一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法
阅读说明：本技术 一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法 (Genetic transformation method taking wild jujube callus as receptor ) 是由 孙俊 马福利 李亚梅 黄锦秋 周军永 陆丽娟 孙其宝 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法,包括遗传转化受体的获取,农杆菌培养与浸染液制备,愈伤浸染,共培养,除菌,抑菌培养,筛选培养,抗性愈伤的鉴定。本发明利用酸枣茎段、叶片、子叶、胚轴诱导的愈伤为受体,建立酸枣遗传转化的方法。愈伤来源广泛,转化效率高,可重复性高,操作步骤简单；借助荧光标记方法辅助筛选,方便快捷；该体系为枣基因功能解析提供了便利,同时也为枣的遗传改良提供了可能。(The invention discloses a genetic transformation method taking wild jujube callus as a receptor, which comprises the steps of obtaining a genetic transformation receptor, preparing agrobacterium culture and a staining solution, staining callus, co-culturing, sterilizing, culturing with bacteriostasis, screening and culturing, and identifying resistant callus. The invention relates to a method for establishing wild jujube genetic transformation by using wild jujube stem segment, leaf, cotyledon and hypocotyl induced callus as a receptor. The callus source is wide, the transformation efficiency is high, the repeatability is high, and the operation steps are simple; the screening is assisted by a fluorescent marking method, so that the method is convenient and quick; the system provides convenience for the function analysis of the jujube gene and provides possibility for the genetic improvement of jujubes.)
技术领域
本发明涉及一种植物细胞工程和分子生物学技术领域，尤其涉及的是一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化方法。
背景技术
枣(ZizipHus jujuba Mill.)为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Zizyhpus.)多年生木本作物，是我国特有的果树。枣品种繁多，枣果营养价值丰富，且具有抗氧化，抑菌消炎安神助眠，滋阴补血等功效，在食品和医药方面有着广泛的应用价值。酸枣(ZizipHus jujubaMill.var.Spinosa)，作为枣的野生种，在我国分布广泛。
随着果树功能基因组学的发展，科研工作者希望能对枣树遗传背景和基因功能信息有进一步的了解，以便更好对枣树品种进行改良。但枣花小，人工去雄困难，坐果率低，胚败育现象严重等使得枣树杂交育种困难，长期进行无性繁殖，导致人们至今对枣树遗传背景和基因功能信息仍知之甚少。枣树全基因组测序已经完成，急需来源广泛的遗传转化受体以及高效的遗传转化体系以解析枣基因组信息和进行基因功能的鉴定。酸枣作为枣的野生种，来源广泛，其愈伤组织为脱分化状态的组织，是良好的遗传转化受体，是解析枣基因组信息和进行功能基因组学研究的优选材料。
有关枣遗传转化，前人虽在不同品种上进行了一些探索，但都集中于转化再生体系的建立，致力于获得遗传转化植株，导致遗传转化受体来源有限，转化效率偏低，这不能满足枣遗传背景和基因功能解析对大量遗传转化受体和高遗传转化效率的需要。Gu,X.F借助农杆菌介导法，以冬枣茎尖为外植体获得了转基因株系(Gu,X.F.,Meng,H.,Qi,G.,&Zhang,J.R.(2008).Agrobacterium-mediated transformation of the winter jujube(ZizypHus jujuba Mill.).Plant Cell,Tissue and Organ Culture,94(1),23–32.)。郝征(郝征.农杆菌介导的枣树遗传转化研究[D].河北农业大学,2012.)和罗在柒(罗在柒,郭辉力,杨亚东,杨明峰,马兰青,王有年.农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化壶瓶枣的研究[J].林业科学,2015,51(10):101-109.)等利用枣叶片为外植体分别获得了枣树抗虫和抗病的转基因株系。魏薇以木枣叶片为外植体，获得了PCR检测为阳性的小麦磷转运蛋白基因的转基因株系(魏薇.枣外源小麦磷转运蛋白基因(TaPT2)遗传转化研究[D].河北农业大学,2013.)。葛宏获得了PCR检测阳性的ZjTCP6和ZjTCP16转基因株系(葛宏.枣种质资源收集保存与ZjTCP6、ZjTCP16基因的遗传转化[D].河南农业大学,2019.)。
上述遗传转化致力于实现枣树某一品种的遗传定向改良，因而遗传转化效率低，这显然不适合基因功能解析对大量遗传转化受体及高遗传转化效率的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：如何实现量产化的枣遗传转化，提供了一种以酸枣愈伤组织为受体的遗传转化及可视化快速鉴定方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明包括以下步骤：
(1)遗传转化受体的获取
播种酸枣无菌种子，待无菌苗长出真叶，选取酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴，分别切成0.5～1cm和0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基，诱导酸枣愈伤，作为遗传转化材料；
(2)农杆菌培养与浸染液制备
将携带有表达载体pCAMBIA2300的农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，直至OD600为0.6～0.8；
将所述OD600为0.6～0.8的农杆菌菌液用液体MS重悬，得到浸染液，此前已经于超净台向液体MS中加入200μmol/L的乙酰丁香酮；
(3)愈伤浸染：
将步骤(2)所得的浸染液与愈伤组织于恒温摇床以28℃、100～150rpm的条件黑暗共培养30～35min，得到浸染后的外植体；
(4)共培养：
将步骤(3)所得浸染后的外植体沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天；
(5)除菌：
用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗步骤(4)所得的酸枣愈伤7～8min，重复3～4次；
(6)抑菌培养：
将步骤(5)得到的酸枣愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天；
(7)筛选培养：
将步骤(6)所得的抑菌培养后的酸枣愈伤置于半固体MS筛选培养基，经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的酸枣抗性愈伤；
(8)抗性愈伤的鉴定：
借助荧光标记筛选同时利用RT-PCR方法对酸枣抗性愈伤进行检测，根据是否有目的基因的条带，确定目的基因的整合和表达状况。
所述半固体MS愈伤诱导培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0。
所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。
所述步骤(2)中，农杆菌为GV3101，其携带的质粒载体为pCAMBIA2300绿色荧光表达载体。
所述半固体MS共培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0。
所述半固体MS抑菌培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，250mg/L头孢霉素，250mg/L特美汀，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0。
所述半固体MS筛选培养基包括0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸，0.4mg/L噻苯隆，20mg/L卡那霉素，250mg/L头孢霉素，250mg/L特美汀，20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0。
所述步骤(1)、(4)、(6)、(7)的培养条件为温度23～25℃，光周期12～14h/d，光照强度2500～2800lx。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明利用酸枣茎段、叶片、子叶和胚轴诱导的愈伤组织为受体，建立酸枣遗传转化的方法。愈伤来源广泛，转化频率较高，可重复性高，操作步骤简单；同时借助荧光标记辅助筛选，方便快捷。该体系为枣基因功能解析提供了便利，同时也为枣的遗传改良提供了可能。
附图说明
图1是酸枣不同部位愈伤组织诱导状况的比较；
图2是pCAMBIA2300质粒图谱；
图3是酸枣茎段愈伤遗传转化步骤图；
图4是酸枣叶片愈伤遗传转化步骤图；
图5是酸枣子叶愈伤遗传转化步骤图；
图6是酸枣胚轴愈伤遗传转化步骤图；
图7是酸枣不同组织器官转基因愈伤遗传转化率的比较；
图8是酸枣不同组织部位的抗性愈伤RT-PCR检测图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例为酸枣茎段愈伤组织的遗传转化。
遗传转化受体的诱导：
本实施例选用市售的酸枣种子，将酸枣种子75％乙醇浸泡30s、无菌水处理2min；5％NaClO浸泡7min，无菌水处理2min，重复三次，置于半固体MS培养基。待30d后，无菌苗长出真叶，剪取长势良好的酸枣茎段，分别切成0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基(如图1中的C所示)。将外植体置于黑暗环境，温度23～25℃的条件下培养，30天后即可诱导出酸枣茎段愈伤(如图1中的G所示)；经1～2代，每代3～4周的继代后，得到长势良好的酸枣茎段愈伤，即为遗传转化材料(如图3中的D所示)。
所述半固体MS愈伤诱导培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。半固体MS培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO338g/L，NH4NO333g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L)；母液II(KH2PO43.4g/L)；母液III(CaCl2 6.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO36.2g/L，KI0.83g/L，Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB30.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB10.02g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
上述半固体MS愈伤诱导及半固体MS共培养基是指：添加了0.5～2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS抑菌培养基是指：添加了0.5～2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、250mg/L头孢噻肟钠和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS筛选培养基是指：添加了0.5～2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
农杆菌培养与浸染液制备：
将携带有表达载体pCAMBIA2300的农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，使OD600值为0.6～0.8。之后于离心机以28℃、5000rpm的转速离心菌液5min，即可得到沉淀后的菌体，再用同等体积的液体MS重悬菌体，得到浸染液，此前已经于超净台向液体MS中加入200μM乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0)含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。
在本实施例中，所述农杆菌为根癌农杆菌GV3101，购自上海唯地生物技术技术有限公司。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300，其质粒图谱如图2所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因。
愈伤浸染、共培养与脱菌：
将所述浸染液与酸枣茎段愈伤组织于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣茎段愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣茎段愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，所述半固体MS共培养基是指含0.5-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
将上述所得共培养后的酸枣茎段愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
抑菌及筛选培养：
将上述所得酸枣茎段愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天。抑菌30d，待荧光信号稳定后，统计转基因酸枣茎段愈伤的遗传转化率。遗传转化率的统计方法为：于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，可检测绿色荧光蛋白(GFP)，发出绿色荧光的为转基因酸枣茎段愈伤(如图3，F所示)。于双荧光蛋白观测灯的观测下，统计发出绿色荧光酸枣茎段愈伤块数的比率，即为遗传转化率。
所述半固体MS抑菌培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯购自上海路阳仪器有限公司。
为了研究不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率的差异，图7统计了不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率；其中，共浸染酸枣茎段愈伤42块，发绿色荧光的转基因酸枣茎段愈伤为10块，占23.8％，即转基因酸枣茎段愈伤的遗传转化率为23.8％(如图7所示)。
将上述所得抑菌培养后的酸枣茎段愈伤置于半固体MS筛选培养基，继代酸枣茎段愈伤时要以尽可能小的体积将每一块酸枣茎段愈伤转接至新的培养基，这样历经第一次筛选培养后独立的酸枣茎段愈伤块称做一个株系。所述半固体MS筛选培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述酸枣茎段愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的酸枣茎段抗性愈伤。
酸枣茎段抗性愈伤RT-PCR检测：
利用RT-PCR方法检测了酸枣茎段抗性愈伤报告基因的表达状况；首先采集连续筛选3～5代至纯合的酸枣茎段抗性愈伤，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到酸枣茎段抗性愈伤的cDNA；以2300-GFP-F：CCGGGGTGGTGCCCATC，2300-GFP-R：CTCCAGCTTGTGCCCCAGG为引物，酸枣茎段抗性愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括：ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35个循环；72℃终延伸10min，8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。以质粒DNA为阳性对照，未转化的酸枣愈伤为阴性对照；根据是否有报告基因GFP条带(400bp)，确定目的基因的整合状况。
上述RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant PlusKit(polysaccharides&PolypHenolics-rich)购自于天根生化科技(北京)有限公司。DNAMaker(DL2000)、6×loading buffer、反转录试剂盒HifairTMⅡ1st Strand cDNASynthesis Kit(gDNA digester)购买于上海翊圣生物科技有限公司。
图8为经RT-PCR检测的酸枣茎段抗性愈伤2个不同株系的电泳图，均检测出与阳性对照一致的目标条带(如图8，泳道1、3所示)，表明报告基因已整合到转基因酸枣茎段愈伤的基因组中。
实施例2
本实施例为酸枣叶片愈伤组织的遗传转化
遗传转化受体的获取：
酸枣种子用75％乙醇浸泡30s、无菌水处理2min；5％NaClO浸泡7min，无菌水处理2min，重复3次，置于半固体MS培养基。待30d后，无菌苗长出真叶，剪取长势良好的酸枣叶片，分别切成0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基(如图1，D所示)。将酸枣叶片置于黑暗环境，温度23～25℃的条件下培养，30天后即可诱导出酸枣叶片愈伤(如图1，H所示)；酸枣叶片愈伤经1～2代，每代3～4周的继代后，得到长势良好的酸枣叶片愈伤，即为遗传转化材料(如图4，D)所示。
所述半固体MS愈伤诱导培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。半固体MS培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO338g/L，NH4NO333g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L)；母液II(KH2PO43.4g/L)；母液III(CaCl26.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO36.2g/L，KI0.83g/L，Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB30.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB10.02g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
上述半固体MS愈伤诱导培养基及半固体MS共培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS筛选培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素、250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
农杆菌培养与浸染液制备：
将携带有表达载体pCAMBIA2300的农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，使OD600为0.6～0.8；之后于离心机以28℃、5000rpm的转速离心菌液5min，即可得到沉淀后的菌体，再用同等体积的液体MS重悬菌体，得到浸染液，此前已经于超净台向液体MS中加入200μM的乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0)含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。
在本实施例中，所述农杆菌为根癌农杆菌GV3101，购自上海唯地生物技术技术有限公司。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300，其质粒图谱如图2所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因。
愈伤浸染、共培养与脱菌
将所述浸染液与酸枣叶片愈伤于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣叶片愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣叶片愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，半固体MS共培养基是指含0.5～2mg/L2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
将上述所得共培养后的酸枣叶片愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
抑菌及筛选培养
将上述所得酸枣叶片愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天。待浸染30d，荧光信号稳定后，统计转基因酸枣叶片愈伤的遗传转化率。遗传转化率的统计方法为：于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，可检测绿色荧光蛋白(GFP)，发出绿色荧光的为转基因酸枣叶片愈伤(如图4，F所示)。于双荧光蛋白观测灯的观测下，统计发出绿色荧光酸枣叶片愈伤块数的比率，即为遗传转化率。
所述半固体MS抑菌培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯购自上海路阳仪器有限公司。
为了研究不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率的差异，图7统计了不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率；其中，共浸染酸枣叶片愈伤66块，发绿色荧光的转基因酸枣叶片愈伤为21块，占31.8％(如图7所示)，即转基因酸枣叶片愈伤的遗传转化率为31.8％。
将上述所得的抑菌培养的酸枣叶片愈伤置于半固体MS筛选培养基，继代酸枣叶片愈伤时要以尽可能小的体积将每一块酸枣叶片愈伤转接至新的培养基，这样的历经第一次筛选培养后独立的酸枣叶片愈伤块称做一个株系。所述半固体MS筛选培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；上述酸枣叶片愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的酸枣叶片抗性愈伤。
酸枣叶片抗性愈伤的RT-PCR检测
利用RT-PCR方法检测了酸枣叶片抗性愈伤报告基因的表达状况；首先采集经抗性筛选3～5代至纯合的酸枣叶片抗性愈伤，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到酸枣叶片抗性愈伤的cDNA；以2300-GFP-F：CCGGGGTGGTGCCCATC，2300-GFP-R：CTCCAGCTTGTGCCCCAGG为引物，酸枣叶片抗性愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括：ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃终延伸10min，8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。以质粒DNA为阳性对照，未转化的酸枣愈伤为阴性对照，根据是否有报告基因GFP的条带(400bp)，确定报告基因的整合状况。
上述RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant PlusKit(polysaccharides&PolypHenolics-rich)购自于天根生化科技(北京)有限公司。DNAMaker(DL2000)、6×loading buffer、反转录试剂盒HifairTMⅡ1st Strand cDNASynthesis Kit(gDNA digester)购买于上海翊圣生物科技有限公司。
图8为经RT-PCR检测的酸枣叶片抗性愈伤3个不同株系的电泳图，均检测出与阳性对照一致的目标条带(如图8中泳道4、5、6所示)，证明了报告基因已整合到转基因酸枣叶片愈伤的基因组中。
实施例3
本实施例为酸枣子叶愈伤组织的遗传转化
遗传转化受体的获取：
酸枣种子用75％乙醇浸泡30s、无菌水处理2min，5％NaClO浸泡7min，无菌水处理2min，重复三次，置于半固体MS培养基。待30d后，无菌苗长出真叶，剪取长势良好的酸枣子叶，分别切成0.5～1cm×0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基(如图1，E所示)。将外植体置于黑暗环境，温度23～25℃的条件下培养，30天后即可诱导出酸枣子叶愈伤(如图1，I所示)；经1～2代，每代3～4周的继代后，得到长势良好的酸枣子叶愈伤，即为遗传转化材料(如图5，D所示)。
所述半固体MS愈伤诱导培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。MS基本培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO338g/L，NH4NO333g/L，MgSO4·7H2O7.4g/L)；母液II(KH2PO43.4g/L)；母液III(CaCl26.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO3 6.2g/L，KI0.83g/L，Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB30.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB10.02g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
上述半固体MS愈伤诱导及半固体MS共培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS抑菌培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS筛选培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
农杆菌培养与浸染液制备：
将携带有表达载体pCAMBIA2300的农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，使OD600为0.6～0.8，之后于离心机以28℃、5000rpm的转速离心菌液5min，即可得到沉淀后的菌体，再用同等体积的液体MS重悬菌体，得到浸染液，此前已经向液体MS中加入200μM的乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0)含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。
在本实施例中，所述农杆菌为根癌农杆菌GV3101，购自上海唯地生物技术技术有限公司。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300，其质粒图谱如图2所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因。
愈伤浸染、共培养与脱菌
将所述浸染液与酸枣子叶愈伤组织于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣子叶愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣子叶愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，半固体MS共培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
将上述所得的酸枣子叶愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
抑菌及筛选培养
将上述所得酸枣子叶愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天。待浸染30d，荧光信号稳定后，统计转基因酸枣子叶愈伤的遗传转化率。遗传转化率的统计方法为：于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，可检测绿色荧光蛋白(GFP)，发出绿色荧光的为酸枣子叶阳性愈伤(如图5，F所示)。于双荧光蛋白观测灯的观测下，统计发出绿色荧光酸子叶愈伤块数的比率，即为遗传转化率。
所述半固体MS抑菌培养基培养是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯购自上海路阳仪器有限公司。
为了研究不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率的差异，图7统计了不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率；其中，共浸染酸枣子叶愈伤129块，发绿色荧光的转基因酸枣子叶愈伤为33块，占25.6％，即转基因酸枣子叶愈伤的遗传转化率为25.6％(如图7所示)。
将上述所得抑菌培养后的酸枣子叶愈伤置于半固体MS筛选培养基，继代酸枣子叶愈伤时要以尽可能小的体积将每一块酸枣子叶愈伤转接至新的培养基，这样历经第一次筛选培养后独立的酸枣子叶愈伤块称做一个株系。所述半固体MS筛选培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述酸枣子叶愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的酸枣子叶抗性愈伤。
酸枣子叶抗性愈伤的RT-PCR检测
利用RT-PCR方法检测了酸枣子叶抗性愈伤报告基因的表达状况；首先采集筛选继代3～5代至纯合的酸枣子叶抗性愈伤，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到酸枣子叶抗性愈伤的cDNA；以2300-GFP-F：CCGGGGTGGTGCCCATC，2300-GFP-R：CTCCAGCTTGTGCCCCAGG为引物，酸枣子叶抗性愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括：ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸10min，8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。以质粒DNA为阳性对照，未转化的酸枣愈伤为阴性对照；根据是否有报告基因GFP的条带(400bp)，确定报告基因的整合状况。
上述RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant PlusKit(polysaccharides&PolypHenolics-rich)购自于天根生化科技(北京)有限公司。DNAMaker(DL2000)、6×loading buffer、反转录试剂盒HifairTMⅡ1st Strand cDNASynthesis Kit(gDNA digester)购买于上海翊圣生物科技有限公司。
图8为经RT-PCR检测的酸枣子叶抗性愈伤3个不同株系的电泳图，均检测出与阳性对照一致的目标条带(如图8，泳道7、8、9所示)，证明报告基因已整合到转基因酸枣子叶愈伤的基因组中。
实施例4
本实施例为酸枣胚轴愈伤组织的遗传转化
遗传转化受体的获取：
酸枣种子用75％乙醇浸泡30s、无菌水处理2min；5％NaClO浸泡7min，无菌水2min，重复三次，置于半固体MS培养基。待30d后，无菌苗长出真叶，剪取长势良好的酸枣胚轴，分别切成0.5～1cm大小的外植体，置于半固体MS愈伤诱导培养基(如图1，F)，将外植体置于黑暗环境，温度23～25℃的条件下培养，30天后即可诱导出酸枣胚轴愈伤(图1，J)，经1～2代，每代3～4周的继代后，得到长势良好的酸枣胚轴愈伤，即为遗传转化材料(图6，D)。
所述半固体MS愈伤诱导培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素等活性成分过滤灭菌，在培养基灭菌后加入。半固体MS培养基配方如下所示：
(1)大量元素20×，包括母液I(KNO338g/L，NH4NO333g/L，MgSO4·7H2O 7.4g/L)；母液II(KH2PO43.4g/L)；母液III(CaCl2 6.64g/L)。
(2)微量1000×(MnSO4·H2O16.9g/L，ZnSO4·7H2O 8.6g/L，H3BO36.2g/L，KI0.83g/L，Na2MoO4·2H2O 0.25g/L，CuSO4·5H2O 0.025g/L，CoCl2·6H2O 0.025g/L)。
(3)铁盐200×(乙二胺四乙酸二钠7.46g/L，FeSO4·7H2O 5.56g/L)。
(4)有机元素200×(肌醇20g/L，甘氨酸0.4g/L，烟酸VB3 0.1g/L，盐酸吡哆醇VB60.1g/L，盐酸硫胺素VB10.02 g/L)。
(5)上述半固体MS培养基还包括20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH值5.8～6.0。
上述半固体MS愈伤诱导培养基及半固体MS共培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS抑菌培养基是指：添加了0.5～2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
上述半固体MS筛选培养基是指：添加了0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆、20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
农杆菌培养与浸染液制备：
将携带有表达载体pCAMBIA2300的农杆菌菌液GV3101接种于液体LB培养基，于恒温摇床以28℃、200～250rpm的条件暗培养菌液，使OD600为0.6～0.8，之后于离心机以28℃、5000rpm的转速离心菌液5min，即可得到沉淀后的菌体，再用同等体积的液体MS重悬菌体，得到浸染液；此前已经向液体MS中加入200μM乙酰丁香酮。所述农杆菌菌液GV3101的接种量为0.25～0.5％；所述液体LB(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0)含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平。
在本实施例中，使用的农杆菌为根癌农杆菌GV3101，购自上海唯地生物技术技术有限公司。
所述农杆菌GV3101携带的表达载体为pCAMBIA2300，其质粒图谱如图2所示。所述表达载体以卡那霉素抗性kanamycin resistance基因作为筛选标记基因，携带GFP绿色荧光报告基因。
愈伤浸染、共培养与脱菌
将所述浸染液与酸枣胚轴愈伤于恒温摇床以28℃、120rpm的条件黑暗共培养30min，得到浸染后的酸枣胚轴愈伤。
将上述所得浸染后的酸枣胚轴愈伤沥干后置于半固体MS共培养基，黑暗条件下共培养2～3天，半固体MS共培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基。
将上述所得的酸枣胚轴愈伤用含有250mg/L头孢噻肟钠的无菌水清洗7～8min，重复3～4次。
抑菌以及筛选培养
将上述所得酸枣胚轴愈伤置于半固体MS抑菌培养基，抑菌培养30～45天。待浸染30d，荧光信号稳定后，统计转基因酸枣胚轴愈伤的遗传转化率。于LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯下，用黄色滤光镜观测，可检测绿色荧光蛋白(GFP)，发出绿色荧光的为转基因酸枣胚轴愈伤(如图6，F所示)。遗传转化率的统计方法为：于双荧光蛋白观测灯的观测下，统计发出绿色荧光酸枣胚轴愈伤块数的比率。
所述半固体MS抑菌培养基培养是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH5.8～6.0的半固体MS培养基；所述LUYOR-3415RG Hand-Held Lamp双荧光蛋白观测灯购自上海路阳仪器有限公司。
为了研究不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率的差异，图7统计了不同组织器官的转基因酸枣愈伤遗传转化率；其中，共浸染49块酸枣胚轴愈伤，发绿色荧光的酸枣胚轴愈伤为12块，占24.5％，即转基因酸枣胚轴愈伤的遗传转化率为24.5％(如图7所示)。
将上述所得抑菌培养后的酸枣胚轴愈伤置于半固体MS筛选培养基，继代酸枣胚轴愈伤时要以尽可能小的块数将每一块酸枣胚轴愈伤转接至新的培养基，这样的历经第一次筛选培养后独立的酸枣胚轴愈伤块称做一个株系。所述半固体MS筛选培养基是指含0.5～2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸和0.4mg/L噻苯隆以及20mg/L卡那霉素、250mg/L头孢霉素和250mg/L特美汀以及20～30g/L蔗糖，6～7g/L琼脂，pH为5.8～6.0的半固体MS培养基；所述酸枣胚轴愈伤经3～5代、每代3～4周的筛选培养后，得到纯合的酸枣胚轴抗性愈伤。
酸枣胚轴抗性愈伤的RT-PCR检测
利用RT-PCR方法检测了酸枣胚轴抗性愈伤报告基因的表达状况；首先采集连续筛选3～5代至纯合的酸枣胚轴抗性愈伤，液氮研磨后提取RNA，经反转录后得到酸枣胚轴抗性愈伤的cDNA；以2300-GFP-F：CCGGGGTGGTGCCCATC，2300-GFP-R：CTCCAGCTTGTGCCCCAGG为引物，酸枣胚轴抗性愈伤的cDNA为模板，进行PCR扩增反应。2×Fast Taq PCR体系为25μL，具体包括：ddH2O 10μL，2×Fast Taq 12μL，Primer R 1μL，Primer L 1μL，模板1μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35个循环；72℃终延伸10min，8℃终止反应，4℃保存；扩增产物在1％琼脂糖/Gel Red胶上进行检测。以质粒DNA为阳性对照，未转化的酸枣愈伤为阴性对照；根据是否有报告基因GFP的条带(400bp)，确定报告基因的整合状况。
上述RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant PlusKit(polysaccharides&PolypHenolics-rich)购自于天根生化科技(北京)有限公司。DNAMaker(DL2000)、6×loading buffer、反转录试剂盒HifairTMⅡ1st Strand cDNASynthesis Kit(gDNA digester)购买于上海翊圣生物科技有限公司。
图8为经RT-PCR检测的酸枣胚轴抗性愈伤3个不同株系的电泳图，均检测出与阳性对照一致的目标条带(如图8，泳道10、11、12所示)，证明了报告基因已整合到转基因酸枣胚轴愈伤的基因组中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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