牛血清白蛋白的制备方法

文档序号：871267 发布日期：2021-03-19 浏览：5次 >En<

阅读说明：本技术 牛血清白蛋白的制备方法 (Preparation method of bovine serum albumin ) 是由王萍赵巧辉吕庆生包金芝李桂林付光宇吴学炜于 2020-12-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,尤其涉及牛血清白蛋白的制备方法。本发明提供的BSA的制备方法中,包括：血清稀释、第一步提取、第二步提取、洗滤浓缩几个步骤。实验表明,采用本发明提供的方法在适宜的参数下,能够获得良好的提取效果,不仅收率较高,并且批间差异小,降低了化学残留,提高了抗干扰能力,所得产品作为检测试剂的关键辅料蛋白,能够显著降低检测试剂的非特异性吸附。(The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a preparation method of bovine serum albumin. The preparation method of BSA provided by the invention comprises the following steps: serum dilution, first extraction, second extraction, washing, filtering and concentration. Experiments show that the method provided by the invention can obtain a good extraction effect under appropriate parameters, the yield is high, the batch-to-batch difference is small, the chemical residue is reduced, the anti-interference capability is improved, and the obtained product is used as a key auxiliary material protein of the detection reagent, so that the non-specific adsorption of the detection reagent can be remarkably reduced.)

牛血清白蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及牛血清白蛋白的制备方法。

背景技术

牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)，是牛血清中的主要蛋白成分，分子量66-68KD，等电点4.7，由583个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一个自由巯基；BSA含氮量16％，含糖量0.08％(仅含已糖和已糖胺)，含脂量只有0.2％。BSA又称为组分V，或Cohn V，名称起源于BSA最早的分馏法—Cohn冷乙醇法，Cohn冷乙醇法最早是由哈佛大学Edwi Cohn教授于1946年发明的，当时基于战争创伤治疗对注射级别蛋白的大规模需求，Cohn教授在较低的温度下改变血浆的乙醇浓度和pH值，使其所含蛋白在不同乙醇浓度下析出，在第五个析出的组分中主要成分为BSA，所以BSA又称组分V或CohnV，Cohn法仍然是目前非常普遍的BSA分馏法。除了冷乙醇法外，目前常用的提取方法还有硫酸铵盐析法，色谱层析法，直接加热法，利凡诺法等。

成年牛血清中BSA含量约55％，胎牛和新生牛BSA含量约70％，但考虑到原料来源和动物保护法等原因，BSA的提取主要是以成年牛血清为原料进行。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用。鉴于BSA上述功能，其在生化试验、遗传工程、医药研究和体外诊断试剂中的应用越来越广泛：①由于蛋白质在低浓度下不稳定或活性较低，加入一定量的BSA可以起到“保护”或“载体”作用，降低目标蛋白的分解，维持其正确的空间结构，某些情况下甚至可进一步提高目标蛋白的活性；②BSA是酶的稳定剂，可以防止酶的分解和非特异性吸附；③在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用；④在诊断试剂上可作为酶结合物、校准品/标准品/质控品、阴/阳性对照品稀释液的主要蛋白，提供生理缓冲条件，同时对目标蛋白起到保护作用，但不参与反应。

BSA广泛的应用于诊断试剂领域，但目前不同厂家的制备工艺不同可造成产品特性不同，甚至同一厂家不同批次的BSA都存在明显差异，主要表现为：外观颜色不同、纯度不同、溶液中颗粒度不同等，因此导致在以BSA作为辅料蛋白的产品中性能存在明显差异，例如存在特异性差，本底高和稳定性差等问题，难以满足临床需求。

发明内容

鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种纯度高、批间差异小的牛血清白蛋白的制备方法。

本申请牛血清白蛋白的制备方法，其特征在于：包括：

血清稀释：将牛血清或牛血浆稀释至蛋白浓度为40～45mg/ml；

第一步提取：在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.5‰～4‰，边加入边搅拌，然后调节pH值至5.8～6.8，加热至65～70℃保温4h，冷却至室温放置12～16h，然后分离上清液A；

第二步提取：在上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2‰～2.5‰，边加入边搅拌；然后调节pH值至5.0～5.5，加热65～70℃保温2h，冷却至室温放置12～16h，然后分离上清液B；

洗滤浓缩：调节上清液B的pH值至7.0～7.5，过滤、浓缩至蛋白浓度为150～180mg/ml后，经冷冻干燥获得牛血清白蛋白。

本发明中，所述血清稀释步骤中：所述牛血清或牛血浆为成年牛的血清或血浆；所述稀释采用经0.22μm过滤的纯化水。

本发明中，所述牛血清或牛血浆为新鲜血清、血浆或者为冷藏后解冻的血清、血浆。本发明对此不做限定，采用本发明提供的方法皆能够获得纯度高、批间差异小的BSA。

本发明中，所述第一步提取为，在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.75‰～3.8‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至6.25～6.60，加热至68～70℃，200rpm搅拌、保温4h；冷却至室温放置13～15h，10000rpm离心分离上清液A。

一些实施例中，所述第一步提取为，在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.8‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至6.25，加热至68℃，200rpm搅拌、保温4h；冷却至室温放置13h，10000rpm离心分离上清液A；

另一些实施例中，所述第一步提取为，在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.75‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至6.35，加热至69.8℃，200rpm搅拌、保温4h；冷却至室温放置15h，10000rpm离心分离上清液A；

另一些实施例中，所述第一步提取为，在稀释后的血清中加入辛酸钠至质量分数为3.8‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至6.60，加热至68℃，200rpm搅拌、保温4h；冷却至室温放置15h，10000rpm离心分离上清液A。

在本发明中，所述第二步提取中，在上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2.1‰～2.2‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至5.15～5.65，加热至68.5～69.5℃保温2h，冷却至室温放置12～13.5h，10000rpm离心分离上清液B。

一些实施例中，所述第二步提取为，在上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2.2‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至5.15，加热至69.5℃，200rpm搅拌、保温2h，冷却至室温放置12h，10000rpm离心分离上清液B；

另一些实施例中，所述第二步提取为，上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2.1‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至5.35，加热至69℃，200rpm搅拌、保温2h，冷却至室温放置13h，10000rpm离心分离上清液B；

另一些实施例中，所述第一步提取为，在上清液A中加入辛酸钠至质量分数为2.15‰，边加入边100rpm搅拌；然后调节pH值至5.65，加热至68.5℃，200rpm搅拌、保温2h，冷却至室温放置13.5h，10000rpm离心分离上清液B。

在本发明的第一步提取和第二步提取中，最大限度的去除了杂质和干扰物，获得纯度较高的BSA；通过对各个加工环节进行精细化控制，降低成本的同时保障了批次间差异，且可实现工业化流程控制。

本发明所述洗滤浓缩步骤中，调节上清液B的pH值至7.25～7.40，经过滤、浓缩至蛋白浓度为165～172mg/ml。

本发明中，所述洗滤浓缩步骤为，调节上清液B的pH值至7.40，经0.22μm过滤、10kDa超滤浓缩至蛋白浓度为166mg/ml；

或调节上清液B的pH值至7.25，经0.22μm过滤、10kDa超滤浓缩至蛋白浓度为165mg/ml；

或调节上清液B的pH值至7.35，经0.22μm过滤、10kDa超滤浓缩至蛋白浓度为172mg/ml。

在提取结束后，本发明通过对血红蛋白残留检测、含水量测定、水溶液渗透压测定、酶标抗体非特异性吸附抑制作用验证，五个质控检测的步骤，来验证制备获得的BSA是否合格。本发明提供方法简单、易行，容易实现大规模生产。有效减少批间差异；根据牛血清中各种蛋白的特点，采用梯度PH处理的方式进行两步处理可得纯度较高的BSA；本方案用的PH相较其它工艺偏高，避免达到白蛋白等电点，可获得较高的回收率，同时避免蛋白变性产生较高的聚集体；通过建立BSA血红蛋白残留检测方法，有效的降低了血红蛋白对辣根过氧化物酶的干扰能力；通过建立含水量检测标准，可有效防止BSA存放过程中腐败或长菌问题；通过建立渗透压检测标准，可有效控制洗滤浓缩后辛酸钠等化学试剂残留程度；建立BSA对酶标抗体非特异性吸附能力验证方案，可有效降低应用过程中的本底问题。

本发明所述制备方法制得的牛血清白蛋白。

本发明所述制备方法制得的牛血清白蛋白在制备试剂中的应用。

本发明提供的BSA的制备方法中，包括：血清稀释、第一步提取、第二步提取、洗滤浓缩几个步骤。实验表明，采用本发明提供的方法在适宜的参数下，能够获得良好的提取效果，不仅收率较高，并且批间差异小，降低了化学残留，提高了抗干扰能力，所得产品作为检测试剂的原料，能够显著降低检测试剂的非特异性吸附。

附图说明

图1是本发明的工艺流程图；

图2是不同实施例制备的BSA电泳对比图(10％SDS-PAGE)；

图3是本发明制备的BSA与其它厂家BSA的HPLC对比图，可以看出本发明制备的BSA纯度明显优于其它厂家；

图4是本发明使用的100L双层玻璃反应釜；

图5是本发明使用的管式离心机；

图6是本发明是使用的超滤系统。

具体实施方式

本发明提供了牛血清白蛋白的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所述的诊断试剂用牛血清白蛋白热法提取工艺包括以下步骤：

(1)血清稀释：取出去纤维蛋白的成年牛血清室温解冻，加入0.22um过滤后的纯化水稀释至蛋白浓度40-45mg/ml(A280nm紫外光吸收法)；

(2)第一步提取：稀释后的血清中加入3.5‰-4‰的辛酸钠固体，边加入边搅拌至充分混匀；逐滴加入1M稀盐酸调节PH值至6.0-6.5，加温65-70℃保温4h，冷却至室温后放置12-16h，采用管式分离机分离去沉淀，上清保留备用；

(3)第二步提取：在第一步收集的上清中补加2‰-2.5‰辛酸钠固体，边加入边搅拌至充分混匀；逐滴加入1M稀盐酸调节PH至5.0-5.5，加热65-70℃保温2h，冷却至室温后放置12-16h，采用管式分离机分离去沉淀，上清保留备用；

(4)洗滤浓缩：将第二步收集的上清用1M NaOH调节PH值至7.0-7.5，用0.22um板框过滤器过滤除菌，再用10KD超滤循环系统超滤浓缩至蛋白浓度150-180mg/ml(A280nm紫外光吸收法)；

(5)冷冻干燥：用东富龙7.5m²冻干机进行冷冻干燥至块状晶体，晶体粉碎后分装贴签即为成品。

(6)血红蛋白残留检测：取出96孔酶标板，加入20ul的6％BSA水溶液，再依次加入酶免底物液50ul、酶免显色液各50ul，充分震荡混合后，37℃反应10min后取出，在酶标仪波长650nm进行读数，OD₆₅₀≤0.1视为合格；

(7)含水量测定：取出1g BSA冻干品，置于智能水分分析仪进行分析，含水量≤5％视为合格；

(8)水溶液渗透压测定：取6％BSA水溶液，用渗透压测定仪进行分析，渗透压≤20mosm/kg视为合格；

(9)酶标抗体非特异性吸附抑制作用验证：配制20mMPBS缓冲液，加入3％的BSA冻干品配置成酶标抗体稀释液，按TSH酶标抗体(或其它项目酶标抗体)与酶标抗体稀释液1：2000的比例配置成酶结合物，取96孔空白发光板，加入100ul的酶结合物，37℃反应30min，用化学发光仪检测信号值，发光信号值≤50视为合格。

所述的血清稀释步骤中，成年牛血清需用纯化水稀释至蛋白浓度在40-45mg/ml(A280nm紫外光吸收法)。

所述的第一步提取时辛酸钠添加比例为3.5‰-4‰，保温前PH调节至6.0-6.5，65-70℃保温时长4h，沉淀分离前需冷却至室温12-16h。

所述的第二步提取时辛酸钠添加比例为2‰-2.5‰，保温前PH调节至5.0-5.5，65-70℃保温时长2h。

所述的洗滤浓缩过程，上清PH值需调至7.0-7.5，过滤除菌后用10KD超滤循环系统超滤浓缩至蛋白浓度150-180mg/ml(A280nm紫外光吸收法)。

本发明的优点在于加工处理前对来料牛血清均进行质检后确定总浓度，每批次加工处理前均按标准操作程序调整至适当浓度范围再进行加工，有效减少批间差异；根据牛血清中各种蛋白的特点，采用梯度PH处理的方式进行两步处理可得纯度较高的BSA；本方案用的PH相较其它工艺偏高，避免达到白蛋白等电点，可获得较高的回收率，同时避免蛋白变性产生较高的聚集体；通过建立BSA血红蛋白残留检测方法，有效的降低了血红蛋白对辣根过氧化物酶的干扰能力；通过建立含水量检测标准，可有效防止BSA存放过程中腐败或长菌问题；通过建立渗透压检测标准，可有效控制洗滤浓缩后辛酸钠等化学试剂残留程度；建立BSA对酶标抗体非特异性吸附能力验证方案，可有效降低应用过程中的本底问题。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(1)血清稀释：从-20℃冷库提前一天取出冷冻的成年牛血清，至室温进行解冻，至18.5h完全解冻，取所需要量的成年牛血清，通过蠕动泵导入100L双层玻璃反应釜中，用0.22um过滤后的纯化水稀释至蛋白浓度41.5mg/ml(A280nm紫外光吸收法)；

(2)第一步提取：稀释后的血清中加入3.75‰的辛酸钠固体，边加入边搅拌至充分混匀，玻璃反应釜搅拌转速控制在100rpm；逐滴加入1M稀盐酸调节PH值至5.90，加温67.5℃保温4h，加热过程反应釜转速控制在200rpm；保温结束后关闭反应釜，反应液冷却至室温后放置12h；用蠕动泵将反应液导入管式分离机，采用10000rpm转速进行离心，分离除沉淀，上清保留备用；

(3)第二步提取：第一步收集的上清重新导入清洁后的反应釜中，补加2.1‰酸钠固体，边加入边搅拌至充分混匀，玻璃反应釜搅拌转速控制在100rpm；逐滴加入1M稀盐酸调节PH至4.85，加热68.5℃保温2h，加热过程反应釜转速控制在200rpm；保温结束后关闭反应釜，反应液冷却至室温后放置14h；用蠕动泵将反应液导入管式分离机，采用10000rpm转速进行离心，分离除沉淀，上清保留备用；

(4)洗滤浓缩：将第二步收集的上清用1M NaOH调节PH值至7.25，用0.22um板框过滤器过滤除菌，再用10KD超滤循环系统先将上清浓缩至158mg/ml，倍比洗滤3次，如不能及时进行冷冻干燥，可于-20℃冻存备用；