctttgcgctcaactgtcttgtccacctt3'(SEQ ID NO:8)。

用于诱变产生igg2v4或者v11h2v4重链的正向引物(igg2v4f)和反向引物(igg2v4r)分别是：

igg2v4f：

5'aagacagttgagcgcaaaggtagcggaagctgttgtgtcgagtgcccaccgtgc3'(SEQ ID NO:9)；

igg2v4r：

5'tgggcactcgacacaacagcttccgctacctttgcgctcaactgtcttgtccacctt3'(SEQ IDNO:10)。

用于诱变产生igg2v5或者v11h2v5重链的正向引物(igg2v5f)和反向引物(igg2v5r)分别是：

igg2v5f：

5'gagcgcaaaggtagcggaagcggttgttgtgtcgagtgccca3'(SEQ ID NO:11)；

igg2v5r：

5'gacacaacaaccgcttccgctacctttgcgctcaactgtctt3'(SEQ ID NO:12)。

3.ova特异性cd8⁺t细胞反应

在第1天通过尾静脉注射，将CD45.1⁺OT-1脾细胞(每只小鼠2×10⁶个细胞， 悬于200μl PBS中)过继转移给小鼠，并在第2天通过腹膜内注射2μg DEC-OVA(Differentialantigen processing by dendritic cell subsets in vivo,Science(New York,NY),vol.315,no.5808,pp.107-111,2007)以及对照或抗CD40抗体(每只小鼠 3.16-100μg，如图例中所述)进行免疫。在第7天，收获脾细胞，并且在裂解红细胞 后，用抗CD4(克隆RM4-5)，抗CD8(克隆53-6.7)，抗CD45.1(A20)抗体染 色单细胞悬浮液，抗TCR-Vα2(B20.1)进而定量OVA特异性OT-1CD8⁺T细胞。OT-1 CD8⁺T细胞定义为CD45.1⁺CD8⁺TCR-Vα2⁺细胞。对于细胞内IFN-γ染色，将脾细 胞在含有1μg ml^-1CD28抗体和1μgml^-1OVA肽(SIINFEKL)的培养基(含有10％ 胎牛血清，1％Pen-Strep，10mM HEPES，50μM2-巯基乙醇的RPMI)37℃，5％CO2 中培养1小时，然后加入布雷菲德菌素A(BFA)至终浓度为10μgml^-1，并将脾细胞 再培养5小时。根据制造商的说明书(BD Biosciences)对培养的脾细胞表面染色CD4 (克隆RM4-5)和CD8(克隆53-6.7)，然后细胞内染色IFN-γ(克隆XMG1.2)并 在BD FACSCanto II(BDBiosciences)上进行流式细胞术分析。

4.流式细胞术

收获脾脏，制备单细胞悬浮液并裂解红细胞，将约1～4×10 ⁶个脾细胞重悬在含有染色抗体的50μl FACS缓冲液(含有0.5％FBS，2mM EDTA和0.1％NaN3的1xPBS) 中，并在冰上孵育15分钟，然后通过FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于含有DAPI 或7AAD的200μlFACS缓冲液中，并通过流式细胞术分析。对于细胞内IFN-γ染 色，使用Cytofix/CytopermTM固定/透化溶液试剂盒(BD Biosciences)，根据制造 商的说明书进行另外的染色步骤。对于hFCGR^Tg嵌合体小鼠的重建水平分析，从小 鼠眼眶收集肝素化血液并用抗CD19(克隆1D3)，抗CD11b(克隆M1/70)，抗人 CD32(克隆FLI8.26)染色；此外用抗人CD40(克隆5C3)染色分析人FcγR和人 CD40的重建水平。

5.小角度X射线散射(SAXS)

SAXS数据是在上海同步辐射装置(SSRF)的国家蛋白质科学中心(NCPSS) 配备有Pilatus 1M检测器(DECTRIS Ltd)的光束线BL19U2上收集的(The new NCPSS BL19U2beamline at the SSRF for small-angle X-ray scattering from biologicalmacromolecules in solution,J Appl Crystallogr,vol.49,no.Pt 5,pp.1428-1432,2016)。纯 化的单体抗CD40抗体通过尺寸排阻色谱法(SEC)验证。收集一系列稀释的抗体样品(0.4-2.8mg ml^-1)，所有样品均在HBS缓冲液(150mM氯化钠，10mM HEPES PH 7.4)中，每个浓度样品60ul，将样品暴露于240×80μm X射线束的毛细管。使用由 Cornel High EnergySynchrotron Source(CHESS)开发的BioXTAS RAW软件(版本 1.2.1)进行数据减少，束线强度归一化和缓冲减法处理。使用来自ATSAS程序套件 (版本2.8.4(r10553))的软件进行SAXS数据分析(ATSAS 2.8:a comprehensive data analysis suite for small-anglescattering from macromolecular solutions,J Appl Crystallogr, vol.50,no.Pt 4,pp.1212-1225,2017)。将从最高浓度的样品获得的SAXS数据用于 Guinier分析，P(R)分析和Kratky图，而将从最高和最低浓度的样品获得的数据用于 EOM(Advanced ensemblemodelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering,IUCrJ,vol.2,no.Pt 2,pp.207-217,2015)分析。回转半径(Rg)和I(0)由 来自ATSAS程序套件(版本2.8.4)(PRIMUS:a Windows PC-based system for small-angle scattering dataanalysis,Journal of Applied Crystallography,vol.36,no.5,pp. 1277-1282,2003)的程序PRIMUSQT的“Autorg”(“回转半径”)函数计算(Analysis of X-ray and neutronscattering from biomacromolecular solutions,Curr Opin Struct Biol,vol. 17,no.5,pp.562-571,2007)，使用GNOM(Determination of the regularization parameterin indirect-transform methods using perceptual criteria,Journal of AppliedCrystallography, vol.25,no.4,pp.495-503,1992)(程序PRIMUSQT的“距离分布”函数(PRIMUS:a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis,Journal of Applied Crystallography,vol.36,no.5,pp.1277-1282,2003))确定配对分布函数P(R)和最大原 子间距离(Dmax)，还使用程序PRIMUSQT的“距离分布”函数估计Porod体积(VP) 值，使用贝叶斯推断方法(Consensus Bayesian assessment of proteinmolecular mass from solution X-ray scattering data,Sci Rep,vol.8,no.1,pp.7204,2018)(程序PRIMUSQT 的“分子量”模块)计算分子量(Mr)值。

为了将EOM(EOM 2.1)(Advanced ensemble modelling of flexiblemacromolecules using X-ray solution scattering,IUCrJ,vol.2,no.Pt 2,pp.207-217,2015)应用于人IgG 抗体的SAXS数据，使用了公开的方法(In-depth analysis ofsubclass-specific conformational preferences of IgG antibodies,IUCrJ,vol.2,no.Pt 1,pp.9-18,2015)。简 而言之，每种抗体被认为是通过柔性接头连接的5个刚性体：从PDB 1HZH(Crystal structure of a neutralizing human IGG against HIV-1:atemplate for vaccine design, Science(New York,NY),vol.293,no.5532,pp.1155-1159,2001)的铰链中提取的2个 固定的CPPC片段模拟二硫键，2个Fab和1个Fc结构域。提取的CPPC片段也用 作IgG3铰链区中第二“CPRC”的模型，用于Fab和Fc结构域的PDB文件或者从晶体 结构(用于IgG1 Fc的PDB 1HZH(Crystal structure of a neutralizing humanIGG against HIV-1:a template for vaccine design,Science(New York,NY),vol.293,no.5532,pp. 1155-1159,2001)；用于IgG2 Fc的PDB 4HAG(IgG2 Fc structure and thedynamic features of the IgG CH2-CH3 interface,Mol Immunol,vol.56,no.1-2,pp.131-139,2013)) 提取，或者通过使用SWISS-MODEL Workspace(The SWISS-MODELworkspace:a web-based environment for protein structure homology modelling,Bioinformatics,vol.22, no.2,pp.195-201,2006)的同源建模产生。对于同源性建模，选择PDB 5W38(Structural characterization of the Man5 glycoform of human IgG3Fc,Mol Immunol,vol.92,no.pp. 28-37,2017)作为IgG3和V11 Fc的模板，并选择PDB 6AMM(Structure-based engineering to restore high affinity binding of an isoform-selective anti-TGFbeta1 antibody, MAbs,vol.10,no.3,pp.444-452,2018)用于所有IgG Fab结构域。使用默认设置执行 EOM。

6.时间分辨FRET(TR-FRET)

小鼠CD40细胞外结构域(His标记，Novoprotein，中国)分别用铽(Tb)和 D2(化学，Cisbio Bioassays，中国)标记，以获得CD40-Tb(1.5Tb/CD40) 和CD40-D2(0.3D2/CD40)。将CD40-Tb，CD40-D2和对照或抗CD40抗体在 TPBS-BSA(5x PBS+0.2％BSA+0.05％Tween-20)中稀释至最佳浓度，并在Proxi PlateTM-384F Plus 384-Well板(PerkinElmer，货号：6008260)中混合至终体积20μl。 小鼠CD40-Tb的终浓度为2.6nM，小鼠CD40-D2的终浓度为41.6nM(浓度比， CD40-Tb：CD40-D2＝1:16)。将对照和抗小鼠CD40单克隆抗体从512nM至4nM 2 倍连续稀释，将板在室温下孵育1小时，然后使用Synergy neo酶标仪(Biotech Instruments，Inc.，美国)读取TR-FRET信号，其设置如下：在330nm激发，记录前 延迟50μs，荧光计数400μs通过620nm(对于Tb)和665nm(对于D2)发射滤光 片的信号，分析“Em 665nm/Em 620nm”强度比作为TR-FRET信号。

7.抗DR5抗体的体外促凋亡活性

将MC38细胞(密度～80％)铺在平底96孔组织培养板(Thermo，货号167008) 中，密度为每孔8×10⁴个细胞，200μl完全培养基(DMEM+10％胎牛血清+1％ Pen/Strep)，培养过夜。轻轻吸出培养基后，加入重悬于100μl完全培养基的4×10⁵个裂解红细胞的FcγRα^-/-或hFCGR^Tg B6小鼠脾细胞，然后加入100μl含有1μgml^-1对照IgG，αDR5：hIgG1，αDR5：hIgG2，αDR5：hIgG3，αDR5：hIgG4，αDR5：hIgG V11(H1)，hIgG V11(H2)，hIgG V11(H2)V1，hIgG V11(H2)V2，hIgG V11(H2)V3，hIgG V11(H2)V4，hIgG V11(H2)V5，hIgG V11(H2)V6或αDR5：hIgGV11(H3)伴随加入或 不加1μgml^-1的2B6的培养基(Jackson Immuno Research，货号009-000-003)。4个 小时后，收获细胞并用抗小鼠CD45.2抗体(BD，货号560691)染色，然后根据制 造商的说明使用Annexin V FITC凋亡检测试剂盒I(BD Biosciences，货号556547) 进行Annexin V/PI染色，以及细胞内活化caspase-3染色(克隆C92-605；BD Biosciences)。用BD FACS CaliburTM或LSRFortessaTM X-20流式细胞仪分析样品。 基于正向，侧向散射和CD45.2阴性圈出MC38细胞，并分析AnnexinV⁺PI^-或者活化 caspase-3⁺凋亡细胞的百分比。

8.肝毒性

为了研究抗DR5抗体的肝毒性作用，给小鼠静脉注射100μg抗DR5抗体治疗 并监测1个月的存活率。在治疗后6天，使用MaxDiscovery Assay Kit(Bioo Scientific) 天冬氨酸转氨酶酶法，根据制造商的说明分析小鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶水平。

9.统计分析

用GraphPad Prism(版本6.01，用于windows)进行统计学分析，并且p值小于 0.05被认为在统计学上是显着的。星号表示与对照组的统计学比较，除非在图中另 有说明(*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，***p≤0.0001)。

实施例1 TR-FRET能够分析抗体柔性原理

前期工作表明，人类IgG1、2、3抗体的激动型活性之间的关系是IgG2>IgG1> IgG3(中国专利申请号：201710429281.6，PCT/CN2017/087620)为了研究抗体的柔 性或活性之间的关系，TR-FRET方法被用来分析抗体的柔性。以抗鼠CD40抗体为 例，鼠CD40分别由TR-FRET激发(Tb)和接受(D2)荧光基团标记后与抗鼠CD40 抗体混合(图2a)，部分抗体的双臂能够分别结合CD40-Tb和CD40-D2。根据TR-FRET 的原理，如果Tb和D2之间的距离小于两倍半径(2R0)，激发Tb能够产 生TR-FRET信号，而信号的强度由Tb和D2之间的距离的分布决定。对于Tb和D2 荧光基团来说，2R0的距离是11.6纳米(Reference(Terbium-basedtime-gated Forster resonance energy transfer imaging for evaluating protein-protein interactions on cell membranes,Dalton transactions(Cambridge,England:2003),vol.44,no.11,pp. 4994-5003,2015)(Resonance energy transfer:methods andapplications,Analytical biochemistry,vol.218,no.1,pp.1-13,1994)andCisbio.com)。根据目前有完整晶体结 构的两个抗体来看，它们的抗原结合位点之间的距离是12～17纳米(Reference(Crystal structure of a neutralizing human IGGagainst HIV-1:a template for vaccine design, Science(New York,NY),vol.293,no.5532,pp.1155-1159,2001；Structure of full-length human anti-PD1 therapeuticIgG4 antibody pembrolizumab,Nature structural&molecular biology,vol.22,no.12,pp.953-958,2015)和图3)，超过了能够产生TR-FRET信号的 最小距离(图2b)。在这种条件下，抗体铰链区的柔性使得抗体的双臂和抗原能够 在溶液中摆动，从而使得CD40-Tb和CD40-D2之间的距离有可能减小到2R0(11.6 纳米)以内(图2b)。重要的是，当Tb和D2之间的距离从2R0开始减小时，TR-FRET 的信号会呈六次方指数增长(Reference(Resonanceenergy transfer:methods and applications,Analytical biochemistry,vol.218,no.1,pp.1-13,1994))，极大的增强 TR-FRET信号。因此，柔性更强的抗体中存在更多的分子有着更小的Tb-D2距离， 从而能够产生更强的TR-FRET信号；反之，僵硬的抗体铰链区则会限制抗体双臂的 摆动，使得Tb-D2更多时候的距离都比较大，从而降低TR-FRET的信号(图2b)。

实施例2 TR-FRET分析显示具有柔性最强铰链区的IgG3抗体的TR-FRET信 号最高，而具有柔性最弱铰链区的IgG2抗体的TR-FRET信号最低(图4)。为了 分析不同人类天然IgG抗体的柔性，我们用上述TR-FRET方法平行比较了IgG1、IgG2 和IgG3抗体。将抗鼠CD40抗体分别表达为IgG1、IgG2和IgG3形式后，按照上述 方法(图2a)与CD40-Tb和CD40-D2混合后测量TR-FRET信号。结果显示，在这 三种天然IgG抗体中，IgG3抗体的TR-FRET信号最强，而IgG2抗体的TR-FRET信 号最弱(图4a)，提示IgG3抗体最灵活，而IgG2抗体僵硬到足够限制其双臂摆动 触发TR-FRET信号。为进一步分析影响IgG抗体柔性的因素是否为铰链区，我们表 达了可变区和Fc区相同、铰链区分别来自IgG1、IgG2和IgG3的V11(H1)、V11(H2) 和V11(H3)抗体。平行比较结果显示，这三种抗体的TR-FRET信号特征与对应的IgG 抗体具有一致的特征(图4b)，提示这些IgG抗体的柔性主要受到抗体铰链区的影 响。进一步分析IgG2和IgG3交换铰链区产生的嵌合抗体(G2(H3)和G3(H2)抗体) 显示，移植抗体铰链区序列能够移植对应的柔性特征(图4c)。这些结果表明TR-FRET 分析能否却分不同IgG抗体因铰链区不同而导致的不同灵活属性，其中柔性最强的 IgG3铰链区对应最高的TR-FRET信号最高，而柔性最低的IgG2铰链区对应最低的 TR-FRET信号。

实施例3小角度X-射线散射(small-angle X-ray scattering，SAXS)分析确认IgG3抗体柔性更强而IgG2抗体柔性更弱(图5-6)。

小角度X-射线散射技术是一种被广泛接受的但对硬件设施要求较高的生物大分子研究方法，能够分析溶液中的生物大分子的柔性特征(How Random are IntrinsicallyDisordered Proteins？A Small Angle Scattering Perspective,Curr Protein PeptSc,vol.13, no.1,pp.55-75,2012)。经分子筛纯化得到的抗CD40抗体单体分子经梯度稀释后进行 小角散射分析(图5)。Dimensionless Kratky plots结果表明在IgG1、IgG2和IgG3抗体中，IgG1和IgG2的曲线的顶点都非常接近Guinier–Kratky点(1.103)(图 5a)，表明IgG1和IgG2抗体都具有球形蛋白的特征(NADPH oxidase activator P67(phox)behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers,JStruct Biol,vol. 169,no.1,pp.45-53,2010；How Random are IntrinsicallyDisordered Proteins？A Small Angle Scattering Perspective,Curr Protein PeptSc,vol.13,no.1,pp.55-75,2012)；同时， IgG3抗体的Dimensionless Kratky plots的顶点明显的向右上方移动，表明IgG3是一 个由灵活的连接序列链接的多功能域蛋白(HowRandom are Intrinsically Disordered Proteins？A Small Angle ScatteringPerspective,Curr Protein Pept Sc,vol.13,no.1,pp. 55-75,2012)，证实了TR-FRET对IgG3抗体的分析结果；同时，能反应分子大小的 P(R)/I(0)、Rg、Dmax等结果也支持IgG3抗体分子尺寸更大(图5b、图6)，具有更 加松散的结构。进一步分析V11(H1)、V11(H2)和V11(H3)抗体表明它们的小角散射 特征和天然IgG1、IgG2和IgG3抗体的小角散射特征一致(图5c、图5d)，提示这 些IgG抗体的柔性主要受到抗体铰链区的影响。进一步分析IgG2和IgG3交换铰链 区产生的嵌合抗体(G2(H3)和G3(H2)抗体)显示，移植抗体铰链区序列能够移植对 应的小角散射柔性特征(图5e、图5f、图6)。这些结果进一步支持TR-FRET分析 是分析抗体分子柔性的有效手段。需要指出的是，IgG1和IgG2抗体的Dimensionless Kratky plots特征比较接近，以此为依据清楚的判断两者的柔性差别比较困难。

进一步使用为小角散射数据分析开发的Ensemble optimization method(EOM)方法能够定量的评估样本的柔性(In-depth analysis of subclass-specificconformational preferences of IgG antibodies,IUCrJ,vol.2,no.Pt 1,pp.9-18,2015；Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-raysolution scattering,IUCrJ,vol.2,no.Pt 2,pp.207-217,2015)。EOM分析结果显示，在分析的IgG1、IgG2和IgG3三种天然 抗体中，IgG2抗体的回转半径(Rg)和最大原子间距(Dmax)的分布都是最窄的(图 5g、图5h)，和以前的研究结果一致(In-depth analysis ofsubclass-specific conformational preferences of IgG antibodies,IUCrJ,vol.2,no.Pt 1,pp.9-18,2015)，而IgG3抗体的Rg 和Dmax分布则是最宽的，提示IgG2和IgG3抗体分别是三种抗体中最不灵活和最灵 活的。此外，EOM分析得到的、能够定量反应柔性的Rflex和Rσ数值进一步支持 三种抗体的柔性关系是IgG3>IgG1>IgG2(图6)。最后，进一步分析V11(H1)、 V11(H2)和V11(H3)抗体表明它们的Rg和Dmax分布，以及Rflex和Rσ相对关系都和对应的天然IgG1、IgG2和IgG3抗体一致(图5i、图5j、图6)，而交换IgG2和 IgG3抗体的铰链区同时也交换了这些特征(图5k、图5l、图6)。

一方面，上述结果进一步支持三种天然IgG抗体的柔性相对关系为IgG3>IgG1>IgG2且主要由它们的铰链区决定；另一方面这些结果也进一步验证了TR-FRET对抗 体柔性的分析结果，说明TR-FRET是一种非常灵敏的分析方法，不需要进行复杂的 模拟分析就能够区分IgG1和IgG2的柔性。

实施例4鼠IgG灵活性影响鼠源IgG激动性(图7)

通过SAXS方法检测鼠源IgG抗体柔性，Dimensionless Kratky plots分析显示，mIgG2a显示出上扬的特征，说明mIgG2a具有比mIgG1更强的柔性，而通过铰链区 更换，铰链区柔性也随之转移(图7a)。

为了分析鼠源激动型抗体的激动活性和铰链区柔性的关系，抗CD40鼠源IgG 抗体(克隆1C10)不同天然IgG(IgG1，IgG2a)和铰链区互换的变体(IgG1(H2a)) 的免疫激活活性进行了比较。结果显示，柔性弱(刚性强)的IgG1抗体的激动活性 最强，而柔性强的IgG2a抗体的激动活性最弱(图7b，图7c)。同时，铰链区更换， IgG2a的柔性铰链区能提供给变体IgG1(H2a)低于母体IgG1的激动性。这些结果表明， 在1C10抗CD40鼠源IgG抗体中，柔性最弱的IgG1铰链区能够提供最佳激动活性， 而柔性最强的IgG2a铰链区支持的激动活性最弱。

实施例5 TR-FRET分析增强柔性的IgG2铰链区突变体，并由SAXS确认(图 8-9)

为了进一步验证TR-FRET分析抗体柔性的方法，1～3个“GSGSGS”链接序列 被插入到IgG2抗体的铰链区中产生了三种的IgG2变体：IgG2(GS)3、IgG2(GS)6、和 IgG2(GS)9(图15)，预期插入序列的长度越长，越能增加抗体的柔性。TR-FRET 分析结果显示，随着插入序列的增长，抗体的TR-FRET信号明显增加(图8)，说 明柔性增加，和预期一致。小角散射分析IgG2抗体和这几种变体显示，插入的 “GSGSGS”链接序列越长，抗体的DimensionlessKratky plots越表现出上扬的特征 (图9)，说明具有更高的柔性。因此，对IgG2和IgG2(GS)3、IgG2(GS)6、IgG2(GS)9 等IgG2变体的TR-FRET和小角度X-射线散射的分析，进一步验证了TR-FRET是一 种灵敏的定量的柔性分析方法。同时，这些结果也表明，改变IgG抗体铰链区的长 度或氨基酸序列能够改变抗体的柔性，增长铰链区的长度能够增强抗体的柔性。

实施例6增强IgG2铰链区的柔性能够降低IgG2抗体的激动型活性(图10)。

进一步分析IgG2和IgG2(GS)3、IgG2(GS)6、IgG2(GS)9等IgG2变体抗CD40 抗体的免疫激活活性结果表明，具有更强柔性的IgG2变体抗CD40抗体的免疫激活 活性明显低于IgG2抗体，表现为更少的抗原特异CD8阳性T细胞数量和比例(图 10)。这些结果说明增强IgG抗体的柔性能够影响IgG抗体的激动活性。当IgG2抗 体的柔性增加到一定程度之后，抗体就失去了的激动活性。

实施例7改变铰链区氨基酸序列能够增强IgG抗体灵活性(IgG1 vs IgG1-A2， 以及其它增强灵活性的例子)(图11)

通过TR-FRET分析可以从天然铰链区及突变体中筛选具有不同柔性特征的铰 链区序列。其中，移植了IgA2铰链区序列的IgG1抗体(IgG1A2)表现出比IgG1抗 体柔性更低的TR-FRET信号，反应了它的柔性更低的特征(图11a)。进一步通过 SAXS方法分析验证IgG1A2灵活性，Dimensionless Kratky plots分析显示，IgG1A2 曲线相较母本IgG1下降的特征，显示IgG1A2具有比IgG1更低的柔性(刚性更强) (图11b)。

实施例8改变铰链区氨基酸序列降低IgG抗体柔性能够影响抗体激动活性(图 12)

进一步分析G1A2抗CD40抗体的免疫激活活性结果表明，G1A2较IgG1具有 更强的免疫激活活性(图12)。这些结果说明减弱IgG抗体的柔性也能够影响IgG 抗体的激动活性。当IgG1抗体的柔性降低之后，抗体能够获得更强的激动活性特征。

实施例9 1C10克隆人IgG抗体的最佳天然铰链区是IgG2铰链区(V11H2> V11H1>V11H3)

为了分析激动型抗体的激动活性和铰链区柔性的关系，抗CD40抗体(克隆1C10)具有相同可变区和Fc区、不同天然IgG铰链区的三种形式(V11(H1)、V11(H2)和 V11(H3))的免疫激活活性进行了平行比较。结果显示，柔性最弱(刚性最强)的V11(H2) 抗体的激动活性最强，而柔性最强的V11(H3)抗体的激动活性最弱(图13a)。这些 结果表明，在1C10抗体中，柔性最弱的IgG2铰链区能够提供最佳激动活性，而柔 性最强的IgG3铰链区支持的激动活性最弱。

实施例10 MD5-1克隆人IgG抗体的最佳天然铰链区是IgG1铰链区(V11H1> V11H2>V11H3)

为了进一步分析激动型抗体的激动活性和铰链区柔性的关系，抗DR5抗体(克 隆MD5-1)具有相同可变区和Fc区、不同天然IgG铰链区的三种形式(V11(H1)、 V11(H2)和V11(H3))的激动活性进行了平行比较(抗DR5抗体的激动活性表现为诱 导细胞凋亡的能力)。结果显示，柔性居中的V11(H1)抗体的激动活性最强，而柔性 最强的V11(H3)抗体的激动活性最弱(图13b)。这些结果表明，在MD5-1抗体中， 柔性居中的IgG1铰链区能够提供最佳激动活性，而柔性最强的IgG3铰链区支持的激 动活性最弱。

实施例11在铰链区插入不是3-4的倍数个氨基酸会破坏人IgG2激动活性

结构上，铰链区作为Fab和Fc的连接序列，是灵活性很强的片段，由于该区富 含脯氨酸，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的 互补性结合。插入氨基酸的个数很有可能改变扭转的角度，影响二级结构的细微变化。

为研究铰链区长度变化对激动性的影响，我们在1C10抗CD40人IgG2抗体的 上段铰链和中段铰链间依次增加甘氨酸G(Glycine，Gly)和丝氨酸S(Serine，Ser)， 产生6种IgG2变体：IgG2V1、IgG2V2、IgG2V3、IgG2V4、IgG2V5和IgG2V6 (即之前体及的G2(GS)3)。为进一步分析IgG2和IgG2V1-6 IgG2变体抗CD40抗 体的免疫激活活性，采用体外刺激人源化FcγRs脾脏细胞模型，分离hFCGRTg小 鼠脾脏细胞，加入30ug/ml对照抗体或1C10克隆抗CD40铰链区变体共孵育，48小 时后，流式检测抗原递呈细胞活化水平。结果显示，基于IgG2铰链区，添加非3或 者4个氨基酸时会明显破坏抗体对抗原递程细胞活化的激动型效应(图14a)。为验 证添加非3-4个氨基酸时会明显破坏铰链区刚性在其他激动型抗体中是否适用，我们 将“GSGSGS”链接序列中的1-6个氨基酸依次分别被插入到MD5-1抗DR5 IgGV11(H2)抗体的铰链区中，产生了6种V11H2变体：IgGV11(H2)V1、 IgGV11(H2)V2、IgGV11(H2)V3、IgGV11(H2)V4、IgGV11(H2)V5和IgGV11(H2)V6。 我们运用体外促凋亡模型，将MC38细胞与FcγR人源化C57B6/L或Fcgrα-/- C57B6/L小鼠脾脏细胞共培养，分别用对照IgG或MD5-1抗鼠DR5抗体刺激2小时， 流式检测Annexin V+PI-凋亡MC38细胞百分比量化。显示，基于V11H2铰链区， 添加非3或者4个氨基酸时会明显破坏抗体活性(图14b)，与1C10克隆抗mCD40 抗体种一致。综上，这些结果说明改造抗体铰链区时，增加3-4个氨基酸可能提供比增加不是3-4倍数个氨基酸时更高的激动性活性。

综合1C10抗体和MD5-1抗体的研究结果，说明支持不同抗体获得最佳激动活 性的抗体铰链区不一定相同，但是这些最佳铰链区的柔性都处于较弱的一端，而使用 三个天然铰链区中柔性最强的IgG3铰链区的抗体的激动活性都是最差的。这些结果 提示，一方面，为了破坏抗体的激动活性，可以通过增强抗体的柔性到一定程度实现； 另一方面，为了增强抗体的激动活性，则需要针对不同抗体克隆，在具有不同柔性的 铰链区序列中，筛选最佳铰链区序列。

尽管上文出于举例说明的目的已经描述了本发明的具体实施方案，然而本领域技术人员将领会，可以对细节进行许多改变而不背离如权利要求所描述的本发明。

序列表

<110> 上海交通大学医学院

<120> 抗体活性改造及其筛选方法

<130> 207634

<141> 2020-09-21

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtagcggaa gcggtagttg ttgtgtcgag tgcccaccg 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

actaccgctt ccgctacctt tgcgctcaac tgtcttgtc 39

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

acagttgagc gcaaaggttg ttgtgtcgag tgcccaccgt gccca 45

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gcactcgaca caacaacctt tgcgctcaac tgtcttgtcc acctt 45

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

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<400> 5

aagacagttg agcgcaaagg tagctgttgt gtcgagtgcc caccgtgccc a 51

<210> 6

<211> 48

<212> DNA

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gcactcgaca caacagctac ctttgcgctc aactgtcttg tccacctt 48

<210> 7

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<400> 7

aagacagttg agcgcaaagg tagcggatgt tgtgtcgagt gcccaccgtg ccca 54

<210> 8

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<212> DNA

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tgggcactcg acacaacatc cgctaccttt gcgctcaact gtcttgtcca cctt 54

<210> 9

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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aagacagttg agcgcaaagg tagcggaagc tgttgtgtcg agtgcccacc gtgc 54

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgggcactcg acacaacagc ttccgctacc tttgcgctca actgtcttgt ccacctt 57

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gagcgcaaag gtagcggaag cggttgttgt gtcgagtgcc ca 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gacacaacaa ccgcttccgc tacctttgcg ctcaactgtc tt 42

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Val Asp Lys Arg Val

1 5

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys

1 5 10

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Val Asp Lys Thr Val

1 5

<210> 19

<211> 3

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 19

Glu Arg Lys

1

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 20

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 21

Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro

1 5

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 22

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr

1 5 10

<210> 23

<211> 50

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 23

Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys

1 5 10 15

Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro

20 25 30

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

35 40 45

Cys Pro

50

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 24

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

1 5

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 25

Cys Pro Ser Cys Pro

1 5

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 26

Asp Val Thr Val

1

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 27

Glu Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 28

Glu Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 29

Glu Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser

20

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 30

Glu Arg Lys Gly

1

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 31

Glu Arg Lys Gly Ser

1 5

<210> 32

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 32

Glu Arg Lys Gly Ser Gly

1 5

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 33

Glu Arg Lys Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 34

Glu Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 35

Val Asp Lys Lys Ile

1 5

<210> 36

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 36

Val Pro Arg Asp

1

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 37

Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr

1 5

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 38

Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 39

Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala

1 5 10