具体实施方式

本发明提供了一种D117L、F317L和EP364R共表达的基因，所述基因是将EGFP基因、第一连接基因、D117L基因、第二连接基因、F317L基因、第二连接基因和EP364R基因顺次串联得到；所述D117L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：atggacactgaaacgtctccactgctttctcataacctgtcaacccgcgagggaattaaacaaagcacccaaggccttttagcccatacaatcgccaaatatcccggaacaactgcgattctcctgggcattttgattttgctcattattattcttatcatcgttgccatcgtttactataaccggactattgactgcaagtcgagcatacctaaacctcctcctagctactatgtacaacaacctgagcctcaccaccatttcccggtattctttagaaaaaggaaaaactccacctccctgcagtcccacattccaagcgacgaacaattagctgaacttgcgcattcataa；所述F317L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：atggttgagacacaaatggacaaacttggttttctgctaaatcacataggtaaacaggttaccactaaggtgcttagcaatgcccatataactcaaacgatgaaggagattattttggaaaatcatagtgtagatggtggagccgcaaaaaatgtttcaaaagggaagtcttccccaaaagaaaaaaaacattggactgagttcgaatcctgggaacagctcagcaagtctaaaagaagttttaaggaatactgggcggagcgtaatgagattgtgaatactctgttgcttaactgggacaatgttcggggtgccatcaaaaaatttttggacgatgaccgtgaatggtgcggccgcattaatatgataaacggtgtacccgagatagtggaaatcattccaagcccctatagggcaggagagaacatttattttggcagcgaggctatgatgcctgctgatatttatagcagggtggccaacaagcctgctatgtttgtgtttcacacgcatcctaatttgggttcatgttgtggaggaatgccttccatatgtgacatttctacaacgctgcgttatctactcatggggtggactgctgggcatctaatcatttcttcgaatcaagtaggaatgctcacggttgataagagaattattgttgatttgtgggccaatgagaatccgcgctggcttatggcgcaaaaaatattagatatttttatgatgctcacttcgcgtagaagcctggtaaatccctggaccctgagagacctaaaaaaaatattacaagactatggtattgagtatatcatttttccttcgaatgacttttttatttatgaagacgaacgtcttttaatgttttcaaaaaaatggaccaacttttttacgttacatgagttattggatgacctcgaaactattgagacaaaggcatcgtccacaacatag；所述EP364R基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：atgtattttctagtagcagatcatcgagaacatcatgtgattccttttcttaaaaccgatttccatcacatgcatcaaaatcctatacaaaaaaatcaagctctcctagaaatcaaacagctttttactggagattatctcatctgcaaaagcccttctaccattctggcctgtattgaacgaaaaacctacaaagactttgcggcttctttgaaagatggacgttataaaaatcgccaaaaaatgctgtcgctgcgagaacaaaccaactgtcaactttatttttttgtagaaggcccggcatttcctaaccctcaaaaaaaaattaatcacgttgcctatgcaagcattattactgctatgacgcatcttatggttagagatcatatttttgtcattcaaacgaaaaatgaggcccacagttcccaaaagcttgtgcagcttttttatgccttttctaaggaaatggtgtgcgtcgttcccacctccctcacccccacggatgaagagctatgcatcaagctatggtcttctctttctggtatttcaggcgtgataggtaaaatcttggcaaacacttgttccgtagctcatttggttcatggaaagctttcatcgcagaatattgatcagttaaaaactccctccaaccgaccattccccaaaaaagtaaaacgtatgcttataagcattagcaaaggaaataaggagttagaaataaaattgctctcgggggttcccaatatcgggaaaaaattagctgccgaaattttaaaagatcatgcgcttcttttttttctaaatcagcccgtagaatgcttggcaaatatacaaatcgttcaaaaaacccgtacgattaagttgggaatgaagcgagccgaagcgattcattattttttaaactggtgtggctctgcccatgtaaccgatgatagccaaaatatcacagaggcgtcgcggtccacaatgcaggtcgcgacgcagtccgccgcaatacagcccgctgcaacgcagccattgcacgaagtatcagatgatgcatcatcagatgcttcatcacccgtagggtatcaaacattatctaaagaaatgttattgaacacagcctga；所述第一连接基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，具体为AGTACTGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTCGAC；所述第二连接基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：12所示，具体为：GGCGCCCCC。

在本发明中，所述D117L基因、F317L基因和EP364R基因通过人工合成获得，本发明对所述人工合成的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

本发明还提供了一种含有上述方案所述基因的重组载体，所述重组载体以pShuttle-CMV载体为原始载体；所述基因的插入位点为KpnI和HindIII之间。图1为本发明重组质粒的图谱。

在本发明中，所述重组载体的构建方法优选的包括以下步骤：

人工合成所述基因，将所述基因和pShuttle-CMV载体的线性化质粒进行同源重组，得到重组载体。本发明对所述同源重组的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

本发明还提供了一种重组腺病毒载体，插入有上述方案所述重组载体，插入位点为PmeI酶切位点序列的第一位点和第二位点之间；所述第一位点的核苷酸序列如SEQ IDNO：13所示，具体为：GGTTT；所述第二位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，具体为：AAACC。图2为本发明重组腺病毒载体的图谱。

本发明还提供了上述方案所述重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

使用限制性内切酶PmeI对上述方案所述重组载体进行酶切，得到线性化质粒，将所述线性化质粒转化入含pAdEasy-1质粒的大肠杆菌中，经过重组获得重组腺病毒载体；所述大肠杆菌包括BJ5183大肠杆菌。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组腺病毒载体或者所述构建方法得到重组腺病毒载体的重组腺病毒。

本发明还提供了上述方案所述重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：将所述重组腺病毒载体经过PacI酶切线性化，得到线性化质粒，采用所述线性化质粒转染HEK293A细胞进行培养，获得重组腺病毒。

本发明还提供了上述方案所述重组腺病毒在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

本发明还提供了一种非洲猪瘟疫苗，包含上述方案所述重组腺病毒。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

实施例1

1)查询NCBI网站收录的D117L基因(GI:41902877)、F317L基因(GI:41902813)与EP364R基因(G:41902829)通过人工合成，获取优化后连接的基因片段。

1.片段的修饰及扩增

1)引物设计

2)EGFP、EGFP-P2A-D117L-F317L-EP316R-HA片段PCR

EGFP：EGFP-F(KpnI)+EGFP-R(+P2A)

D117L-F317L-EP316R：117-317-364-F+117-317-364-R(模板为PUC57-117-317-364)

EGFP-P2A-D117L-F317L-EP316R-HA：EGFP-F(KpnI)+HA-R(HindIII)

PCR反应体系如下：

PCR反应条件如下：

PCR反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收产物。

2.pShuttle-CMV载体酶切及同源重组

1)将pShuttle-CMV载体进行酶切，酶切体系如下

加样混匀后置于37℃酶切6h，反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收线性化质粒。

2)载体与片段同源重组：

37℃反应35min，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，卡纳霉素抗性LB平板筛选，挑取单克隆PCR鉴定，阳性菌落扩增提取质粒酶切鉴定，阳性质粒测序鉴定；

测序引物为SEQ ID NO.9：CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；

SEQ ID NO.10：SV40-R GAAATTTGTGATGCTATTGC。

测序正确质粒即为pShuttle-CMV-EGFP-P2A-D117L-F317L-EP316R-HA，可用于后续实验。

3.293T细胞瞬时表达及其验证

1)293T细胞转染

细胞准备：将1×10⁶个293T细胞均匀铺在6孔板的每孔中，第二天待细胞贴壁后用于细胞转染；

质粒准备：将2.5μg质粒与7.5μL Lipofectamine 3000脂质体分别和500μL无血清DMEM培养基混匀，静置4min，将质粒混合液与Lipofectamine 3000混合液混匀，静置10min；

将混合液逐滴加入到培养基中，轻轻摇匀，37℃培养。

24h后收集细胞。

2)WB检测蛋白表达

蛋白提取：PBS清洗2次，加入250μl细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂及蛋白磷酸酶抑制剂)，消化吹落细胞，震荡混匀，冰浴25min，12000rpm离心15min，吸取60μl上清并加入20μl 4×SDS Buffer，煮沸5min；

蛋白PAGE凝胶电泳：每孔加入10μl蛋白样品，电泳，转膜，封闭；

HA标签抗体检测：HA一抗4℃孵育过夜，TBST清洗，兔源二抗室温孵育1h，TBST清洗，显影液显色。

4.pAD-Shuttle-CMV-EGFP-P2A-D117L-F317L-EP316R-HA腺病毒载体重组

1)pShuttle-CMV-EGFP-P2A-D117L-F317L-EP316R-HA质粒PmeI酶切线性化，凝胶回收；

2)线性化载体转化入含pAdEasy-1质粒的BJ5183大肠杆菌，卡那抗性平板筛选，菌落PCR鉴定，阳性菌落扩增，提取质粒。

3)PacI酶切验证，并使用乙醇沉淀回收酶切片段，用于转染细胞包装腺病毒。鉴定结果参见图3。从图3可以看出，M为TaKaRa的1kb DNA ladder，1和2泳道分别为PacI、BamHI酶切后的产物电泳结果。从图3中可见，PacI酶切可得到约4.5kb和一条较大的条带，推测约为34kb；用BamHI酶切可得到两条比较接近的条带，其中1个条带在10kb上约为11.7kb，另一条带略大，推测为27kb大小。由此证明重组腺病毒质粒构建正确。

5.腺病毒包装

1)293A胞铺板：将2×10⁵个293A细胞均匀铺与12孔板中，汇合度达到30％用于转染；

2)质粒准备：将1.5μg线性化质粒与4μL Lipofectamine 3000脂质体分别和250μL无血清DMEM培养基混匀，静置4min，将质粒混合液与Lipofectamine 3000混合液混匀，静置10min；将混合液逐滴加入到培养基中，轻轻摇匀，37℃培养。

3)48h观察细胞状态，5d后细胞有较多死亡，注意补液，收集细胞与上清，-80℃冻融2次，震荡释放腺病毒，离心去沉淀；

4)将腺病毒上清与10％培养基1:1混匀，接种于6cm dish中，观察细胞状态，待细胞大部分死亡后收毒；

5)重复感染接种于T75培养瓶，再接种于T175培养瓶中，收毒；

6)浓缩纯化腺病毒。

6.腺病毒表达验证

1)细胞准备：将5×10⁵个HEK293A均匀的铺在12孔板中，汇合度达到80％用于转染；

2)取100μL未纯化的病毒上清感染HEK293A细胞，72h观察细胞病变(CPE)状况，48h观察细胞绿色荧光蛋白表达状态，结果参见图5和图6。通过普通光学显微镜观察可见接种未纯化腺病毒上清的HEK293A细胞明显变圆，脱落(图5)；而通过荧光显微镜观察可见明显的绿色荧光表达(图6)。

3)WB标签蛋白检测。将HA抗体、GFP抗体和GAPDH抗体按最适比例混合，用于Western-Blot检测，检测结果参见图4。M为蛋白Marker(Thermo Fisher#26616)，1号泳道为腺病毒感染的细胞总蛋白，2号泳道为对照细胞总蛋白。1号泳道可见29kD左右条带，为GFP-P2A标签蛋白；100kD上下多个条带为EGFP-P2A-D117L-F317L-EP364R-HA、D117L-F317L-EP364R-HA融合蛋白及可能的翻译后修饰条带；而在2号泳道中没有检测到上述位置的条带，仅在35kD附近能检测到与1号泳道相似的条带为GAPDH内参。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 扬州大学

<120> D117L、F317L和EP364R共表达重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacactg aaacgtctcc actgctttct cataacctgt caacccgcga gggaattaaa 60

caaagcaccc aaggcctttt agcccataca atcgccaaat atcccggaac aactgcgatt 120

ctcctgggca ttttgatttt gctcattatt attcttatca tcgttgccat cgtttactat 180

aaccggacta ttgactgcaa gtcgagcata cctaaacctc ctcctagcta ctatgtacaa 240

caacctgagc ctcaccacca tttcccggta ttctttagaa aaaggaaaaa ctccacctcc 300

ctgcagtccc acattccaag cgacgaacaa ttagctgaac ttgcgcattc ataa 354

<210> 2

<211> 954

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggttgaga cacaaatgga caaacttggt tttctgctaa atcacatagg taaacaggtt 60

accactaagg tgcttagcaa tgcccatata actcaaacga tgaaggagat tattttggaa 120

aatcatagtg tagatggtgg agccgcaaaa aatgtttcaa aagggaagtc ttccccaaaa 180

gaaaaaaaac attggactga gttcgaatcc tgggaacagc tcagcaagtc taaaagaagt 240

tttaaggaat actgggcgga gcgtaatgag attgtgaata ctctgttgct taactgggac 300

aatgttcggg gtgccatcaa aaaatttttg gacgatgacc gtgaatggtg cggccgcatt 360

aatatgataa acggtgtacc cgagatagtg gaaatcattc caagccccta tagggcagga 420

gagaacattt attttggcag cgaggctatg atgcctgctg atatttatag cagggtggcc 480

aacaagcctg ctatgtttgt gtttcacacg catcctaatt tgggttcatg ttgtggagga 540

atgccttcca tatgtgacat ttctacaacg ctgcgttatc tactcatggg gtggactgct 600

gggcatctaa tcatttcttc gaatcaagta ggaatgctca cggttgataa gagaattatt 660

gttgatttgt gggccaatga gaatccgcgc tggcttatgg cgcaaaaaat attagatatt 720

tttatgatgc tcacttcgcg tagaagcctg gtaaatccct ggaccctgag agacctaaaa 780

aaaatattac aagactatgg tattgagtat atcatttttc cttcgaatga cttttttatt 840

tatgaagacg aacgtctttt aatgttttca aaaaaatgga ccaacttttt tacgttacat 900

gagttattgg atgacctcga aactattgag acaaaggcat cgtccacaac atag 954

<210> 3

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtattttc tagtagcaga tcatcgagaa catcatgtga ttccttttct taaaaccgat 60

ttccatcaca tgcatcaaaa tcctatacaa aaaaatcaag ctctcctaga aatcaaacag 120

ctttttactg gagattatct catctgcaaa agcccttcta ccattctggc ctgtattgaa 180

cgaaaaacct acaaagactt tgcggcttct ttgaaagatg gacgttataa aaatcgccaa 240

aaaatgctgt cgctgcgaga acaaaccaac tgtcaacttt atttttttgt agaaggcccg 300

gcatttccta accctcaaaa aaaaattaat cacgttgcct atgcaagcat tattactgct 360

atgacgcatc ttatggttag agatcatatt tttgtcattc aaacgaaaaa tgaggcccac 420

agttcccaaa agcttgtgca gcttttttat gccttttcta aggaaatggt gtgcgtcgtt 480

cccacctccc tcacccccac ggatgaagag ctatgcatca agctatggtc ttctctttct 540

ggtatttcag gcgtgatagg taaaatcttg gcaaacactt gttccgtagc tcatttggtt 600

catggaaagc tttcatcgca gaatattgat cagttaaaaa ctccctccaa ccgaccattc 660

cccaaaaaag taaaacgtat gcttataagc attagcaaag gaaataagga gttagaaata 720

aaattgctct cgggggttcc caatatcggg aaaaaattag ctgccgaaat tttaaaagat 780

catgcgcttc ttttttttct aaatcagccc gtagaatgct tggcaaatat acaaatcgtt 840

caaaaaaccc gtacgattaa gttgggaatg aagcgagccg aagcgattca ttatttttta 900

aactggtgtg gctctgccca tgtaaccgat gatagccaaa atatcacaga ggcgtcgcgg 960

tccacaatgc aggtcgcgac gcagtccgcc gcaatacagc ccgctgcaac gcagccattg 1020

cacgaagtat cagatgatgc atcatcagat gcttcatcac ccgtagggta tcaaacatta 1080

tctaaagaaa tgttattgaa cacagcctga 1110

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctagagatc tggtaccgcc accatggtga gcaagggcg 39

<210> 5

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tatcttatct agaagctttt aggcgtagtc gggcacgtcg taggggtact c 51

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcctggacc ggtcgacgac accgagacca gccccct 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcgtaggggt actcgagggc ggtgttcagc agcatct 37

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggacgagc tgtacaagag tactgcaaca aacttc 36

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcaaatggg cggtaggcgt g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaatttgtg atgctattgc 20

<210> 11

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agtactgcaa caaacttctc tctgctgaaa caagccggag atgtcgaaga gaatcctgga 60

ccggtcgac 69

<210> 12

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcgccccc 9

<210> 13

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggttt 5

<210> 14

<211> 5

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaacc 5