一种crispr系统及其在高山被孢霉中的应用
阅读说明：本技术 一种crispr系统及其在高山被孢霉中的应用 (CRISPR system and application thereof in mortierella alpina ) 是由 陈海琴 王顺贤 常璐璐 张灏 陈永泉 陈卫 于 2020-12-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种CRISPR系统及其在高山被孢霉中的应用,属于生物工程技术领域技术领域。本发明采用的核酸酶为毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的LbCpf1,所使用的诱导型启动子为里氏木霉(Trichoderma reesei)中的cbh1,所选靶向基因为尿嘧啶基因ura5,所用的出发菌株为高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型MAU1,本发明提供的基于CRISPR技术的高山被孢霉系统,可实现生物量和产脂含量与野生菌无显著性差异,并可以实现多基因表达,此方法将为构建高工业价值的重组高山被孢霉提供技术手段。(The invention discloses a CRISPR system and application thereof in mortierella alpina, belonging to the technical field of biological engineering. The nuclease adopted by the invention is LbCpf1 of Lachnospiraceae (Lachnospiraceae bacteria), the used inducible promoter is cbh1 in Trichoderma reesei, the selected targeting gene is uracil gene ura5, and the used starting strain is Mortierella alpina uracil auxotroph MAU 1.)
技术领域
本发明涉及一种CRISPR系统及其在高山被孢霉中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
高山被孢霉是一株具有工业价值的高产花生四烯酸的产油丝状真菌。目前，高山被孢霉的产脂途径已基本明晰，其体内的多个产脂相关基因的功能已被成功验证。为进一步构建高产菌株，研究者需要借助多基因表达手段，将已验证功能的产脂关键基因导入到高山被孢霉基因组中。目前，高山被孢霉中进行基因表达局限在两个基因层面。受转化方法及筛选标记的局限，传统的共转化法、多操纵子法等无法应用于高山被孢霉。传统的筛选标记回收法包括Cre/LoxP以及FLP/FRT，这两个系统会出现由于多个识别位点遗留而导致宿主菌正常基因功能缺失或者死亡的问题。如何根据高山被孢霉自身的遗传背景以及现存的技术手段解决多基因表达是后续构建高产菌株首先需要解决的技术难题。
规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)系统是近几年兴起的靶向基因敲除技术。此系统主要包括核酸酶和引导链两部分，其发挥功能的主要原理为靶向引导链引导核酸酶对靶向基因进行DNA双链的切割。此技术自被发明以来，已被广泛应用于多种生物中。借助诱导型启动子，将CRISPR系统设计为靶向敲除筛选标记的筛选标记回收系统，可以在高山被孢霉中实现凭借单个筛选标记进行多基因表达的目的。
CRISPR中应用较多的核酸酶包括Cas9和Cpf1两种。对比Cas9，Cpf1具有一系列优势，例如引导链不需要反式激活的CRISPR RNA(trans-acting CRISPR RNA,tracrRNA)，可以剪切DNA和RNA，Cpf1剪切双链DNA产生粘性末端等。目前，应用比较广泛的Cpf1包括三种，分别来源于氨基酸球菌属Acidaminococcus sp.、毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium(LbCpf1)和弗朗西丝氏菌Francisella novicida，但现有技术中丝状真菌利用CRISPR系统敲除基因的效率相对不高，且没有针对高山被孢霉的CRISPR敲除系统。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为丝状真菌高山被孢霉提供一种基于CRISPR技术的基因敲除方法及多基因表达技术。
本发明的第一个目的是提供一种核酸酶LbCpf1编码基因，其含有SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明的第二个目的是提供含有所述核酸酶LbCpf1编码基因的表达载体。
在一种实施方式中，所述表达载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。
在一种实施方式中，所述诱导型表达载体含有诱导型启动子Pcbh1。
在一种实施方式中，所述诱导型启动子Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供含有所述表达载体，或基因组上整合有SEQ ID NO.1所示核酸酶LbCpf1编码基因的重组微生物细胞。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞以高山被孢霉为宿主。
在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是可用于尿嘧啶靶向敲除的重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1。
本发明的第四个目的是提供一种基于CRISPR技术的丝状真菌系统，该系统含有表达核酸酶LbCpf1的高山被孢霉，和用于产生引导链CrRNA的表达载体。
在一种实施方式中，编码所述核酸酶LbCpf1的序列的3’端加入了核定位序列SV40；编码所述核酸酶LbCpf1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第五个目的是提供一种基因编辑方法，该方法是应用CRISPR技术对所述重组微生物细胞进行基因编辑。
在一种实施方式中，所述基因编辑包括但不限于一个或多个基因的敲除，或表达。
在一种实施方式中，所述基因组编辑方法包括：
(1)构建含有核酸酶LbCpf1和筛选标记的质粒；构建含有启动子、引导链和终止子的引导链质粒；
(2)采用根癌农杆菌将步骤(1)构建的质粒转化至高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株中；
(3)利用筛选标记，从培养物中分离出所述的基因组发生编辑的宿主细胞。
在一种实施方式中，所述筛选标记为ura5基因。
在一种实施方式中，所述方法的具体步骤包括：
(1)构建含有核酸酶LbCpf1和筛选标记的质粒；构建含有启动子、引导链和终止子的引导链质粒；
(2)采用根癌农杆菌将步骤(1)构建的质粒转化至高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株中；
(3)将步骤(2)获得的重组高山被孢霉菌株在含5-氟乳清酸(5-fluroic acid,5-FOA)的筛选培养基中培养。
在一种实施方式中，用于引导链的启动子为SNR52p，终止子为Sup4t。
在一种实施方式中，步骤(1)所用的质粒为高山被孢霉中通用二元载体His550-ITs-TrpCT，其中，载体上的His550启动子替换为诱导型启动子Pcbh1。
在一种实施方式中，步骤(2)所述的根癌农杆菌为根癌农杆菌AGL1。
在一种实施方式中，所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的为高山被孢霉MAU1,该菌株公开于公开号为CN103468581B的专利中。
本发明的第六个目的是提供一种在高山被孢霉中进行多基因表达的方法，将含有外源基因的质粒导入至重组高山被孢霉MA-Pcbh1-LbCpf1中，在重组高山被孢霉MA-Pcbh1-LbCpf1中表达外源基因。
在一种实施方式中，所述外源基因为来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶基因oPpFADS17。
有益效果：本发明在现有的高山被孢霉转化系统的基础上，采用根癌农杆菌介导转化法，构建了基于CRISPR系统的能够进行多基因表达的重组高山被孢霉工程菌株。应用本发明的方法获得的高山被孢霉基因工程菌株，生长和产脂特性与野生型菌株相比无明显差别。
附图说明
图1为二元表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA的构建示意图。
图2为高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；其中M,marker；编号1-6分别为转化二元表达载pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA的高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1。
图3为高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1尿嘧啶(ura5)靶向敲除菌株验证。其中M,marker；编号1-18为经靶向敲除且表型正确的尿嘧啶缺陷菌株MA-Pcbh1-LbCpf-ura5-。
图4为高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1中尿嘧啶ura5基因敲除菌株的测序结果。
图5为基于多基因操作系统的高山被孢霉MA-Pcbh1-LbCpf1-oPpFADS17转化子验证琼脂糖凝胶电泳图。M，Marker；N1，高山被孢霉野生型菌株ATCC 32222；N2，高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-(出发菌株)；编号1-7，基于多基因操作系统的高山被孢霉7个MA-Pcbh1-LbCpf1-oPpFADS17转化子。
具体实施方式
SOC复苏培养基：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖，余量为水。
LB固体培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，余量为水。
MM固体培养基：1.74g/L磷酸氢二钾，1.37g/L磷酸二氢钾，0.1468g/L氯化钠，0.49g/L七水硫酸镁，0.01g/L氯化钙，0.005g/L七水硫酸亚铁，0.53g/L硫酸铵，1.8g/L葡萄糖，0.5wt％甘油，20g/L琼脂，余量为水，pH 6.8。
IM培养基：在MM培养基的基础上将葡萄糖含量降至0.9g/L，并添加200μM乙酰丁香酮所(AS)构成。
SC培养基：20g/L葡萄糖，5g酵母氮源无氨基酸和硫酸铵，1.7g/L硫酸铵，60mg/L异亮氨酸，60mg/L亮氨酸，60mg/L苯丙氨酸，50mgL苏氨酸，40mg/L赖氨酸,30mg/L酪氨酸，20mg/L腺嘌呤，20mg/L精氨酸，20mg/L组氨酸，10mg/L甲硫氨酸，20g/L琼脂，余量为水，pH6.8。
GK固体培养基：20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物，2g/L硝酸钾，1g/L磷酸二氢钠，3g/L七水硫酸镁，20g/L琼脂，余量为水，pH 6.8。
YEP培养基：10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白陈，5g/L氯化钠，余量为水。涉及到固体培养基时添加20g/L琼脂。
实施例1表达载体pBIG2-Pcbh1-LbCpf1的构建
所选用的核酸酶来自毛螺科菌的LbCpf1。在核酸酶序列末端加入SV40核定位序列(CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTCC)，整个片段经过密码子优化后由金斯瑞公司进行生物合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将合成的LbCpf1核酸酶片段经过NheI和XhoI双酶切处理与纯化后，得到高纯度高浓度的基因片段，经过T4连接酶整合入同样经过酶切处理的高山被孢霉中的二元载体pBIG2-ura5-Pcbh1-ITs-TrpCT上获得质粒pBIG2-Pcbh1-LbCpf1。
实施例2高山被孢霉二元表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-ITs-TrpCT的构建
所选诱导型启动子Pcbh1(SEQ ID NO.2所示)来源于里氏木霉，该序列由金斯瑞生物公司合成，并经过XbaI酶切和实验室前期构建的pBIG2-ura5质粒(详见2015年公开的论文《高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力研究》)构建为pBIG2-ura5-Pcbh1-ITs-TrpCT。具体的酶切反应和连接反应如下：
1.1酶切反应：在质粒pBIG2-ura5-ITs基础上，将H550-ITs-TrpCT片段的启动子H550替换为Pcbh1，获得Pcbh1-IT-TrpCT(ITs-TrpCT的构建参见博士论文《高山被孢霉脂肪酸合成过程转录水平调控和还原力研究》)。在37℃条件下，先用限制性内切酶XbaI酶切片段Pcbh1-ITs-TrpCT和载体pBIG2-ura5。100μL XbaI酶切体系为：2μL XbaI-FD，30μL质粒或PCR产物，10μL cutsmart Buffer，58μL去离子水，37℃水浴酶切2h，酶切产物回收后进行纯化操作。
1.2连接反应：用T4连接酶将步骤1.1酶切纯化后的片段Pcbh1-ITs-TrpCT与酶切纯化后的载体pBIG2-ura5连接，4℃连接12h，得到重组表达载体为pBIG2-ura5-Pcbh1-ITs-TrpCT。连接体系为(10μL)：2μL目的基因Pcbh1-ITs-TrpCT酶切后片段，3μL载体pBIG2-ura5酶切后片段，1uL连接酶buffer，1μL T4连接酶，3μL无菌水，4℃连接12h获得连接产物。
将步骤1.2获得的连接产物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，转化方法如下：
(1)无菌状态下取100μL感受态细胞，加入1-2μL步骤1.2获得的连接产物。
(2)将混匀的慼受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡。
(3)将电转柄放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，电转，电压条件为1.8kv。
(4)加入1mL SOC复苏培养基于电转后的感受态细胞中，混匀转移至1.5mL离心管中，37℃，150rpm孵育1小时。
(5)取200μL涂布含有100μg/mL卡那霉素的LB固体培养基平板。倒置37℃培养过夜。
(6)挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-ITs-TrpCT。
实施例3表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA的构建
针对靶向基因ura5对核酸酶LbCpf1进行引导链CrRNA设计，在CasOFFinder中，针对引导链的相关参数设置为：操作微生物为高山被孢霉ATCC 32222：LbCpf1的PAM序列5’-3’TTTN：靶向基因为ura5片段；引导链片段长度23bp。针对ura5基因的核心功能保守区，选定两条能最大程度覆盖其区域且评分较高的引导链。具体信息为：引导链的脱靶评分均62.9，其中LbCpf1对应的CrRNA的覆盖ura5片段的207bp～231bp。CrRNA的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
CRISPR系统的引导链发挥功能需要RNA聚合酶III类(polymerase III,pol III)启动子的引导，而高山被孢霉中未有关于此类启动子功能验证的相关研究。选用片段较小的SNR52p作为启动子，终止子选用与SEQ ID NO.3所示的SNR52p配套使用的Sup4t(Sup4t的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)。由金斯瑞公司合成SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.5顺向连接形成的SNR52p-CrRNA-Sup4t片段。将合成片段序列与载体经过XbaI酶切连接处理(具体的酶切反应和连接反应参照实施例2)，获得最终的二元载体pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA。
实施例4根癌农杆菌AGL1的构建
二元表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA电击转化至根癌农杆菌的感受态细胞中，得到含有质粒pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA的根癌农杆菌AGL1。
实施例5根癌农杆菌介导转化高山被孢霉MAU1
针对根癌农杆菌转化方法进行适当的优化调整，具体如下：
(1)将实施例4构建的保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA的根癌农杆菌AGL1在含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板上划线，28℃倒置避光培养48小时；
(2)挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中，28℃，200rpm避光培养24-48小时；
(3)转移200μL至MM培养基中28℃，200rpm培养24-48小时；
(4)用IM培养基调整菌液浓度至0D600为0.3。置于28℃，200rpm避光培养至OD600到1.0。
(5)用5mL灭菌的生理盐水冲刷在GY-U斜面培养1个月以上的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株MAU1(该菌株公开于公开号为CN103468581B的专利中)，收集孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到107个/mL。
(6)取100μL根癌农杆菌与100μL孢子混合均匀涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基上，23℃避光培养36-48小时。
(7)将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素和100μg/mL头孢噻肟钠的SC筛选培养基(SC-CS培养基)。16℃避光培养12h，随后转移至23℃培养。
(8)持续观察菌落在SC-CS平板上的生长情况，若长出明显菌落，及时用尖头镊子将菌落外沿挑出(大约2mm)，接种于新SC-CS平板，继续正置于28℃培养箱中培养。
(9)待SC-CS平板上的转化子长出后，挑菌丝转接于SC-CS平板，重复筛选3次，排除阴性转化子。
(10)将筛选3次后仍能稳定生长的菌落进行液体培养和活化，之后接种至GY斜面培养基，28℃放置10-14天至菌丝长出后，转移至4℃冷库产孢待用。
取上述保存于GY斜面培养基的疑似转化子，刮取孢子或挑取菌丝接于broth液体活化培养基中于28℃的条件下培养2d，获得菌液；取菌液提取真菌基因组DNA进行PCR验证，使用Taq酶对所获基因组中的LbCpf1片段进行PCR验证，所用引物序列为：
LbCpf1F(sense):AAGCTTGGTACCGCTAGCATG；
LbCpf1R(antisense):GACTCGAGGACCTTGCGCTTC；
重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳分析结果见图2，利用LbCpf1的特异性引物，利用阳性转化子的基因组可扩增出近3737bp的产物条带，电泳结果说明二元表达载体成功整合到高山被孢霉MA-Pcbh1-LbCpf1基因组中。
实施例6高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1的脂肪酸提取与检测
(1)将高山被孢霉野生型菌株与实施例5筛选获得的转入二元表达载体pBIG2-ura5-Pcbh1-LbCpf1-TrpCT-SNR52p-CrRNA T-DNA区的高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1接种于broth培养基中，28℃，200r/min摇床培养7天；
(2)收集菌体，真空冷冻干燥至恒重，称量菌体重量，计算生物量；
(3)将菌体研磨成粉末，称取50mg，加入2mL 4mol/L盐酸，加入100mL 2mg/L的脂肪酸内标(C15:0)；
(4)80℃水浴1h/-80℃放置15分钟进行冻融破壁，重复三次后再次80℃水浴1h；
(5)冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀；
(6)加入1mL氯仿，混匀，震荡10min。6000g离心3min，收集氯仿层至新瓶；
(7)重复(6)两次；
(8)氯仿层氮吹至干燥，加入1mL 10％(w/w)盐酸甲醇，60℃水浴3h，每30min震荡一次，之后室温冷却。
(9)加入1mL饱和氯化钠溶液和1mL正己烷，充分混匀，震荡1min，6000g离心3min，吸取正己烷层，得到脂肪酸甲酯，适当稀释后保存于气相瓶用于后续检测。
(10)脂肪酸甲酯分析采用GC2010(Shimadzu Co.，Japan)，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32m，0.22μm)；氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1uL，分流比10:1，载气为氮气；程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min；通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)和加入内标C15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分，总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。
表1高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1生长与产脂情况分析
注：各类脂肪酸含量(TFA％)为相应脂肪酸含量占总脂肪酸的比值，总脂含量(干重％)为总脂肪酸质量占细胞干重的比值。
表1结果显示各转化子的生物量和脂肪酸含量相比野生型高山被孢霉无显著性差异，表明此二元质粒的导入没有对高山被孢霉的产脂含量和生物量产生不利影响。
实施例7：高山被孢霉重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1尿嘧啶筛选标记(ura5)的靶向诱导敲除
液体诱导培养基为20mL的MM培养基，添加0.1％(w/v)的尿嘧啶和1％(w/v)的微晶纤维素(avicel)，28℃，200rpm诱导7d，收集菌丝，使用分散机打碎，取400μL打碎的菌丝涂布于GYU-F固体筛选培养基。
将筛选得到的转化子进行基因组提取，然后利用引物HisproF1和TrpCT1对其进行PCR验证。所用引物序列为：
HisproF1(sense):GTGTTCACTCGCATCCCGC；
TrpCT1(antisense):AGGCACTCTTTGCTGCTTGG；
在基因组的PCR验证中，PCR核酸凝胶结果(图3)显示共有18个转化子出现大小正确的条带；测序结果显示(图4)，10号和13号转化子的ura5表达单元的序列在靶向位置出现碱基的缺失，在分子层面上证明上述两株菌的ura5基因被成功敲除。
为了筛选用于后续基因导入的尿嘧啶营养缺陷型菌株，对上述表型和基因型均验证正确的10号和13号重组菌进行发酵培养并分析其生长和产脂情况。
脂肪酸分析结果显示(表2)，与野生型菌株和诱导敲除尿嘧啶ura5基因的起始菌株6号转化子MA-Pcbh1-LbCpf1相比，尿嘧啶营养缺陷型重组菌10号和13号的生物量和总脂含量无显著变化。
表2高山被孢霉尿嘧啶缺陷菌株重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-生长与产脂情况
注：各类脂肪酸含量(TFA％)为相应脂肪酸含量占总脂肪酸的比值，总脂含量(干重％)为总脂肪酸质量占细胞干重的比值，出发菌6表示用于进行尿嘧啶诱导敲除的重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1-6，重组菌10号和13号是在出发菌基础上进行尿嘧啶靶向敲除、经基因组验证正确的MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-重组菌。
实施例8高山被孢霉CRISPR系统在表达基因中的应用
以前期已构建的包含有ω-3脂肪酸脱饱和酶基因oPpFADS17的质粒pBIG2-ura5s-oPpFADS17(构建方法记载于公开号为CN105647822B的专利中)为例，该脱饱和酶基因能将高山被孢霉中的花生四烯酸(AA)催化生成二十二碳五烯酸(EPA)，因此oPpFADS17是考察外源基因能否在本发明所述重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-中正确表达并发挥功能的理想报告基因。
采用实施例6和7中的高山被孢霉转化和筛选方法，以实施例7中获得的尿嘧啶筛选标记回收菌株MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-(13号菌株)为受体进行遗传转化。将筛选获得的一批高山被孢霉转化子在SC-CS筛选培养基上连续传代，选取7株可稳定生长的转化子扩大培养并提取基因组DNA，利用通用引物HisproF1/TrpCR1进行PCR验证，凝胶电泳结果如图5所示。基因组验证结果显示，所获得的7株高山被孢霉转化子都能扩增出尿嘧啶表达单元(818bp)和目的片段oPpFADS17(1331bp)，说明这些转化子在基因组水平验证正确，也表明这7株基于CRISPR系统的高山被孢霉重组菌株成功实现了尿嘧啶的回补并成功导入了目的基因oPpFADS17。将所获重组菌株命名为MA-Pcbh1-LbCpf1-oPpFADS17，每个菌株分别给予编号1～7。
为分析外源基因的功能，进一步将上述7株高山被孢霉转化子进行发酵培养并对重组菌生长及脂肪酸组分进行分析，培养及分析方式同实施例6，结果如表3所示。与野生型高山被孢霉相比，MA-Pcbh1-LbCpf1-oPpFADS17重组菌株的2、4、5、6四个转化子中oPpFADS17发挥了功能，能够将AA转化为EPA，转化率分别为21.1％，3.8％，2.2％和44.1％，说明本发明构建的高山被孢霉CRISPR系统能实现功能基因的导入。除可将AA转化为EPA外，各重组菌生物量、脂肪酸含量和脂肪酸组分与出发菌株相比无显著变化，说明在基于CRISPR系统的高山被孢霉工程菌株中再次导入pBIG质粒的同源片段对宿主菌生长和产脂性能无明显影响。
表3高山被孢霉MA-Cpf1-Pcbh1-oPpFADS17转化子生长和产脂水平分析
注：各类脂肪酸含量(TFA％)为相应脂肪酸含量占总脂肪酸的比值，总脂含量(干重％)为总脂肪酸质量占细胞干重的比值，出发菌13表示用于进行尿嘧啶靶向敲除的重组菌MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-(13号)，编号1-7为在出发菌MA-Pcbh1-LbCpf1-ura5-基础上过表达oPpFADS17后所获得的7个转化子。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cgctagcatg tcgaagctgg agaagtttac caactgctac tccctgagca agaccctccg 60
cttcaaggcc atccctgtcg gaaagaccca ggagaacatc gacaacaagc gcctgctcgt 120
cgaggacgag aagagggccg aggattacaa gggcgtcaag aagctgctcg atcgctacta 180
cctgagcttt atcaacgacg tcctccactc gatcaagctg aagaacctca acaactacat 240
ctcgctgttc cgcaagaaga cccgcaccga gaaggagaac aaggagctgg agaacctgga 300
gatcaacctg cgcaaggaga tcgccaaggc cttcaagggc aacgagggat acaagtccct 360
ctttaagaag gacatcatcg agaccatcct gccagagttc ctcgacgata aggacgagat 420
cgccctggtc aactcgttca acggctttac caccgccttc accggattct ttgacaaccg 480
cgagaacatg ttttccgagg aggccaagtc cacctcgatc gccttccgct gcatcaacga 540
gaacctcacc cgctacatca gcaacatgga catcttcgag aaggtcgatg ccatctttga 600
taagcatgag gtccaggaga tcaaggagaa gatcctgaac tcggactacg atgtcgagga 660
tttctttgag ggcgagttct ttaactttgt cctcacccag gagggaatcg acgtctacaa 720
cgccatcatc ggcggattcg tcaccgagag cggcgagaag atcaagggac tgaacgagta 780
catcaacctc tacaaccaga agaccaagca gaagctgcct aagtttaagc cactgtacaa 840
gcaggtcctc tcggatcgcg agagcctctc gttctacggc gagggataca cctccgacga 900
ggaggtcctg gaggtctttc gcaacaccct caacaagaac tcggagatct tctcgtccat 960
caagaagctg gagaagctct tcaagaactt tgacgagtac agctcggccg gcatctttgt 1020
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