具体实施方式

在进一步描述本公开文本之前，应理解，本公开文本并不限于下文所述公开文本的特定实施方案，因为可对特定实施方案进行变动，并且仍落入所附权利要求的范围内。还应当理解，所使用的术语是出于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制。而是，本公开文本的范围将由所附权利要求确定。

在本说明书和所附权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，对“化合物”的提及包括两种或更多种此类化合物的混合物，对“不饱和脂肪酸”的提及包括两种或更多种此类不饱和脂肪酸的混合物，对“基质”的提及包括两种或多种此类基质的混合物等。

除非另外定义，否则本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能或可能不发生，并且所述描述包括其中所述事件或情况发生的情况以及其中它不发生的情况。

范围可以在本文中表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表述为近似值时，应当理解所述特定值形成另一个实施方案。还应当理解，每个范围的端点相对于另一个端点是显著的并且独立于另一个端点。还应理解，本文公开了许多值，并且除了所述值本身之外，每个值还以“约”所述特定值公开在本文中。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应当理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当公开了一个值时，则也公开了“小于或等于”所述值、“大于或等于所述值”以及所述值之间的可能范围。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同格式提供，并且这些数据表示端点和起始点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15以及在10与15之间。还应当理解，也公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。

在说明书和最终权利要求中对组合物中特定要素或组分的重量份的提及表示表述为重量份的所述要素或组分与组合物或制品中的任何其他要素或组分之间的重量关系。因此，在含有2重量份组分X和5重量份组分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且无论在所述化合物中是否含有另外的组分都以这样的比率存在。

除非有特别的相反说明，否则组分的重量百分比基于包含所述组分的配制品或组合物的总重量。

除非有相反的说明，否则具有仅以实线而不是楔形或虚线示出的化学键的式考虑了每种可能的异构体(例如每种对映异构体和非对映异构体)以及异构体的混合物，诸如外消旋或非外消旋(scalemic)混合物。

现在将详细提及所公开的材料、化合物、组合物、制品和方法的具体方面，其例子展示在所附实施例和附图中。

本文公开了可以用于所公开的方法和组合物，可以与其结合使用，可以用于其制备，或者作为其产物的分子、材料、化合物、组合物和组分。本文公开了这些和其他材料，并且应当理解当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时并且在不能明确公开对这些化合物的每个不同单独和集体的组合和排列的具体提及时，每一种在本文中被具体考虑和描述。例如，如果公开了化合物并且讨论了可以对所述化合物的许多组分或残基进行的许多修饰，则除非有相反的明确指示，否则特别考虑了可能的每一种组合和排列。因此，如果公开了一类组分或残基A、B和C以及一类组分或残基D、E和F并且公开了组合化合物A-D的例子，那么即使每个都不是单独列举的，每个也被单独地和集体地考虑。因此，在此例子中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个都被特别考虑，并且应被认为是从A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开中公开的。同样地，也特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。因此，例如，A-E、B-F和C-E的亚组被特别考虑并且应被认为是从A、B和C；D、E和F；和示例组合A-D的公开中公开的。此概念适用于本公开文本的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多种另外步骤，则应当理解，这些另外步骤中的每一个都可以用所公开的方法的任何特定方面或方面的组合来进行，并且每种这样的组合都被特别考虑并且应认为被公开。

本文公开的某些材料、化合物、组合物和组分可商购获得或使用本领域技术人员通常已知的技术容易地合成。例如，用于制备所公开的化合物和组合物的起始材料和试剂可从商业供应商(诸如Aldrich Chemical Co.(密尔沃基，威斯康星州)、Acros Organics(莫里斯普莱恩斯(Morris Plains)，新泽西州)、Fisher Scientific(宾夕法尼亚州，匹兹堡)或Sigma(圣路易斯，密苏里州))获得，或者通过本领域技术人员已知的方法按照诸如以下的参考文献中所阐述的程序来制备：Fieser and Fieser's Reagents for OrganicSynthesis,第1-17卷(John Wiley and Sons,1991)；Rodd's Chemistry of CarbonCompounds,第1-5卷和增刊(Elsevier Science Publishers,1989)；Organic Reactions,第1-40卷(John Wiley and Sons,1991)；March's Advanced Organic Chemistry,(JohnWiley and Sons,第4版)；和Larock's Comprehensive Organic Transformations(VCHPublishers Inc.,1989)。

如本文所用，术语“二酰基甘油”、“甘油二酯”和“二酯”可互换使用，是指附接至甘油主链的两个脂肪酸。类似地，术语“单酰基甘油”和“甘油单酯”可互换使用，是指附接至甘油主链的一个脂肪酸，并且术语“三酰基甘油”、“甘油三酯”和“三酯”可互换使用，是指附接至甘油主链的三个脂肪酸。

酶

本文可用的酶是可用于酯化羧酸或酯交换酯的任何天然存在的或合成酶。术语“酯化”在本文中被定义为通过使羧酸与醇反应以产生酯(例如，RCOOH+R¹OH→RCOOR¹+H₂O)而羧酸转化为相应的酯。术语“酯交换”在本文中被定义为通过使一种酯与醇反应以产生不同的酯(例如，RCOOR¹+R²OH→RCOOR²+R¹OH)而将所述酯转化为另一种酯。术语“酯交换”在本文中被定义为在两个或更多个单独的独立酯之间酯部分的转换。方案1A中描绘了两种酯之间的相互酯化，其中在起始材料(即，R¹COOR²和R³COOR⁴)中R²和R⁴基团转换。方案1B描绘了在羧酸(R¹COOH)与酯(R³COOR⁴)之间的相互酯化，其产生新的羧酸和酯。术语“酯内化”在本文中被定义为同一分子内酯部分的转换。方案1C中描绘了酯内化，其中R²和R³基团在三酯中转换。方案1D描绘了在同一分子内的羧酸基团与酯之间的酯内化，其中羧酸的氢与酯基的R³转换。

R¹CO₂R²+R³CO₂R⁴→R¹CO₂R⁴+R³CO₂R² 1A

R¹CO₂H+R³CO₂R⁴→R¹CO₂R⁴+R³CO₂H 1B

方案1

合适的酶可以源自微生物。可以产生本文可用的酶的微生物的例子包括但不限于伯克氏菌属物种(Burkholderia sp.)、南极假丝酵母B、皱落假丝酵母(Candida rugosa)、圆柱假丝酵母(Candida cylindracea)、假单胞菌属物种(Pseudomonas sp.)、南极假丝酵母A、猪胰(Porcine pancreas)、腐质霉属物种(Humicola sp.)、腐质霉(Humicolalanuginose)、米黑毛霉(Mucor miehei)、爪哇根霉(Rhizopus javan.)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluor)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、圆柱假丝酵母(Candidacylindrcae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米根霉(Rhizopus oryzae)、爪哇毛霉(Mucorjaanicus)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)、根霉属物种(Rhizopus sp.)、日本根霉(Rhizopus japonicus)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehi)、雪白根霉(Rhizopus niveus)、或卡门柏青霉(penicillium camembertii)(还有戴尔根霉(Rhizopus delemar)、铜绿假单胞菌(Pseudonomas aeruginosa))。

在一个例子中，所述酶由南极假丝酵母产生。NOVOZYME^TM CALB L是通过深层发酵经遗传修饰的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物而从南极假丝酵母产生的脂肪酶(脂肪酶B)。NOVOZYME^TM CALB L是对许多种不同底物具有活性的高度通用的催化剂。所述酶在光学活性醇、胺和羧酸的合成中特别用作强大的对映选择性催化剂。已知南极假丝酵母脂肪酶B有效地将乙酯或游离脂肪酸转化为甘油三酯。此酶是具有317个氨基酸残基和33,008道尔顿的分子量的蛋白质。将氨基酸组装成14个α-螺旋和9个β-折叠。南极假丝酵母脂肪酶B的氨基酸序列和二级结构提供在SEQ ID NO:1中。LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSARSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP

还考虑了由微生物产生的酶的衍生物可以用于本文所述的方法。应当理解，如本文公开的许多酶的结构是已知的并且可以在例如Genbank中找到，并且通过引用并入本文。

作为所有微生物脂肪酶，CALB属于α/β水解酶，其折叠包括夹在两层两亲性α-螺旋之间的八链β-折叠。这些酶的酯水解机理总体上涉及与酯底物的结合，通过催化丝氨酸的亲核攻击形成第一四面体中间体，其中由两个或三个H键稳定氧阴离子，所谓的氧阴离子洞。在最终步骤中，酯键被裂解并且酰化酶被水解。通过催化丝氨酸的亲核攻击是由催化组氨酸和天冬氨酸或谷氨酸残基介导的。在某些例子中，在CALB的结合口袋内完全结合的最长脂肪酸链是C13；因此，此酶的易切断的脂肪酸结合位点相对较短CALB的结合位点相对较短，并且具有位于结合漏斗壁处的小疏水区域。CALB的结构已经公开在蛋白质数据库(The Protein Data Bank:a computer-based archival file formacromolecular structures.Bernstein等人,J.Mal.Biol.112:525-542,1977)中。还应当理解，在本领域中理解并且在本文中公开的其保守催化核心可以定义所公开的酶。

序列相似性

应当理解，如本文所讨论的，术语“同源性”和“同一性”的使用意指与相似性相同。因此，例如，如果在两个非天然序列之间使用词语同源性的使用，则应当理解，这不一定表明这两个序列之间的进化关系，而是查看其序列之间的相似性或相关性。为了测量序列相似性的目的，用于确定两个进化相关分子之间的同源性的许多方法常规地应用于任何两个或更多个核酸或蛋白质，不论它们是否进化相关的。通常，应当理解，一种定义任何已知变体和衍生物或可能产生于本文公开的基因和蛋白质的那些(诸如SEQ ID NO:1)的方法是通过在与特定已知序列的同源性上定义变体和衍生物。本文公开的特定序列的这种同一性也在本文其他地方讨论。通常，本文公开的基因和蛋白质的变体典型地具有相对于所陈述的序列或天然序列至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99百分比同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质或核酸(诸如基因)的同源性。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。

计算同源性的另一种方法可以由公开的算法执行。用于比较的最佳序列比对可以通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988的相似性方法的检索，通过这些算法的计算机化实现(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、PASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.，麦迪逊，威斯康辛州)，或通过检查来进行。

可以通过例如在Zuker,Science 244:48-52,1989,Jaeger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7706-7710,1989,Jaeger等人,Methods Enzymol.183:281-306,1989中公开的算法获得用于核酸的相同类型的同源性，将其至少与核酸比对有关的材料通过引用并入本文。应该理解，典型地可以使用任何方法，并且在某些情况下，这些各种方法的结果可以不同，但是本领域技术人员理解，如果用这些方法中的至少一种找到同一性，则可以认为所述序列具有所陈述的同一性并且在本文中公开。

例如，如本文所用，被列举为具有相对于另一个序列特定百分比同源性的序列是指具有如通过上述任何一种或多种计算方法计算出的所列举的同源性的序列。例如，如果使用Zuker计算方法计算出第一序列具有相对于第二序列80百分比的同源性，即使如通过任何其他计算方法计算出第一序列不具有相对于第二序列80百分比的同源性，则第一序列具有如本文定义的相对于第二序列80百分比的同源性。作为另一个例子，如果使用Zuker计算方法以及Pearson和Lipman计算方法计算出第一序列具有相对于第二序列80百分比的同源性，即使如通过Smith和Waterman计算方法、Needleman和Wunsch计算方法、Jaeger计算方法、或任何其他计算方法计算出第一序列不具有相对于第二序列80百分比的同源性，则第一序列具有如本文定义的相对于第二序列80百分比的同源性。作为又另一个例子，如果使用每种计算方法计算出第一序列具有相对于第二序列80百分比的同源性(尽管在实践中，不同的计算方法通常将导致不同的计算同源性百分比)，则第一序列具有如本文定义的相对于第二序列80百分比的同源性。

杂交/选择性杂交

还应当理解，本文公开的酶，诸如SEQ ID NO:1，可以通过编码它们的核酸的与其他核酸杂交的能力来分类。术语“杂交”典型地意指在至少两个核酸分子(诸如引物或探针和基因)之间的序列驱动的相互作用。短语“序列驱动的相互作用”意指以核苷酸特异性方式在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间发生的相互作用。例如，G与C相互作用或A与T相互作用是序列驱动的相互作用。典型地，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面上。两个核酸的杂交受到本领域技术人员已知的许多条件和参数的影响。例如，盐浓度、pH和反应温度均影响两个核酸分子是否将杂交。

用于两个核酸分子之间的选择性杂交的参数是本领域技术人员众所周知的。例如，在一些例子中，选择性杂交条件可以被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格性由杂交和洗涤步骤之一或两者的温度和盐浓度两者控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可以涉及在高离子强度溶液(6X SSC或6X SSPE)中在比Tm(一半分子从其杂交伴侣解离时的解链温度)低约12℃至约25℃的温度下杂交，然后在使得洗涤温度比Tm低约5℃至约20℃而选择的温度和盐浓度的组合下进行洗涤。可以在初步实验中容易地凭经验确定温度和盐条件，在所述实验中，固定在过滤器上的参考DNA样品与感兴趣的标记核酸杂交并且然后在不同严格性条件下洗涤。

对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交，杂交温度典型地更高。所述条件可以如上所述使用以实现严格性，或者如本领域中已知的那样使用。(Sambrook等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,冷泉港,纽约,1989；Kunkel等人Methods Enzymol.1987:154:367,1987，将其至少与核酸杂交有关的材料通过引用并入本文)。对于DNA:DNA杂交的优选严格杂交条件可以是在6X SSC或6X SSPE中在约68℃下(在水溶液中)，然后在68℃下洗涤。杂交和洗涤的严格性(如果希望)可以随着所希望的互补性程度的降低而相应地降低，并且进一步取决于寻找变异性的任何区域的G-C或A-T丰富度。同样，杂交和洗涤的严格性(如果希望)可以随着希望的同源性的增加而相应地增加，并且进一步取决于希望高同源性的任何区域的G-C或A-T的丰富度，这都是本领域已知的。

定义选择性杂交的另一种方法是查看与另一个核酸结合的一个核酸的量(百分比)。例如，在一些例子中，选择性杂交条件将是当至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的限制性核酸与非限制性核酸结合时。典型地，非限制性引物是例如10或100倍或1000倍过量的。这种类型的测定可以在以下条件下进行：限制性引物和非限制性引物均比其k_d低例如10倍或100倍或1000倍，或只有一个核酸分子是10倍或100倍或1000倍，或一个或两个核酸分子高于其k_d。

定义选择性杂交的另一种方法是通过查看在需要杂交以促进所希望的酶促操纵的条件下受到酶促操纵的引物的百分比。例如，在一些例子中，选择性杂交条件将是当在促进酶促操纵的条件下酶促操纵至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的引物时；例如，如果酶促操纵是DNA延伸，则选择性杂交条件将是当延伸至少约60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100百分比的引物分子时。优选的条件还包括制造商建议的或本领域中指示适于进行操纵的酶的条件。

正如同源性一样，应当理解，存在本文公开的用于确定两个核酸分子之间杂交水平的多种方法。应当理解，这些方法和条件可以提供两个核酸分子之间不同百分比的杂交，但是除非另有指示，否则满足任何一种方法的参数将是足够的。例如，如果需要80％的杂交并且只要在这些方法中的任何一种中的所需参数内发生杂交，则认为其在本文中被公开。

应当理解，本领域技术人员理解，如果组合物或方法满足用于集合地或单独地确定杂交的标准的这些条件中的任何一个，则它是本文公开的组合物或方法。

肽

如本文所讨论的，所公开的酶(诸如SEQ ID NO:1)的许多变体和菌株衍生物是已知的并且考虑在本文中。酶可以由蛋白质或肽制成。蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员众所周知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰典型地属于以下三种类别中的一种或多种：取代变体、插入变体、或缺失变体。插入包括单个或多个氨基酸残基的氨基和/或羧基末端融合以及序列内插入。插入将通常是比氨基或羧基末端融合的插入小的插入，例如在1至4个残基的量级上。免疫原性融合蛋白衍生物，诸如实施例中所述的那些，通过以下方式制造：通过体外交联或通过用编码融合物的DNA转化的重组细胞培养物将足够大以赋予免疫原性的多肽与靶序列融合。

缺失的特征在于从蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基。典型地，在蛋白质分子内的任一位点缺失不多于约2至6个残基。通常，这些变体通过以下方式制备：对编码蛋白质的DNA中的核苷酸进行位点特异性诱变，从而产生编码变体的DNA，并且此后在重组细胞培养物中表达所述DNA。

用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代典型地是单个残基的，但可以一次出现在许多不同的位置；插入通常将是在约1至10个氨基酸残基的量级上；并且缺失的范围将是约1至30个残基。

优选在相邻对中进行缺失或插入，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或其任何组合可以组合以得到最终构建体。突变不得将序列置于阅读框之外，并且优选将不产生可产生二级mRNA结构的互补区域。替代变体是其中至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些。此类取代通常根据下表A和B进行，并且称为保守取代。

表A：氨基酸缩写

表B：氨基酸取代

功能或免疫同一性的显著变化通过以下方式实现：选择保守性小于表B中的那些的取代，即选择在其维持以下方面的作用上差异较显著的残基：(a)取代区域中多肽主链的结构，例如呈片或螺旋构象；(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的体积。通常预期在蛋白质特性上产生最大变化的取代将是这些，其中(a)亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或被其取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基(或被其取代)；(c)具有正电性侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酸)取代负电性残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰基(或被其取代)；或(d)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代没有侧链的残基(例如甘氨酸)(或被其取代)，在这种情况下，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化位点的数量。

例如，一个氨基酸残基被在生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸残基替代是本领域技术人员已知的保守取代。例如，保守取代是将是一个疏水性残基替代另一个，或一个极性残基替代另一个。所述取代包括组合，例如像Gly、Ala；Val、lie、Leu；Asp、Glu；Asn、Gin；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。每个明确公开的序列的这种保守取代的变化都包括在本文提供的镶嵌(mosaic)多肽内。

可以采用取代或缺失诱变来插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可能是希望的。潜在的蛋白质水解位点(例如Arg)的缺失或取代例如通过缺失一个基本残基或用谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基取代一个基本残基来完成。

某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对所表达多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常在翻译后脱酰胺，变为相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。可替代地，这些残基在温和酸性条件下脱酰胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman&Co.,San Francis.co第79-86页(1983])，N-末端胺的乙酰化，以及在一些情况下C-末端羧基的酰胺化。

应当理解，一种定义本文公开的蛋白质的变体和衍生物的方法是通过在与特定的已知序列的同源性/同一性上定义变体和衍生物。例如，SEQ ID NO:1列出了脂肪酶的特定序列。具体公开了本文公开的这些和其他蛋白质的变体，其具有相对于陈述的序列至少约50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79,80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，可以在比对两个序列后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。

计算同源性的另一种方法可以由公开的算法执行。用于比较的最佳序列比对可以通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch,J.Mal.Biol.48:443,1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444,1988的相似性方法的检索，通过这些算法的计算机化实现(在Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、PASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.，麦迪逊，威斯康辛州)，或通过检查来进行。

可以通过例如在Zuker,Science 244:48-52,1989,Jaeger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:7706-7710,1989,Jaeger等人,Methods Enzymol.183:28.1-306,1989中公开的算法获得用于核酸的相同类型的同源性，将其至少与核酸比对有关的材料通过引用并入本文。

应当理解，对保守突变和同源性的描述可以以任何组合方式组合在一起，诸如具有相对于其中变体为保守突变的特定序列至少70％同源性的实施方案。

当本说明书讨论各种蛋白质和蛋白质序列时，应当理解还公开了可以编码那些蛋白质序列的核酸。这将包括与特定蛋白质序列有关的所有简并序列，即，具有编码一个特定蛋白质序列的序列的所有核酸以及编码所述蛋白质序列的所公开的变体和衍生物的所有核酸，包括简并核酸。因此，尽管每个特定核酸序列可能在本文中未写出，但应当理解，实际上在本文中通过所公开的蛋白质序列公开和描述了每一个序列。

还应当理解，虽然没有氨基酸序列指示何种特定DNA序列在生物体内编码所述蛋白质，但是在本文公开了所公开的蛋白质的特定变体的情况下，在产生所述蛋白质的特定菌株中编码所述蛋白质的已知核酸序列也是已知的并且公开和描述在本文中。

应当理解，存在许多氨基酸和肽类似物，可以将其掺入所公开的组合物中。例如，存在众多D氨基酸或具有不同官能取代基的氨基酸，然后所述氨基酸示出在表A和表B中。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。这些氨基酸可以通过以下方式容易地掺入多肽链中：向tRNA分子中填入所选氨基酸，并且工程化遗传构建体，所述遗传构建体利用例如琥珀色密码子将类似物氨基酸以位点特异性方式插入肽链中(Thorson等人,Meth.Mol.Biol.77:43-73,1991；Zoller,Curr.Opinion Biotechnol.3:348-354,1992；lbba,Biotechnol.Gen.Eng.Rev.13:197-216,1995；Cahill等人,TIBS 14(10):400-403,1989；Benner,TIB Tech 12:158-163,1994；lbba和Hennecke,Bio/technology 12:678-682,1994，将至少其与氨基酸类似物有关的材料均通过引用并入本文)。

可以产生类似于肽但不通过天然肽键连接的分子。例如，用于氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括但不限于CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CHH2SO-(这些和其他可以在以下中找到：Spatola,Chemistry andBiochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,B.Weinstein编辑,MarcelDekker,纽约,第267页,1983；Spatola,Vega Data(1983年3月),第1卷,第3期,PeptideBackbone Modifications(general review)；Morley,Trends Pharm.Sci.463-468,1980；Hudson等人,Int.J Pept.Prat.Res.14:177-185.,1979(-CH2NH-、CH2CH2-)；Spatola等人,Life Sci.38:1243-1249,1986(-CH2-S)；Hann,J Chem.Soc Perkin Trans.1307-314,1982(-CH＝CH-，顺式和反式}；Almquist等人,J Med.Chem.23:1392-1398,1980(-COCH2-)；Jennings-White等人,Tetrahedron Lett.23:2533,1982(-COCH2-)；Szelke等人,欧洲申请号EP 45665CA(1982):97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay等人,Tetrahedron.Lett.24:4401-4404,1983(-C(OH)CH2-)；和Hruby,Life Sci.31:189-199,1982(-CH2-S-)；将其中每个通过引用并入本文。特别优选的非肽键是-CH2NH-。应当理解，肽类似物在键原子之间可以具有多于一个原子，诸如(1-丙氨酸、-y-氨基丁酸等。

氨基酸类似物和类似物以及肽类似物通常具有增强的或希望的特性，诸如更经济的生产、更大的化学稳定性、增强的药理特性(半衰期、吸收、效力、功效等)、改变的特异性(例如，广谱的生物活性)、降低的抗原性等。

D-氨基酸可以用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸不被肽酶及此类识别。用相同类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸的系统性取代(例如，D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可以用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化两个或更多个肽或将其附接在一起。这对于将肽限制为特定构象可能是有益的。(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387,1992，将其通用引用并入本文)。

酶的使用

本文描述了用于酯化羧酸的方法，其包括在本文所述的任何酶的存在下使羧酸与醇反应。在另一方面，本文描述了用于酯交换酯的方法，其包括在本文所述的任何酶的存在下使酯与醇反应。在仍另一方面，本文描述了用于使两种或更多种不同羧酸或其酯进行酯交换的方法，其包括在本文所述的任何酶的存在下使羧酸或酯彼此反应。在又仍另一方面，本文描述了用于使包含至少两个酯基的化合物或包含至少一个羧酸基和一个酯基的化合物进行酯内化的方法，其包括使所述化合物与本文所述的任何酶接触。以下示出了将乙酯(EE)酯交换成甘油三酯或将游离脂肪酸(FFA)酯化成甘油三酯的示意图。

尽管使用本文所述的方法考虑了任何羧酸的酯化、任何酯的酯交换、两种或更多种不同羧酸/酯的酯交换、或化合物的酯内化，但是在许多例子中，脂肪酸或其酯可以用于任何方法中。在某些例子中，脂肪酸的酯是C₁-C₆支链或直链烷基酯，例如像甲基、乙基、丙基、丁基、戊基等。

在其他具体例子中，脂肪酸或其酯可以用于本文所述的方法中。“脂肪酸”意指具有至少10个碳原子的羧酸。在一方面，脂肪酸或其酯可以包含至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、或至少20个碳原子。在一些具体例子中，脂肪酸或其酯可以含有10、11、12、13.、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45个碳原子，其中在适当时所陈述的任何值可以形成上限或下限端点。在其他例子中，脂肪酸或其酯可以包含具有一定碳原子范围的脂肪酸或其酯的混合物。例如，脂肪酸或其酯可以包含从约10至约40、从约12至约38、从约14至约36、从约16至约34、从约18至约32、或从约20至30个碳原子。

脂肪酸或其酯可以是饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物。“饱和的”意指分子或残基不含碳-碳双键或三键。“不饱和的”意指分子或残基含有至少一个碳-碳双键或三键。

在一个具体例子中，在酯化之前，脂肪酸或其酯可以源自海洋油，诸如鱼油。此类油典型地含有饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物，但是可以加工成特定的脂肪酸混合物(例如，含有所有饱和脂肪酸、所有不饱和脂肪酸、两者的混合物，或具有一定链长或一定链长范围的脂肪酸的混合物)。

任何鱼油可以用于所公开的化合物和方法中。合适的鱼油的例子包括但不限于大西洋鱼油、太平洋鱼油、地中海鱼油、轻压鱼油、碱处理的鱼油、热处理的鱼油、轻质和重质棕色鱼油、鲣鱼油、皮尔彻德鱼(pilchard)油、金枪鱼油、海鲈鱼油、大比目鱼油、旗鱼油、梭鱼油、鳕鱼油、鲱鱼(menhaden)油、沙丁鱼油、鳀鱼油、毛鳞鱼油、大西洋鳕鱼油、大西洋鲱鱼(herring)油、大西洋鲭鱼油、大西洋鲱鱼(menhaden)油、鲑鱼油、和鲨鱼油，包括其混合物和组合。非碱处理的鱼油也是合适的。适用于本文的其他海洋油包括但不限于鱿鱼油、墨鱼油、章鱼油、磷虾油、海豹油、鲸油等，包括其混合物和组合。任何海洋油和海洋油的组合可以用于所公开的组合物和所公开的其制备方法中。另外的油包括微生物油、海藻油(例如，来自甲藻(dinoflagellate)(诸如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii))的油，或例如，来自壶菌属(Thraustochytrium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)的油，或其混合物)、真菌油(例如，来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的油)、和/或植物油，包括其混合物和组合。

可用于本文的特定饱和脂肪酸或其酯的例子包括但不限于癸酸(C10)、月桂酸(C12)、肉豆蔻酸(C14)、棕榈酸(C16)、十七烷酸(C17)、硬脂酸(C18)、花生酸(C20)、山嵛酸(C22)、二十四烷酸(C24)、蜡酸(C26)、褐煤酸(C28)、和蜂花酸(C30)，包括其支化和取代的衍生物。

适用于本文公开的方法的不饱和脂肪酸或其酯可以包含至少一个不饱和键(即，碳-碳双键或三键)。在一个例子中，不饱和脂肪酸或其酯可以包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10个碳-碳双键、三键或其任何组合。在另一个例子中，不饱和脂肪酸或其酯可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个不饱和键，其中所陈述的任何值可以在适当时形成上限或下限端点。

在一个例子中，不饱和脂肪酸或其酯可以包含一个碳-碳双键(即，单烯酸或残基)。适用于本文公开的方法的不饱和脂肪酸或其酯的例子包括但不限于下表1中的那些。

表1：单烯酸的例子

在其他例子中，不饱和脂肪酸或其酯可以包含至少两个不饱和键(例如，多烯酸或残基)。在一些例子中，不饱和脂肪酸或其酯可以包含至少一对亚甲基间断的不饱和键。“亚甲基间断的不饱和键”意指一个碳-碳双键或三键与另一个碳-碳双键或三键被至少一个亚甲基(即，CH₂)分开。含有至少一对亚甲基间断的不饱和键的不饱和脂肪酸或其酯的具体例子包括但不限于源自9、12、15-16:3的n-1家族；源自9、12、15-17:3，15:3，17:3，17:4，20:4的n-2家族；源自9、12、15-18:3，15:2，15:3，15:4，16:3，16:4，18:3(α-亚麻酸)，18:4，18:5，20:2，20:3，20:4；20:5(EPA)，21:5，22:3，22:5(DPA)，22:6(DHA)，24:3，24:4，24:5，24:6，26:5，26:6，28:7，30:5的n-3家族；源自9，12-16:2，16:2，16:3，18:2，18:3的n-4家族；源自9、12-17:2，15:2，17:2，17:3，19:2，19:4，20:3，20:4，21:4，21:5的n-5家族；源自9、12-18:2，15:2，16:2，18:2(亚油酸)，18:3(γ-亚麻酸)；20:2，20:3，20:4(花生四烯酸)，22:2，22:3，22:4(肾上腺酸)，22:5，24:2，24:4，25:2，26:2，30:4的n-6家族；源自9-16:1，15:2，16:2，17:2，18.:2，19:2的n-7家族；源自9-17:1，15:2，16:2，17:2，18:2，19:2的n-8家族；源自9-18:1，17:2，18:2，20:2，20:3，22:3，22:4的n-9家族；n-11家族19:2，和n-12家族20:2。

编号方案开始于脂肪酸的末端，其中例如在末端CH3基团被指定为位置1。在此意义上，n-3家族将是如本文所述的ω-3脂肪酸。下一个数字标识脂肪酸中碳原子的总数。在冒号后的第三个数字指定脂肪酸中双键的总数。因此，例如，在n-1家族中，16:3是指具有3个双键的16个碳长的脂肪酸，每个双键被亚甲基分开，其中第一个双键开始于位置1，即脂肪酸的末端。在另一个例子中，在n-6家族中，18:3是指具有3个亚甲基分开的双键的18个碳长的脂肪酸，所述双键开始于位置6，即从脂肪酸的末端开始的第六个碳，等等。

一些其他例子是含有被多于一个亚甲基间断的至少一对不饱和键的脂肪酸或其酯。这些酸和酯的合适例子包括但不限于下表2中的那些：

表2：多烯酸的例子

适用于本文公开的方法的不饱和脂肪酸或其酯的仍其他例子是含有至少一个共轭不饱和键的那些。“共轭不饱和键”意指至少一对碳-碳双键和/或三键键合在一起，而它们之间没有亚甲基(CH₂)基团(例如，-CH＝CH-CH＝CH-)。含有共轭不饱和键的不饱和脂肪酸或其酯的具体例子包括但不限于下表3中的那些。

表3：共轭多烯酸的例子

ω-3脂肪酸及其酯也可用于本文所述的方法。ω-3脂肪酸是在本文公开的化合物和方法中特别有用的不饱和脂肪酸。ω-3脂肪酸不仅展现出已证明的降低血清甘油三酯水平的作用，而且它们与糖尿病具有强的联系。例如，二十二碳六烯酸(DHA)也具有强的胰岛素渗透性增强作用，并且其被视为是用于经肠递送胰岛素的潜在吸收增强剂(Onuki等人,Int.J.Pharm.198:147-56,2000)。DHA摄入会预防某些生物化学过程，所述生物化学过程起源于胰岛素缺乏(Ovide-Bordeaux and Grynberg,Am.J.Physiol.Regul.lntegr.Comp.Physiol.286:R519-27,2003)，并且DHA和BPA(二十碳五烯酸)两者显著增加空腹胰岛素水平(Mori等人,Am.J.Clin.Nutr.71:1085-94,2000)。

ω-3脂肪酸是不饱和脂肪酸，其含有CH₃-CH₂-CH＝CH-作为其末端。适用于本文的ω-3脂肪酸及其酯的具体例子包括但不限于亚麻酸(18:3ω3)、十八碳四烯酸(18:4ω3)、二十碳五烯酸(20:5ω3)(EPA)、二十二碳六烯酸(22:6ω3)(DHA)、二十二碳五烯酸(22:6ω3)(DPA)、其衍生物及其混合物。

在仍其他例子中，不饱和脂肪酸及其酯可以源自具有下式的化合物：

其中R¹是包含至少一个双键的C₃-C₄₀烷基或烯基。如本文所用的术语“烷烃”或“烷基”是饱和烃基。如本文所用的术语“烯烃”或“烯基”是至少2个碳原子的烃基，其结构式含有至少一个碳-碳双键。诸如(AB)C＝C(CD)的不对称结构旨在包括E和Z异构体(顺式和反式)两者。这可以在其中存在不对称烯烃的本文结构式中推测，或者它可以由键符号C＝C明确指示。在另一个例子中，R¹可以是C₅-C₃₈、C₆-C₃₆、C₈-C₃₄、C₁₀-C₃₂、C₁₂-C₃₀、C₁₄-C₂₈、C₁₆-C₂₆、或C₁₈-C₂₄烯基。在又另一个例子中，R¹的烯基可以具有从2至6、从3至6、从4至6或从5至6个双键。再进一步，R¹的烯基可以具有1、2、3、4、5、或6个双键，其中所陈述的任何值可以在适当时形成上限或下限端点。

可用于本文公开的方法中的不饱和脂肪酸及其酯的一些具体例子包括但不限于亚油酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸、米德酸(mead acid)、硬脂四烯酸(stearidonicacid)、α-桐酸、桐酸、皮诺敛酸(pinolenic acid)、二十二碳二烯酸(docosadienic acid)、二十二碳四烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、十八碳二烯酸、十八碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、或其任何组合。在一个方面，不饱和脂肪酸酯可以源自亚麻酸(18:3ω3)、十八碳四烯酸(18:4ω3)、二十碳五烯酸(20:5ω3)(EPA)、二十碳四烯酸(20:4ω3)、二十一碳五烯酸(21:5ω3)、二十二碳六烯酸(22:6ω3)(DHA)、二十二碳五烯酸(22:5ω3)(DPA)，包括其衍生物和混合物。

适用于所述方法的合适的不饱和脂肪酸及其酯的另外例子包括但不限于连二烯酸(allenic)和炔酸，诸如C14:2、4、5；C18:5、6(十八碳二烯酸(laballenic))；5、6、16(十八碳三烯酸(lamenallenic))；C18:6a(tarinic)；9a；9a、11t(西门木炔酸)；9a、11a；9a、11a、13c(bolekic)；9a、11a、13a、15e、8a、10t(pyrulic)9c、12a(还阳参油酸(crepenynic))；9c、12a、14c(脱氢还阳参油酸(dehydrocrepenynic acid))；6a、9c、12c；6a、9c、12c、15c、8a、11c、14c和相应的Δ17e衍生物、8-OH衍生物、和Δ17e,8-OH衍生物。

支链酸及其酯，特别是异酸和反异式(anteiso)酸、聚甲基支链酸、基于植醇的酸(例如，植烷酸、降植烷酸(pristanic))、呋喃类酸，也是适用于本文公开的方法的脂肪酸。

再进一步，合适的脂肪酸及其酯包括但不限于环酸，诸如环丙烷脂肪酸、环丙烯酸(例如，乳杆菌酸(lactobacillic))、苹婆酸(sterulic)、锦葵酸(malvalic)、苹婆炔酸(sterculynic)、2-羟基苹婆酸、阿立普诺酸(aleprolic)、alepramic、阿立普里斯酸(aleprestic)、阿立普里酸(aleprylic)阿立普酸(alepric)、次大风子油酸(hydnocarpic)、大风子油酸(chaulmoogric)hormelic、manaoic、蒜酸(garlic)、oncobic、环戊烯酸、和环己基烷酸。

羟基酸及其酯，特别是丁酸、蓖麻油酸、异蓖麻油酸、densipolic、lesquerolic和auriolic，也是在酯化后可用于本文公开的方法的合适脂肪酸。

环氧酸和酯(特别是环氧化C18:1和C18:2)以及呋喃类酸和酯是可用于所公开的方法的另外例子。

在一些实施方案中，包含至少一种呈乙酯形式的多不饱和脂肪酸、游离脂肪酸和/或其组合的油是二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、或其组合。

在一些实施方案中，包含至少一种呈乙酯形式的多不饱和脂肪酸、游离脂肪酸和/或其组合的油中DHA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在一些实施方案中，包含至少一种呈乙酯形式的多不饱和脂肪酸、游离脂肪酸和/或其组合的油中EPA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在一些实施方案中，包含至少一种呈乙酯形式的多不饱和脂肪酸、游离脂肪酸和/或其组合的油中DHA(mg/g油)和EPA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在一些实施方案中，所产生的甘油二酯中所述油中的DHA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在一些实施方案中，所产生的甘油二酯中所述油中的EPA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在一些实施方案中，所产生的甘油二酯中所述油中的DHA(mg/g油)和EPA(mg/g油)的量是从约100mg至约950mg、约100mg至约800mg、约100mg至约700mg、约100mg至约600mg、约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、或约0至约100mg。

在本文公开的任何方法中使用的醇可以是任何醇。在一个例子中，所述醇是多元醇，其被定义为具有两个或更多个羟基的化合物。本文可用的多元醇的例子包括但不限于季戊四醇、二季戊四醇、三季戊四醇、四季戊四醇、三(羟甲基)乙烷、或三(羟甲基)丙烷。在其他例子中，所述醇是糖，例如像葡糖胺、甲基葡糖苷；或其他糖，例如像蔗糖。在另一个例子中，所述多元醇是甘油。

所使用的羧酸/酯和醇的量将根据所选择的酸、酯和醇而变化。在一个例子中，可以使用相对于醇上存在的羟基数化学计量量的羧酸或酯。例如，如果所述醇是二醇，则可以用一摩尔当量的二醇分别酯化或酯交换两摩尔当量的羧酸或酯。可以使用过量的醇来实现最大酯化或酯交换以及减少总反应时间。在一方面，当所述醇是甘油时，羧酸或酯与醇的摩尔比是从0.1:1至6:1、从1:1至3:1、从1.5:1至2.5:1、或从2:1至3:1。

酶的量也可以变化。在一个例子中，所述酶是占羧酸/酯和醇的总重量的按重量计从0.1％至20％。在其他例子中，所述酶是按总反应重量计0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16；17％、18％、19％、20％，其中任何值可以形成范围的端点。

水的量也可以变化。在一个例子中，羧酸/酯与水的比率是从1:1至15:1、从1:1至12:1、从1:1至10:1、从1:1至9:1、从1:1至8:1、从1:1至7:1、从1:1至6:1、从1:1至5:1、从1:1至4:1、从1:1至3:1、或从1:1至2:1。在另一个例子中，羧酸/酯与水的比率是从1:1至15:1、从2:1至15:1、从3:1至15:1、从4:1至15:1、从5:1至15:1、从6:1至15:1、从7:1至15:1、从8:1至15:1、从9:1至15:1、从10:1至15:1、或从12:1至15:1。

羧酸/酯、醇、酶和水可以以任何顺序彼此混合。取决于羧酸/酯和醇的选择，可能希望在搅拌反应混合物的同时进行酯化或酯交换。例如，可以在搅拌下将酯和醇的溶液向彼此中添加，然后添加酶。

在一方面，在反应期间添加水以替代由于蒸发等而损失的水。在整个反应持续期间，可以连续或不定期地添加水。例如，可以在反应体积降至预定阈值以下时添加水。可以在整个反应期间或在反应的一部分期间添加水。例如，可以在反应开始期间添加水并且在反应后期中止；例如，可以在反应的第一个四分之一、第一个三分之一或第一半期间添加水。

在某些方面，酯化、酯交换、和相互酯化/酯内化反应可以在升高的温度下进行。精确的升高的温度可以取决于所使用的特定羧酸或酯、所使用的特定醇、试剂的量或浓度、优选项等。可以发生酯化和酯交换反应的合适温度包括但不限于从约30℃至约90℃、从约60℃至约90℃、从约80℃至约90℃、或约85℃。

在另一个例子中，酯化温度可以是从约50℃至约70℃、或约60℃。通过改变温度，可以根据起始材料的浓度减少反应时间。因此，反应时间可以从2小时至72小时、2小时至48小时、2小时至24小时、6小时至48小时、6小时至36小时、8小时至24小时、8小时至16小时、或8小时至12小时变化。

酯化、酯交换、和相互酯化/酯内化反应可以在减压下进行。例如，酯化、酯交换、和相互酯化/酯内化反应可以在从约1毫托至约200毫托、从约5毫托至约100毫托、从约10毫托至约50毫托、从约15毫托至约30毫托、或约20毫托的压力下进行。

在其他例子中，所述方法涉及将二十碳五烯酸20:5ω3(EPA)、二十二碳六烯酸22:6ω3(DHA)、二十二碳五烯酸22:5ω3(DPA)或其任何混合物与甘油酯化，其中所述酸和醇以从约1:1至约3:1的摩尔比存在，其中将反应在酶和水的存在下在从约30℃至约90℃的温度下在减压下搅拌约2小时至约24小时，其中所述酶包括源自南极假丝酵母的酶。

在另一方面中，所述方法涉及将二十碳五烯酸20:5ω3(EPA)、二十二碳六烯酸22:6ω3(DHA)、二十二碳五烯酸22:5ω3(DPA)或其任何混合物的乙酯与甘油酯化进行酯交换，其中所述酯和醇以从约1:1至约3:1的摩尔比存在，其中将反应在酶和水的存在下在从约30℃至约90℃的温度下在减压下搅拌约2小时至约24小时，其中所述酶包括源自南极假丝酵母的酶。

对于主要生产二酰基甘油同时形成非常少三酰基甘油而言，本文所述的方法是有效的。由于可以容易地去除(例如通过蒸馏)任何剩余的乙酯、单酰基甘油和游离脂肪酸，可以使用此方法获得高纯二酰基甘油。另外，二酰基甘油的占总产物的百分比的量是从约80％至约100％；任选地从约90％至约100％；任选地从约95％至约100％；任选地从约96％至约100％；任选地从约96.5％至约100％；任选地从约97％至约100％；任选地从约97.5％至约100％；任选地从约98％至约100％；任选地从约98.5％至约100％；任选地从约99％至约100％；任选地从约99.5％至约100％。

用于将单酰基甘油、游离脂肪酸和残余三酰基甘油与二酰基甘油分离的分离方法包括但不限于除臭、短程蒸馏、蒸汽蒸馏、分子蒸馏、吸附色谱法或其任何组合。所述分离方法可以分批、连续和半连续进行。

可以进一步加工所得产物。还可以例如通过添加a-生育酚来稳定精制产物。

提供以下实施例旨在说明但不限制要求保护的发明。

实施例

实施例1

二十碳五烯酸(EPA)/二十二碳六烯酸(DHA)-二酰基甘油酯(DAG)的制备

通过一锅法水解，然后在来自南极假丝酵母(CAL-B)的脂肪酶B的存在下在减压下再酯化来促进从高浓度乙酯制备二酰基甘油。

向装配有浓缩器冷凝器的1L烧瓶中添加ω-3浓缩乙酯(EPA：439mg/g；DHA：405mg/g；300g)、甘油(60g)和CAL-B(5000LU/g，1.9g)在水(75.0g)中的混合物，并且在真空(20毫托)下在60℃下搅拌8-12小时。在前4-6小时内，以15ml/h的速率替换水。

完成后，将反应混合物用水(45℃，300ml)洗涤，然后进行盐水洗涤(45℃，300ml)和最后的水洗涤(45℃，300ml)。将混合物在高真空(100毫托)下在大约65℃的温度下干燥过夜(12-15小时)。通过短程蒸馏(200℃，100毫托)去除未反应的乙酯、生成的单酰基甘油酯、和其他低沸点组分。通过在90℃下漂白处理2小时来进一步加工所得残余物。通过添加500ppmα-生育酚来稳定精制产物，并且分别分析最终配制品的脂肪酸(用火焰离子化检测器的气相色谱法，GC-FID)和脂质类组合物(h高效液相色谱法-尺寸排阻色谱法-折射率检测器，HPLC-SEC-RI)。

最终产物组成是以49.6％的产率获得的96.5％DAG，其中PV＝0.1和pAV＝4.2。DAG部分中EPA的量是453mg/g，并且DAG部分中DHA的量是370mg/g。

实施例2

二十碳五烯酸(EPA)/二十二碳六烯酸(DHA)-二酰基甘油酯(DAG)的制备

通过一锅法水解，然后在来自南极假丝酵母(CAL-B)的脂肪酶B的存在下在减压下再酯化来促进从高浓度乙酯制备二酰基甘油。

添加50g的ω-3浓缩乙酯(EPA：380mg/g和DHA：260mg/g)、甘油(4.5g)和CAL-B(0.5％，0.25ml-反应A和0.25％，0.125ml-反应B)在水(10ml)中的混合物并且在真空(20毫托)下在65℃下搅拌。2小时和4小时后，向每种反应中添加5ml水。6小时后，向每种反应中添加10ml水。将反应搅拌过夜。24小时后，向每种反应中添加10ml水，并且在真空下继续。在30小时停止反应。

完成后，分析油的脂质类组成(LC-SEC-RI)。表4和5示出了脂质类别组成的结果。

表4：脂质类组成，反应A

表5：脂质类组成，反应B

在反应A中，在24小时后，样品中TG的量是0％。在反应B中，起始油中不存在TG。短程蒸馏去除未反应的乙酯、所生成的单酰基甘油酯、和其他低沸点组分，如实施例1所示。

实施例3

二十碳五烯酸(EPA)/二十二碳六烯酸(DHA)-二酰基甘油酯(DAG)的制备

通过一锅法水解，然后在来自南极假丝酵母(CAL-B)的脂肪酶B的存在下在减压下再酯化来促进从高浓度乙酯制备二酰基甘油。

添加200g的ω-3浓缩乙酯(1:1EPA:DHA)、甘油(14g)和CAL-B(2ml)在水(55ml)中的混合物并且在真空(20毫托)下在69℃下搅拌。在1-7小时添加5-35ml量的水。完成后，分析油的脂质类组成(LC-SEC-RI)。表6示出了脂质类别组成的结果。

表6：脂质类组成

样品中TG的量是0％。短程蒸馏去除未反应的乙酯、所生成的单酰基甘油酯、和其他低沸点组分，如实施例1所示。

实施例4

二十碳五烯酸(EPA)/二十二碳六烯酸(DHA)-二酰基甘油酯(DAG)的制备

通过一锅法水解，然后在来自南极假丝酵母(CAL-B)的脂肪酶B的存在下在减压下再酯化来促进从高浓度乙酯制备二酰基甘油。

添加200g的ω-3浓缩乙酯(1:1EPA:DHA)、甘油(16g)和CAL-B(1ml)在水(55ml)中的混合物并且在真空(20毫托)下在69℃下搅拌。在1-7小时添加5-35ml量的水。完成后，分析油的脂质类组成(LC-SEC-RI)。表7示出了脂质类别组成的结果。

表7：脂质类组成

样品中TG的量是0％。短程蒸馏去除未反应的乙酯、所生成的单酰基甘油酯、和其他低沸点组分，如实施例1所示。

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