一种磁力细胞及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种磁力细胞及其制备方法和应用 (Magnetic cell and preparation method and application thereof ) 是由 马晓蕾 曹军瑞 王旭楠 谢宝龙 王勋亮 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种磁力细胞及其制备方法和应用,所述磁性细胞为吸附有磁性纳米颗粒的油污降解菌；所述磁性细胞的制备方法包括：将油污降解菌与磁性纳米颗粒共孵育,在活化培养基中培养活化,得到所述磁性细胞。本发明的磁性细胞分散性好、传质性好、易于回收,油污降解能力强,制备方法简单、条件温和,在石油及石油产品污染水环境的生物修复领域具有重要的应用前景。(The invention provides a magnetic cell and a preparation method and application thereof, wherein the magnetic cell is an oil stain degrading bacterium adsorbed with magnetic nano particles; the preparation method of the magnetic cell comprises the following steps: and co-incubating the oil stain degrading bacteria and the magnetic nanoparticles, and culturing and activating in an activation culture medium to obtain the magnetic cell. The magnetic cell provided by the invention has the advantages of good dispersibility, good mass transfer, easiness in recovery, strong oil stain degradation capability, simple preparation method and mild conditions, and has an important application prospect in the field of bioremediation of petroleum and petroleum product polluted water environment.)
技术领域
本发明属于石油及石油产品污染水环境的生物修复技术领域，涉及一种磁力细胞及其制备方法和应用。
背景技术
随着石油资源勘探和开采力度的日益增大，原油工业迅速发展，原油及产品在为社会带来经济效益的同时，也对人类赖以生存的自然环境造成极大的破坏，原油污染物通过各种途径进入土壤、地表水和地下水中，严重污染环境。石油污染事故发生后，通常采用物理和化学方法清理掉大部分表面油污，然而残留油污中的烷烃和芳香烃类污染物仍存在于水体中，其危害同样不容小觑，可能对水体和人体健康造成严重且持续性的危害。生物修复方法被用作油污处理的终极策略，虽然过程缓慢，但是具有安全、彻底、不造成二次污染的优势。现已公开的菌体处理方法主要在油污废水污染的海洋环境、土壤水体环境中进行菌种固定化，形成高浓度菌种并防止菌体在海洋环境、土壤水体中的分散，从而降解污染物。
CN101768583A公开了以芦苇秸秆为载体的石油降解菌固定化方法与应用，首先用被石油污染的土壤筛选出石油降解菌种，以上述菌种制备石油降解菌菌悬液，向石油降解菌菌悬液中加入海藻酸钠，混合后均匀地喷洒到芦苇秸秆上5小时后达到固定化，或将石油降解菌菌悬液加入海藻酸钠与粉碎后的芦苇秸秆混合，再滴入饱和氯化钙溶液而制成硬化的颗粒以达到固定化。然而，该方法存在净化效率低于游离菌、秸秆使用寿命短等缺点。
CN105936901A公开了一种固定化菌剂及其制备方法与应用，该制备方法包括以下步骤：将迪茨氏杆菌Dietzia cercidiphylli strain HJZX-2接种到R2A培养基中进行活化培养，得到菌液；将上述菌液接种到固定化培养基中，并向其中加入改性沸石，然后将固定化培养基置于摇床中，在预定的固定化温度和固定化时间下进行培养，得到液态的固定化菌剂。然而，该方法不适用于自然环境下的油污就地处理，且固定化成本和反应成本较高。
以上现有技术均体现了固定化微生物在降解油污方面的高效性和可靠性，然而菌种固定化多采用载体吸附或载体包埋的方式，存在机械强度低、传质性能差、分散性能差、难以回收等问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种磁力细胞及其制备方法和应用，将磁性纳米颗粒吸附于油污降解菌表面，赋予细胞磁性，构建分散性好、易于固定、传质性能接近游离菌的油污降解磁性细胞，实现了基于磁分离技术处理含油污水的效果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种磁性细胞，所述磁性细胞为吸附有磁性纳米颗粒的油污降解菌，所述油污降解菌为红球菌，命名为SY095 Rhodococcus sp.，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.10724，保藏日期为2015年04月16日。
本发明中，油污降解菌红球菌SY095 Rhodococcus sp.从天津大港海岸滩涂淤泥中分离筛选而获得，将油污降解菌与磁性纳米颗粒在温和条件下震荡共孵育一段时间，基于油污降解菌菌体表面特征基团与磁性纳米颗粒修饰基团的结合性，磁性纳米颗粒吸附于油污降解菌表面，不对菌体造成改变或破坏，制备的磁性细胞游离分散性好、磁响应性佳利于回收，还具有与游离菌相当的传质性能。
优选地，所述磁性纳米颗粒包括羟基化磁性纳米颗粒、羧基化磁性纳米颗粒或氨基化磁性纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述羧基化磁性纳米颗粒包括亲水型羧基化磁性纳米颗粒和/或疏水型羧基化磁性纳米颗粒。
优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为10～50nm，优选为20nm。
本发明中，采用粒径为20nm左右的磁性纳米颗粒吸附于油污降解菌表面，不会显著影响油污降解菌的体积，制备的磁性细胞游离分散性好。
优选地，所述油污降解菌的菌龄为24～36h，例如可以是24h、28h、32h或36h，优选为28h。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的磁性细胞的制备方法，所述制备方法包括：
将油污降解菌与磁性纳米颗粒共孵育，在活化培养基中培养活化，得到所述磁性细胞。
优选地，所述油污降解菌数量与所述磁性纳米颗粒质量的比例为(5～10)％:(4～8)g。
优选地，所述共孵育在震荡条件下进行。
优选地，所述共孵育的温度为25～28℃，例如可以是25℃、26℃、27℃或28℃，优选为26℃。
优选地，所述共孵育的转速为100～150rpm，例如可以是100rpm、110rpm、120rpm、130rpm、140rpm或150rpm，优选为110rpm。
优选地，所述共孵育的时间为10～15h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h或15h，优选为12h。
优选地，所述活化培养基包括8～12g/L胰蛋白胨、8～12g/L NaCl和3～7g/L酵母提取物。
优选地，所述活化培养基的pH值为7～8，例如可以是7、7.2、7.5、7.8或8，优选为7.5。
优选地，所述油污降解菌的筛选方法包括：
采集含油淤泥，加入无菌生理盐水混合，静置后取上清液作为待筛选菌悬液；
将所述待筛选菌悬液接种于含油液体培养基中培养，吸取下层溶液接种于含油液体培养基中，重复培养，获得菌悬液；
将所述菌悬液接种于固体培养基中培养，获得油污降解菌。
优选地，所述待筛选菌悬液接种于含油液体培养基的接种量为1％～5％，例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
优选地，所述含油液体培养基包括1～5g/L NaNO3、0.1～1g/L K2HPO4、1～5g/LKH2PO4、0.01～0.1g/L CaCl2、0.1～0.5g/L KCl、0.1～0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01～0.1g/LFeSO4·7H2O、0.1～0.5g/L酵母粉、0.1～0.5mL/L微量元素溶液和0.5～2％原油，优选为2.5g/L NaNO3、0.5g/L K2HPO4、1.0g/L KH2PO4、0.01g/L CaCl2、0.1g/L KCl、0.5g/LMgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L酵母粉、0.5mL/L微量元素溶液和1％原油。
优选地，所述微量元素溶液包括0.1～0.5g/L H3BO3、0.1～0.5g/L CuSO4·5H2O、0.1～0.5g/L MnSO4·H2O、0.01～0.1g/L MoNa2O4·2H2O和0.5～1g/L ZnSO4·7H2O，优选为0.26g/L H3BO3、0.5g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.06g/L MoNa2O4·2H2O和0.7g/LZnSO4·7H2O。
优选地，所述原油包括重质原油，例如可以是未经提炼加工的成分复杂的原始油，提炼汽油柴油后的剩余油，重质原油的基本特点是粘度高、成分复杂、分子量大、对生态环境和人体健康危害极大等。
优选地，所述原油的密度为0.92～1g/cm3。
优选地，所述待筛选菌悬液接种于含油液体培养基中培养的条件为震荡培养。
优选地，所述震荡培养的温度为28～32℃，例如可以是28℃、29℃、30℃、31℃或32℃。
优选地，所述震荡培养的转速为150～200r/min，例如可以是150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min或200r/min。
优选地，所述震荡培养的时间为7～15天，例如可以是7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天。
优选地，所述重复培养的次数为5～8次。
优选地，所述磁性纳米颗粒包括羟基化磁性纳米颗粒、羧基化磁性纳米颗粒或氨基化磁性纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述羧基化磁性纳米颗粒包括亲水型羧基化磁性纳米颗粒和/或疏水型羧基化磁性纳米颗粒。
优选地，所述羟基化磁性纳米颗粒的制备方法包括：
将Fe3O4纳米颗粒和葡聚糖分别溶于0.05～0.1mol/L柠檬酸钠溶液中，按照Fe3O4纳米颗粒和葡聚糖的质量比为1:(0.5～2)向Fe3O4纳米颗粒-柠檬酸钠溶液中加入葡聚糖-柠檬酸钠溶液，超声震荡30～60min后，于85～100℃水浴中搅拌1～3h，磁分离、清洗、真空干燥，得到所述羟基化磁性纳米颗粒。
优选地，所述亲水型羧基化磁性纳米颗粒的制备方法包括：
配制4～6mol/L Fe3O4水溶液，按照摩尔比为(2～5):1加入柠檬酸，超声震荡20～40min后，水浴搅拌1～3h，磁分离、清洗、真空干燥，得到所述亲水型羧基化磁性纳米颗粒。
优选地，所述疏水型羧基化磁性纳米颗粒的制备方法包括：
配制2～4mol/L Fe3O4正己烷溶液，加入2～4mol/L油酸，超声震荡20～40min后，于50～68℃水浴中搅拌0.5～2h，磁分离、清洗、真空干燥，得到所述疏水型羧基化磁性纳米颗粒。
优选地，所述氨基化磁性纳米颗粒的制备方法包括：
配制0.005～0.01g/mL Fe3O4乙醇溶液，加入4～8倍体积乙醇，超声震荡5～10min后，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，于50～70℃水浴中搅拌6～8h，磁分离、清洗、真空干燥，得到所述氨基化磁性纳米颗粒。
作为优选技术方案，所述磁性细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)采集含油淤泥，加入无菌生理盐水混合，静置后取上清液作为待筛选菌悬液；将所述待筛选菌悬液按接种量为1％～5％接种于含油液体培养基中，28～32℃、150～200r/min震荡培养7～15天，吸取下层溶液接种于含油液体培养基中，重复培养5～8次，获得菌悬液；将所述菌悬液接种于固体培养基中培养，获得油污降解菌；
(2)制备羟基化磁性纳米颗粒、亲水型羧基化磁性纳米颗粒、疏水型羧基化磁性纳米颗粒或氨基化磁性纳米颗粒中的任意一种或至少两种的组合；
(3)将油污降解菌与磁性纳米颗粒在25～28℃、100～150rpm震荡共孵育10～15h，在活化培养基中培养活化，得到所述磁性细胞。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的磁性细胞在处理含油污水中的应用。
第四方面，本发明提供了一种含油污水的处理方法，所述方法包括：
将第一方面所述的磁性细胞置于含油污水中，进行油污降解，磁分离回收所述磁性细胞。
优选地，所述油污处理的温度为25～35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃，优选为30℃。
优选地，所述油污处理的时间为3～8天，例如可以是3天、4天、5天、6天、7天或8天，优选为5天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用比油污降解菌单细胞更小的纳米级磁性颗粒吸附于油污降解菌细胞壁上，较好地保留了微生物的生物活性，最大程度地降低了材料对细胞表面传质性能的影响，同时避免了传统菌种固定化方法一旦固定便难以分散的问题，兼顾了分散降解的均匀性和磁分离集中回收的便捷性；
(2)本发明的磁性细胞的制备方法简单、条件温和，制备的磁性细胞具有较高的油污降解活性和细胞容量，且环境友好、可回收使用、能够满足分散和集中使用的不同需求，72h对油污的降解率可达65％以上；
(3)本发明的磁性细胞可以整合于大型磁性载体上，均匀分散于水体中用于油污环境的原位处理和污水处理，在大规模推广应用方面具有显著优势。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例制备具有油污降解功能的磁性细胞，包括以下步骤：
(1)采集天津大港油田的含油淤泥，加入无菌生理盐水浸没淤泥并充分混合，静置待泥沙沉淀后取上清液作为待筛选菌悬液；
将待筛选菌悬液按接种量为5％接种于含油液体培养基(2.5g/L NaNO3、0.5g/LK2HPO4、1g/L KH2PO4、0.01g/L CaCl2、0.1g/L KCl、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L酵母粉、0.5mL/L微量元素溶液和1％原油，其中，微量元素溶液包括0.26g/LH3BO3、0.5g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.06g/L MoNa2O4·2H2O和0.7g/L ZnSO4·7H2O)中，30℃、160r/min震荡摇床培养7天，选择表层油污明显减少、下层溶液明显浑浊的实验组，吸取下层溶液接种于相同体积的新的含油液体培养基中，继续按照上述条件培养；重复5次，选择残油量最少的实验组，沾取下层溶液进行平板划线，获得油污降解菌；
(2)将Fe3O4纳米颗粒和葡聚糖分别溶于0.075mol/L柠檬酸钠溶液中，按照Fe3O4纳米颗粒和葡聚糖的质量比为1:2向Fe3O4纳米颗粒-柠檬酸钠溶液中加入葡聚糖-柠檬酸钠溶液，超声震荡30min后，于85℃水浴中搅拌3h，磁分离、用水清洗4次、真空干燥，得到粒径为20nm的羟基化磁性纳米颗粒；
(3)将筛选的油污降解菌培养于LB培养基中28h，离心收集菌体并用生理盐水重悬，重复3次去除培养基成分；
将油污降解菌重悬于100mL生理盐水中，使油污降解菌的浓度为5％，加入4g羟基化磁性纳米颗粒，在28℃、150rpm震荡共孵育10h，在活化培养基(10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl和5g/L酵母提取物，pH7.5)中培养活化，得到所述磁性细胞。
实施例2
本实施例制备具有油污降解功能的磁性细胞，包括以下步骤：
(1)采集天津大港油田的含油淤泥，加入无菌生理盐水浸没淤泥并充分混合，静置待泥沙沉淀后取上清液作为待筛选菌悬液；
将待筛选菌悬液按接种量为2％接种于含油液体培养基(2.5g/L NaNO3、0.5g/LK2HPO4、1g/L KH2PO4、0.01g/L CaCl2、0.1g/L KCl、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L酵母粉、0.5mL/L微量元素溶液和1％原油，其中，微量元素溶液包括0.26g/LH3BO3、0.5g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.06g/L MoNa2O4·2H2O和0.7g/L ZnSO4·7H2O)中，28℃、150r/min震荡摇床培养7天，选择表层油污明显减少、下层溶液明显浑浊的实验组，吸取下层溶液接种于相同体积的新的含油液体培养基中，继续按照上述条件培养；重复6次，选择残油量最少的实验组，沾取下层溶液进行平板划线，获得油污降解菌；
(2)将Fe3O4纳米颗粒配制5mol/L Fe3O4水溶液，超声震荡10min，按照摩尔比为5:1加入柠檬酸，超声震荡30min后，水浴搅拌2h，磁分离、用水清洗4次、真空干燥，得到粒径为20nm的亲水型羧基化磁性纳米颗粒；
(3)将筛选的油污降解菌培养于LB培养基中32h，离心收集菌体并用生理盐水重悬，重复3次去除培养基成分；
将油污降解菌重悬于100mL生理盐水中，使油污降解菌的浓度为10％，加入8g羟基化磁性纳米颗粒，在28℃、150rpm震荡共孵育10h，在活化培养基(10g/L胰蛋白胨、10g/LNaCl和5g/L酵母提取物，pH7.5)中培养活化，得到所述磁性细胞。
实施例3
本实施例制备具有油污降解功能的磁性细胞，包括以下步骤：
(1)采集天津大港油田的含油淤泥，加入无菌生理盐水浸没淤泥并充分混合，静置待泥沙沉淀后取上清液作为待筛选菌悬液；
将待筛选菌悬液按接种量为5％接种于含油液体培养基(2.5g/L NaNO3、0.5g/LK2HPO4、1g/L KH2PO4、0.01g/L CaCl2、0.1g/L KCl、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L酵母粉、0.5mL/L微量元素溶液和1％原油，其中，微量元素溶液包括0.26g/LH3BO3、0.5g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.06g/L MoNa2O4·2H2O和0.7g/L ZnSO4·7H2O)中，28℃、150r/min震荡摇床培养10天，选择表层油污明显减少、下层溶液明显浑浊的实验组，吸取下层溶液接种于相同体积的新的含油液体培养基中，继续按照上述条件培养；重复6次，选择残油量最少的实验组，沾取下层溶液进行平板划线，获得油污降解菌；
(2)将Fe3O4纳米颗粒分散于正己烷中，配制3mol/L Fe3O4正己烷溶液，超声震荡10min，加入3mol/L油酸，超声震荡20min后，于50℃水浴中搅拌2h，磁分离、乙醇清洗、真空干燥，得到粒径为10nm的疏水型羧基化磁性纳米颗粒；
(3)将筛选的油污降解菌培养于LB培养基中24h，离心收集菌体并用生理盐水重悬，重复3次去除培养基成分；
将油污降解菌重悬于100mL生理盐水中，使油污降解菌的浓度为7％，加入8g羟基化磁性纳米颗粒，在25℃、150rpm震荡共孵育15h，在活化培养基(8g/L胰蛋白胨、8g/L NaCl和3g/L酵母提取物，pH7)中培养活化，得到所述磁性细胞。
实施例4
本实施例制备具有油污降解功能的磁性细胞，包括以下步骤：
(1)采集天津大港油田的含油淤泥，加入无菌生理盐水浸没淤泥并充分混合，静置待泥沙沉淀后取上清液作为待筛选菌悬液；
将待筛选菌悬液按接种量为1％接种于含油液体培养基(2.5g/L NaNO3、0.5g/LK2HPO4、1g/L KH2PO4、0.01g/L CaCl2、0.1g/L KCl、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.1g/L酵母粉、0.5mL/L微量元素溶液和1％原油，其中，微量元素溶液包括0.26g/LH3BO3、0.5g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·H2O、0.06g/L MoNa2O4·2H2O和0.7g/L ZnSO4·7H2O)中，32℃、200r/min震荡摇床培养15天，选择表层油污明显减少、下层溶液明显浑浊的实验组，吸取下层溶液接种于相同体积的新的含油液体培养基中，继续按照上述条件培养；重复8次，选择残油量最少的实验组，沾取下层溶液进行平板划线，获得油污降解菌；
(2)将1g Fe3O4纳米颗粒分散于100mL乙醇中，超声震荡10min，加入800mL乙醇和10mL水，继续超声震荡10min，加入10mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，于70℃水浴中继续搅拌6h，磁分离、乙醇清洗、真空干燥，得到粒径为50nm的氨基化磁性纳米颗粒；
(3)将筛选的油污降解菌培养于LB培养基中36h，离心收集菌体并用生理盐水重悬，重复3次去除培养基成分；
将油污降解菌重悬于100mL生理盐水中，使油污降解菌的浓度为5％，加入4g羟基化磁性纳米颗粒，在25℃、100rpm震荡共孵育15h，在活化培养基(12g/L胰蛋白胨、12g/LNaCl和7g/L酵母提取物，pH8)中培养活化，得到所述磁性细胞。
含油污水处理
将实施例1～4制备的磁性细胞置于含油污水中，30℃下暴露5天，处理结束后，使用磁分离装置将磁细胞回收，冷藏保存。
实施例1～4制备的磁性细胞对相同样本的处理结果如表1所示，污水样本中的黑色油污(主要成分为石油烷烃)明显减少。
表1
编号
处理前含油量
油污降解率
实施例1
27.6％
68.3％
实施例2
27.6％
74.8％
实施例3
27.6％
72.4％
实施例4
27.6％
65.5％
综上所述，本方面的磁性细胞为将磁性纳米颗粒吸附于油污降解菌上，分散性好、传质性好、易于磁性回收，油污降解能力强，可以整合于大型磁性载体上，在大规模推广应用方面具有显著优势。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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