制备2-（（2r，4r）-4-羟基-6-氧代四氢-2h-吡喃-2-基）乙腈的方法
阅读说明：本技术 制备2-（（2r，4r）-4-羟基-6-氧代四氢-2h-吡喃-2-基）乙腈的方法 (Process for the preparation of 2- ((2R, 4R) -4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl) acetonitrile ) 是由 陈本顺 叶金星 石利平 李大伟 徐春涛 张维冰 程瑞华 孙伟振 何义 何伟 于 2020-11-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种制备2-((2S,4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的方法,以乙醛和氯乙醛为原料,在全细胞催化剂的作用下,一步制备2-((2S,4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈,解决了现有技术中合成路线复杂、成本较高或酶易失活等难题,具有合成步骤简单,原料成本低,收率和纯度高,反应条件温和,绿色环保,具有广阔的应用前景。(The invention relates to a method for preparing 2- ((2S, 4S) -4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl) acetonitrile, which takes acetaldehyde and chloroacetaldehyde as raw materials, and prepares the 2- ((2S, 4S) -4-hydroxy-6-oxotetrahydro-2H-pyran-2-yl) acetonitrile in one step under the action of a whole-cell catalyst, solves the problems of complex synthetic route, higher cost, easy enzyme inactivation and the like in the prior art, and has the advantages of simple synthetic step, low raw material cost, high yield and purity, mild reaction conditions, environmental protection and wide application prospect.)
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及制备2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的方法。
背景技术
他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的抑制剂，是现代药物化学显著的成功案例之一。除了降低胆固醇的能力外，还发现它们还有许多其他有益的作用。他汀类药物由手性二醇侧链组成，附加在环状片段上。他汀类药物最初被发现为微生物代谢物，通过对其结构进行部分修改，已迅速发展成为更有效的合成类似物。完全合成的衍生物经常被称为超级他汀类。由于侧链是所有他汀类药物的重要组成部分，因此，人们对侧链的有效构建和最终结构的整合进行了大量的研究。
化合物2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈是侧链合成重要的手性中间体，制备路线中，较为广泛关注的是其前体通过DERA酶催化制备，Greenberg以乙醛、氯乙醛或氰基乙醛为底物，通过DERA酶催化该化合物前体的制备，合成路线如下所示，酶的催化效率达到了生产化的标准(WO2004027075)，浙工大的教授对DERA酶进一步做了表征(Microbiol Biotechnol(2013)40:29-39)，结果表明，该酶催化效率高，但容易受醛的影响而导致酶失活。
卢布尔雅那大学药学院P.Mrak课题组对DERA酶以及催化氧化反应的Gcd酶做了不少的研究，合成路线如下：通过将氧化反应与呼吸链耦联，引入代谢工程的机理，以大肠杆菌为工程菌通过全细胞进行缩醛反应与氧化反应，并对参与反应的DERA酶和Gcd酶序列进行了优化获得有生产意义的酶活，DERA酶催化的产物ee值达到99.9％，力奇制药将该项成果申请了专利(WO2008119810和WO200909270)，但分步反应增加了生产的成本。
现有技术中，化合物2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的制备，以乙醛和氯乙醛为起始原料的路线，需经过两步酶法一步化学法，过程繁琐，收率低；而且以乙醛和氰基乙醛为起始原料，增加了原料的成本，中间化学法对环境有污染，同时增加了污水处理量。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，以乙醛和氯乙醛为原料，在固定化表达醛缩酶DERA、脱氢酶ADH和腈转化酶的细菌作为催化剂的作用下，一步制备2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，解决了现有技术中合成路线复杂、成本较高或酶易失活等难题，具有合成步骤简单，原料成本低，收率和纯度高，反应条件温和，绿色环保，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案如下：
制备2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的方法，以乙醛和氯乙醛为原料，在全细胞催化剂和NaCN存在的条件下，于20～40℃进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，一步制备式I所示的化合物，所述全细胞催化剂为固定化表达醛缩酶DERA、脱氢酶ADH和腈转化酶的细菌；该反应的合成路线如下：
本发明将醛缩酶DERA、脱氢酶ADH和腈转化酶以全细胞催化剂的形式，催化乙醛、氯乙醛进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，一步制备式I所示的化合物。全细胞催化剂为可以固定化表达醛缩酶DERA、脱氢酶ADH和腈转化酶的细菌，该细菌可以但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酵母菌。例如，大肠杆菌，特别是编号为DAC0-003的重组大肠杆菌。
在一种优选方案中，进行缩醛反应时，醛缩酶DERA的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，具体如下所示：SEQ ID NO.1：
在一种优选方案中，进行氧化反应时，脱氢酶ADH的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，具体如下所示：SEQ ID NO.2：
在一种优选方案中，进行氰化反应时，腈转化酶的核苷酸序列SEQ ID NO.3所示，具体如下所示：SEQ ID NO.3：
在一种优选方案中，以乙醛和氯乙醛为原料，在全细胞催化剂的作用下一步制备式I所示的化合物时，反应温度为30～35℃。例如，30℃或35℃。
对于本发明而言，醛缩酶DERA、脱氢酶ADH和腈转化酶以全细胞催化剂的形式应用于制备式I所示的化合物，其中，全细胞催化剂的固定化方法为吸附法或包埋法，可以但不局限于海藻酸钙包埋法或水凝胶包埋法。例如，将重组大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，在DA-F127和Irgracure2959存在的条件下，UV照射成胶，再将得到的胶体切块，获得固定化细胞，即本发明中提及的全细胞催化剂。
本发明提及的重组大肠杆菌，编号为DAC0-003，具体制备方法如下：
(1)设计F、R引物并合成，并添加EcoR I，Hind III酶切位点，序列为SEQ ID NO.4：
F:CCCAAGCTT ATGAATATTGCTAAAATGATAGATCATA
R:GGAATTCCTAGCTAGCGGATCCCTCTGGCATG
(2)设计全基因序列并合成，构建pUC57-Bind质粒。
(3)以通用公司全基因合成构建的pUC57-Bind质粒为模板，通过PCR的方式扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的基因。PCR条件为：98℃5min，95℃30s，57℃30s、72℃90s，36个循环。
PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix 25μL，PCR后电泳检验并切胶回收，采购商品质粒pRSF-Duet，将目的片段与PRSF-Duet进行EcoR I，Hind III酶切，通过胶回收试剂盒对酶切后的产物进行纯化和回收(电泳检验回收产物的浓度)。将目的基因Bing与载体PRSF-Duet连接，连接体系：目的基因4μL，载体PRSF-Duet 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃连接16h。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该酯酶基因的重组工程菌DAC0-003。
对于本发明而言，以乙醛和氯乙醛原料，在全细胞催化剂和NaCN的作用下，进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，一步制备式I所示的化合物，其中，氧化反应中辅酶为NADH，该辅酶的循环路线如下：
本发明公开的一步制备式I所示的化合物的方法，它可以包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液；
(2)DA-F127的制备：将F127溶于四氢呋喃中，再加入三乙胺混合均匀后，向得到的混合溶液中加入丙烯酰氯，于0～30℃的条件下进行化学反应，制备产物DA-F127；
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127、Irgracure2959和步骤(1)中制成的菌体悬浮液混合均匀后，在UV照射成胶，再将得到的胶体切块，得到全细胞催化剂；
(4)在步骤(3)中制备的全细胞催化剂和NAD+存在的条件下，乙醛、氯乙醛、NaCN和dH2O于20～40℃进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，一步制备式I所示的化合物。
在步骤(2)中，本发明提及的F127为泊咯沙姆，其商标名称为普朗尼克。
在一种优选方案中，在步骤(3)中，DA-F127、Irgracure2959和菌体悬液中菌体的质量比1:0.8～1.2:0.5～2.5，优选为1:1:0.8～2.0，更优选为1:1:1.2。
进一步的，在步骤(3)中，将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中，Irgracure2959溶于DMSO中，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液与步骤(1)中制成的菌体悬浮液混合均匀后，UV照射成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即，全细胞催化剂。优选地，此处提及的PB缓冲液，其浓度为0.1M，pH值为7.0。
当DA-F127溶于PB缓冲液时中制成DA-F127溶液时，DA-F127的浓度可以根据需要进行调整，例如浓度为0.1～0.3g/ml，优选为0.125g/ml，具体制备方法如下：将1g DA-F127溶解于8mL PB缓冲液(0.1M，pH值为7.0)中。
当Irgracure2959溶解于DMSO中制成Irgracure2959溶液时，Irgracure2959的浓度可以根据需要进行调整，例如浓度为0.1～0.5g/ml，优选为0.3g/ml，具体制备方法如下：将1g Irgracure2959溶解于3mL DMSO中。
在一种优选方案中，在步骤(3)中，菌体悬浮液中菌体的浓度可以但不局限于0.01～0.1g/ml，具体可以为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml、0.04g/ml、0.05g/ml、0.06g/ml、0.07g/ml、0.08g/ml、0.09g/ml或0.1g/ml。
在UV照射成胶时，成胶的时间可以为2～10分钟，优选为3～9分钟；可以但不局限于2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。
对于本发明而言，在步骤(4)中，全细胞催化剂、NAD+与乙醛之间的质量比为49000～51000:3:4900～5100，优选为50000:3:5000。
在一种优选方案中，步骤(4)中，乙醛、氯乙醛和NaCN之间的质量比1:0.3～0.7:0.2～0.6，优选为1:0.5:0.4。
在一种优选方案中，本发明提供的制备2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈的方法，包括以下更详细的步骤：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：将F127和四氢呋喃加入至锥形瓶中，待完全溶解后，加入无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入三乙胺，待混匀后再用注射器加入体积分数为10～12％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将DA-F127、Irgracure2959和步骤(1)中制成的菌体悬浮液混合均匀后，在UV照射成胶，再将得到的胶体切块，得到全细胞催化剂。
(4)将步骤(3)中制备的全细胞催化剂加入反应釜中，再加入ddH2O、NAD+和NaCN，待混合均匀后，向其中加入乙醛、氯乙醛使其混合均匀，于30～35℃进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，待反应结束后，分离出全细胞催化剂，滤液以乙酸乙酯萃取，减压蒸馏得到目标化合物2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明以乙醛和氯乙醛为原料，在全细胞催化剂的作用下，一步制备2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，解决了现有技术中合成路线复杂、成本较高或酶易失活等难题，具有合成步骤简单，原料成本低，收率和纯度高，反应条件温和，绿色环保，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的制备方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1：
重组大肠杆菌的构建，编号为DAC0-003，具体制备方法如下：
(1)设计F、R引物并合成，并添加EcoR I，Hind III酶切位点，序列为SEQ ID NO.4：
F:CCCAAGCTT ATGAATATTGCTAAAATGATAGATCATA
R:GGAATTCCTAGCTAGCGGATCCCTCTGGCATG
(2)设计全基因序列并合成，构建pUC57-Bind质粒，序列如下：
(3)以通用公司全基因合成构建的pUC57-Bind质粒为模板，通过PCR的方式扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的基因。PCR条件为：98℃5min，95℃30s，57℃30s、72℃90s，36个循环。
PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix 25μL，PCR后电泳检验并切胶回收，采购商品质粒pRSF-Duet，将目的片段与PRSF-Duet进行EcoR I，Hind III酶切，通过胶回收试剂盒对酶切后的产物进行纯化和回收(电泳检验回收产物的浓度)。将目的基因Bing与载体PRSF-Duet连接，连接体系：目的基因4μL，载体PRSF-Duet 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃连接16h。将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该酯酶基因的重组工程菌DAC0-003。
实施例2：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.06g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射3min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为63％，纯度98％。
实施例3：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.06g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射6min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为80％，纯度99.2％。
实施例4：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.06g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射9min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为69％，纯度97.5％。
实施例5：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.04g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射6min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为71％，纯度96.6％。
实施例6：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.08g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射6min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为84％，纯度98.9％。
实施例7：
(1)将大肠杆菌，编号为DAC0-003，接种于LB液体培养基中，待培养结束后，离心收集菌体，制成菌体悬浮液。
(2)DA-F127的制备：分别称取3g F127和10ml四氢呋喃加入至50ml的锥形瓶中，待完全溶解后，加入2g无水硫酸镁除去混合溶液中的水分，在20～40℃的条件下放置一天后，过滤除去混合溶液中的硫酸镁。将过滤后含F127的混合溶液置于0℃冰水浴中，再加入300μl三乙胺，待混匀后再用注射器加入3mL体积分数为10.4％丙烯酰氯的四氢呋喃溶液，随后进行密封处理。在0℃下反应1h后，在30℃继续反应24h，离心去沉淀，旋蒸去除THF，获得产物DA-F127。
(3)将步骤(2)中制备的DA-F127溶于PB缓冲液中制成DA-F127溶液(1g DA-F127溶解于8ml 0.1M，pH值为7.0的PB缓冲液中)，Irgracure2959溶于DMSO中制成Irgracure2959溶液(1g Irgracure2959溶解于3ml DMSO中)，再将得到的DA-F127溶液、Irgracure2959溶液和20ml 0.1g/ml步骤(1)中制成的菌体悬浮液，混匀后，UV照射6min成胶，再将得到的胶体切块，得到固定化细胞，即全细胞催化剂。
(4)将50g固定化细胞加入反应釜中，加入1L ddH2O，3mg NAD+，5g乙醛，2.5g氯乙醛和2gNaCN，待其混合均匀后，于30～35℃依次进行缩醛反应、氧化反应和氰化反应，反应时间为30h。待反应结束后，分离出固定化细胞，用50mLEA萃取两次(每次萃取使用50mL)，再加入10.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，减压浓缩，得到式I所示的化合物，2-((2S，4S)-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基)乙腈，收率为76％，纯度95.2％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 制备2-（（2S，4S）-4-羟基-6-氧代四氢-2H-吡喃-2-基）乙腈的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 665
<211> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 1
atgaatattg ctaaaatgat agatcatacc ctactaaagc cagaggctac agagcaacaa 60
attgttcaac tgtgtactga agccaagcag tacggttttg ccgctgtctg tgttaacccc 120
acttgggtta agacagctgc cagggaatta tctggtaccg acgttagagt gtgtactgta 180
atcggatttc cattaggggc cactacgcca gaaaccaagg cttttgagac gacaaacgct 240
atagaaaacg gtgctcgtga agtagatatg gtcattaata taggtgcatt gaaatcaggt 300
caagacgaat tggtcgaacg agatattcgt gccgtcgtcg aagctgccgc aggacgagcc 360
ttggttaagg tcatagtaga aaccgctttg ctaacagatg aggagaaggt cagagcatgt 420
cagctagctg taaaagctgg agcagactat gtgaagacta gtacaggatt ttcaggtgga 480
ggtgctacag ttgaggacgt tgcccttatg agaaaaactg ttggagatag agctggcgtc 540
aaggcatctg gtggtgttcg tgactggaaa accgctgagg ccatgattaa tgctggcgct 600
actcgtattg gtacttcctc cggagtggct atcgtcactg gcggtaccgg gcgtgctgac 660
actga 665
<210> 2
<211> 1128
<211> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 2
atgagcaccg caggtaaagt gattaaatgt aaagcagcag ttctgtggga agagaaaaaa 60
ccgtttagca ttgaagaagt tgaagttgca ccgcctaaag cacatgaagt tcgcattaaa 120
atggttgcca ccggtatttg tcgtagtgat gatcatgttg ttagcggcac cctggttaca 180
ccgctgccgg ttattgcagg tcatgaagca gcaggtattg ttgaaagcat tggtgaaggt 240
gttaccaccg ttcgtccggg tgataaagtt attccgctgt ttacaccgca gtgtggtaaa 300
tgtcgtgttt gtaaacatcc ggaaggtaac ttttgcctga aaaatgatct gagcatgcct 360
cgtggcacca tgcaggatgg caccagccgt tttacctgtc gtggtaaacc gattcatcat 420
tttctgggca ccagcacctt tagccagtat accgttgttg atgaaattag cgtggccaaa 480
attgatgcag caagtccgct ggaaaaagtt tgtctgattg gttgtggttt tagcaccggt 540
tatggtagcg cagttaaagt tgccaaagtt acccagggta gcacctgtgc agtttttggt 600
ttaggtggtg ttggtctgag cgttattatg ggttgcaaag cagccggtgc agcacgtatt 660
attggtgttg atattaacaa agataaattt gcgaaagcca aagaggttgg cgcaaccgaa 720
tgtgttaatc cgcaggatta caaaaaaccg atccaagagg ttctgaccga aatgagcaat 780
ggtggtgtgg attttagctt tgaagttatt ggtcgtctgg ataccatggt taccgcactg 840
agctgttgtc aagaggcata tggtgttagc gttattgttg gtgttccgcc tgatagccag 900
aatctgagta tgaatccgat gctgctgctg agcggtcgta cctggaaagg tgccattttt 960
ggtggtttta aaagcaaaga tagcgtgccg aaactggttg cagattttat ggcgaaaaaa 1020
ttcgcactgg acccgctgat tacccatgtt ctgccgtttg aaaaaatcaa cgaaggtttt 1080
gatctgctgc gtagcggtga aagtattcgt accattctga ccttttaa 1128
<210> 3
<211> 777
<211> DNA
<213>大肠杆菌
<400> 3
atgagcactg caattgtgac aaacgtgaag cattttggcg gcatgggtag cgcgctgaaa 60
ctgagcgagg cgggtcacac ggtggcctgt cacgatgaaa gctttaaaca tcaggacgag 120
ctggaagctt ttgccgaaac ctatcctcag ctgattccta tcagcgaaca ggagccggtt 180
gaactgatag aggccgtgaa cagcgcactg ggtcatgtgg acattctggt gagcaatgat 240
atagctccgg ttgaatggcg tccgatagac gaatacactg ttgaagatta ccgtgatatg 300
attgaagcgc tgcagattaa accatttgcg ctggctaatg cggttgctac tcagatgaaa 360
cgccgcaaaa gcggtcatat tatttttatc acgagcgctg cgagctttgg tccttggaaa 420
gaactgagca catacgcgag cgcacgcgct ggcaccagcg cactggcaaa tgccctgagc 480
aaagagctgg gtgaatataa catcccagtt tttgcaatcg cacctaatgc agtggatagc 540
ggcgatagcc cgtactatta tccaagcgaa ccttggaaaa tcagcccgga gcacgttgca 600
tgggttcgca agtatacggc cctgcaacgt ctgggcacac aaaaggaact gggtgaactg 660
gttaccttcc tggccagcgg cagctgcgat tatctgaccg gccaagtgtt ccgtttcgcc 720
ggtggtttcc cggttgtgga gcgttggccg ggcatgccag agggatccgc tagctag 777
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种利用D-葡萄糖生物合成D-阿洛糖的方法