拟南芥tir2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用
阅读说明：本技术 拟南芥tir2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用 (Application of arabidopsis TIR2 gene in improving salt stress resistance of plants ) 是由 黄金光 蔡慧娴 郑成超 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。所述TIR2基因的互作蛋白包括IAA4和IAA8,本发明通过基因工程技术获得了拟南芥TIR2基因的过量表达载体,并由此获得了拟南芥的过量表达株系,经过筛选后最终获得拟南芥TIR2基因过量表达纯合株系；所述拟南芥TIR2基因过量表达纯合株系表现为耐盐,具有很好的植物盐胁迫抗性,不仅能够增加种子萌发率和子叶展开率,缩短种子萌发和子叶展开时间,而且可以提高成植物幼苗根系的长度。本发明通过实验确认了拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性方面具有潜在的应用价值,并为利用拟南芥TIR2基因培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论和应用基础。(The present invention provides Arabidopsis thaliana TIR2 Application of the gene in improving salt stress resistance of plants. The above-mentioned TIR2 The gene interacting protein includes IAA4 and IAA8, and the present invention obtains Arabidopsis thaliana through gene engineering technology TIR2 The overexpression vector of the gene and the overexpression strain of the arabidopsis are obtained from the overexpression vector, and the arabidopsis is finally obtained after screening TIR2 Gene over-expression homozygous lines; the Arabidopsis thaliana TIR2 The gene over-expression homozygous strain is salt-tolerant, has good plant salt stress resistance, can increase the seed germination rate and the cotyledon expansion rate, shortens the seed germination and cotyledon expansion time, and can improve the length of the root system of the adult plant seedling. The invention confirms the arabidopsis through experiments TIR2 The gene has potential application value in the aspect of improving the salt stress resistance of plantsAnd is obtained by using Arabidopsis thaliana TIR2 The gene lays a good theoretical and application foundation for cultivating salt-tolerant and high-yield crop varieties.)
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。
背景技术
盐胁迫是影响作物产量的非生物胁迫因子之一。大面积的盐碱地和盐渍化土壤，使得大部分农作物品种在生长的过程中受到不同程度的盐害影响而难以发挥产量潜力。植物的抗盐性是一个由多基因决定的复杂的数量性状，不同植物的耐盐方式和耐盐机理不同，其组织或细胞的耐盐反应也会不同。随着耕地面积不断减少、人口不断增长，研究作物的耐盐机理，培育耐盐品种，对开发和有效利用盐碱地具有重要的现实意义。
植物激素是指一些在植物体内合成并能够从产生之处运送到其他部位，对生长发育产生显著作用的微量有机物质。生长素是第一个被发现的植物激素，对植物细胞分裂、细胞生长分化、侧根形成、向性反应、开花和胚胎发育等过程都具有重要的调控作用。生长素在植物生长活跃的部位合成，包括植物茎尖、顶芽、幼叶、发育的种子、主根根尖的分生组织、发育的侧根等幼嫩的部位，从合成部位运输到其他部位发挥作用。植物体内普遍存在的内源生长素是吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)。植物体内IAA的生物合成主要分为依赖色氨酸的合成和不依赖色氨酸的合成两种。其中，依赖色氨酸的途径是主要的合成途径，包括吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvate，IPA)途径、吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide，IAM)途径和吲哚-3-乙醛肟(indole-3-acetaldoxime，IAOx)途径。TIR2蛋白定位于生长素产生的部位，有研究发现TIR2蛋白起着色氨酸转氨酶的作用，而色氨酸转氨酶被认为可以将色氨酸转化为生长素的前体吲哚-3-丙酮酸（IPA）。但目前，并未发现有关生长素合成途径关键酶的编码基因在植物盐胁迫中的功能及作用的相关报道。
发明内容
针对上述现有技术的情况，本发明的目的在于提供拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用，本发明通过TIR2基因获得TIR2基因过量表达载体，并进而获得了TIR2基因过量表达纯合株系，该过量表达纯合株系具有很好的盐胁迫抗性。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用。
进一步的，所述应用的方法为：将含有所述拟南芥TIR2基因的过量表达载体通过花序侵染法转化到植物中，获得具有盐胁迫抗性的植物。
进一步的，含有所述拟南芥TIR2基因的植物过量表达纯合株系在盐胁迫下的种子萌发率明显高于野生型株系及突变体株系。
进一步的，含有所述拟南芥TIR2基因的植物过量表达纯合株系在盐胁迫下的种子萌发时间明显短于野生型株系及突变体株系。
进一步的，含有所述拟南芥TIR2基因的植物过量表达纯合株系在盐胁迫下的子叶展开率明显高于野生型株系及突变体株系。
进一步的，含有所述拟南芥TIR2基因的植物过量表达纯合株系在盐胁迫下的幼苗根系长度明显高于野生型株系及突变体株系。
进一步的，所述过量表达载体包括pBI121-TIR2，其通过重组质粒经双酶切后，将所述拟南芥TIR2基因连接到载体质粒中35S启动子后获得。
进一步的，所述重组质粒包括pMD18-T-TIR2，其通过扩增所述拟南芥TIR2基因的产物经回收、纯化后克隆到克隆载体上获得。
进一步的，所述拟南芥TIR2基因的扩增引物包括：
TIR2-F: ATGGTGAAACTGGAGAACTCGAGG；
TIR2-R: AAGGTCAATGCTTTTAATGAGCTTCATGTTG。
进一步的，所述拟南芥TIR2基因的相互作用蛋白包括IAA4和IAA8。
进一步的，所述植物为拟南芥。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明通过基因工程技术将TIR2基因进行过量表达，然后获得过量表达载体，将该载体转化进株系中，经过筛选得到TIR2基因过量表达纯合株系，进而明显的提高了植物盐胁迫抗性的能力，使得植物更加耐盐。TIR2基因过量表达不仅提高了盐胁迫下植物种子的萌发数量和速度、缩短子叶展开的时间，提高子叶展开率，还增加了植物幼苗根系的生长长度，更有利于植物在高盐环境下的生长发育。本发明通过实验首次确认了拟南芥TIR2基因可以提高植物的盐胁迫性，以及其互作蛋白包括IAA4和IAA8，并鉴于TIR2基因在盐胁迫中的应用，可以认为该基因对提高植物盐胁迫性具有潜在的应用价值，同时本发明也为利用TIR2基因培育耐盐、高产的农作物品种奠定良好的理论和应用基础。
附图说明
图1：TIR2基因过量表达纯合株系表达量的检测电泳图。
图2：野生型株系WT、突变体株系tir2-3以及TIR2过量表达纯合株系OE141的种子萌发及子叶展开结果；A、种子萌发和子叶展开表型；B：种子萌发率；C：子叶展开率。
图3：野生型株系WT、突变体株系tir2-3以及TIR2过量表达纯合株系OE141的幼苗根系生长结果；A、幼苗根长表型；B：根长统计数据。
图4：酵母双杂交实验验证TIR2基因 IAA4、IAA8的相互作用。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件；未详细注明的试剂或材料，均为市售产品。
实施例1：拟南芥TIR2基因转基因株系OE141的获得
一、拟南芥TIR2基因突变体的获得
在拟南芥数据库中获得TIR2基因的CDS序列，其长度为1173 nt，编码含有391个氨基酸的蛋白质，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸系列如SEQ ID NO:2所示。拟南芥TIR2基因T-DNA插入突变体 (tir2-3) 从拟南芥资源中心获得，再对其进行纯合体筛选、表达、分析并最终进行鉴定。
二、拟南芥TIR2基因转基因株系OE141的获得
1、拟南芥TIR2基因过量表达株系的获得
（1）构建组成型表达启动子35S驱动的TIR2的过量表达载体（35S::TIR2）：根据拟南芥TIR2基因的CDS序列，设计基因特异引物，其序列如下（5'-3'）：
TIR2-F: ATGGTGAAACTGGAGAACTCGAGG（SEQ ID NO:3）；
TIR2-R: AAGGTCAATGCTTTTAATGAGCTTCATGTTG（SEQ ID NO:4）；
通过PCR技术扩增TIR2基因，并将其扩增产物进行回收、纯化后克隆到pMD18-TSimple克隆载体上，获得pMD18-T-TIR2重组质粒；
（2）将pMD18-T-TIR2重组质粒经过质粒PCR测序确认后，使用限制性内切酶BamHI与SacI对pMD18-T-TIR2重组质粒和pBI121质粒进行双酶切，将TIR2基因连接到pBI121中35S启动子后面获得过量表达载体pBI121-TIR2；
（3）将过量表达载体pBI121-TIR2转化至农杆菌GV3101感受态中，再通过花序侵染法转化拟南芥中，获得TIR2基因过量表达株系。
2、TIR2转基因阳性纯合株系的筛选
（1）将单株收到侵染后的TIR2基因过量表达株系的种子做为T0代；
（2）将T0代种子在含有卡那霉素（终浓度为43 mg/L）的培养基上培养，挑选绿苗种在蛭石培养基质中，单株收到的种子为T1代；
（3）将T1代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代绿苗：黄苗分离比为3：1的株系中的绿苗种在蛭石培养基质中，单株收到的种子为T2代；
（4）将T2代种子在含有卡那霉素的培养基上培养，挑选后代均是绿苗的株系种在蛭石培养基质中，收到的种子即为TIR2基因过量表达的纯合转基因株系的种子，分别命名为OE4、OE28、OE62、OE65、OE141。
3、RT-PCR检测
对TIR2基因转基因阳性纯合株系的种子进行RT-PCR实验，其中RT-PCR实验所使用的引物为（5'-3'）：
35S-F: ATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCG（SEQ ID NO:5）；
TIR2-R: AAGGTCAATGCTTTTAATGAGCTTCATGTTG（SEQ ID NO:4）；
结果显示（图1），TIR2基因在过量表达的纯合体株系OE141中呈现较高水平的表达，因此选取该株系进行后续的研究。
实施例2盐胁迫下拟南芥TIR2基因对种子的萌发和子叶展开的影响
1、培养基的制备
（1）用于植物组织培养的1/2MS(-)培养基的配置：称取药品MS 2.37 g/L，蔗糖15g/L，溶解于超纯水中并定容至1000 ml，用1M KOH溶液和稀盐酸调节pH至5.80；
高盐培养基的配置：在1/2MS(-)培养基配方的基础上再添加58.44g/L氯化钠，即可配置成含有150 mM NaCl的高盐培养基。
（2）分装：每200 ml液体培养基分装于250 ml三角瓶中，加入1.6 g琼脂糖，于121℃高温、高压灭菌20分钟。
（3）灭菌结束后，待培养基冷却至50-60℃时，倒入玻璃平皿中，每200 ml分装10个玻璃平皿。培养基凝固后，标记浓度，密封于无菌袋备用。
2、种子萌发和子叶展开检测
以野生型株系WT、T-DNA突变体株系（tir2-3）和过量表达纯合株系（OE141）为处理材料，选取同时期的大小一致、籽粒饱满的拟南芥种子，用氯气消毒5 h。
将培养基分为2组，分别加入1/2MS(-)培养基和高盐培养基作为对照组CK和盐胁迫组，再将培养皿均等划分为三区，每区播种一种株系种子，每种播种28粒种子，在培养皿上做好标记，每种处理播种4个平行，将培养皿密封，于4℃黑暗层积三天后，再于22℃光照培养箱中培养，每12 h 统计一次萌发率。萌发情况如图2A所示，同时间内，对照（CK）组的3种种子的萌发情况均比盐胁迫组的好，说明盐胁迫能够显著减少拟南芥种子的萌发；而在盐胁迫组内，TIR2基因过量表达纯合株系的种子萌发情况要明显优于突变体株系以及野生型株系。萌发率的结果如图2B所示，在正常（CK）条件下，所有种子在2d已全部萌发；而在盐胁迫条件下，TIR2基因过量表达纯合株系在3.5d基本全部萌发，萌发率为99%，野生型株系需要5d基本全部萌发，萌发率为98.6%，而突变体株系萌发缓慢，到第7天仍未全部萌发。萌发一周后统计各株系子叶展开数量并统计子叶展开率，结果如图2C所示，与对照组相比，盐胁迫组的子叶展开率均有下降，说明盐胁迫能够显著减少拟南芥子叶的展开；而在盐胁迫组内，TIR2基因过量表达纯合株系的子叶展开率明显高于野生型株系及突变体株系。上述结果说明盐胁迫能够显著减少拟南芥种子的萌发和子叶展开，而TIR2基因却可以明显提高植物的盐胁迫抗性，进而提高了植物的萌发率，萌发数量和时间以及子叶展开，增加了植物种子的萌发以及株系子叶的展开能力，缓解种子遭受的盐胁迫。
实施例3：盐胁迫下拟南芥TIR2基因对幼苗生长表型的影响
1、培养基的制备：同实施例2。
2、幼苗生长表型检测
将培养基分为2组，分别加入1/2MS(-)培养基和高盐培养基作为对照组CK和盐胁迫组，每组设置4次重复。
以野生型株系WT、T-DNA突变体株系（tir2-3）和过量表达纯合株系（OE141）为处理材料，选取同时期的大小一致、籽粒饱满的拟南芥实种子，氯气消毒5h，然后均匀分散地铺于1/2MS (-)培养基上，密封培养基， 4℃黑暗层积三天，再于22℃竖直培生长3天，然后选择根长一致的幼苗转再分别移于1/2MS(-)培养基和高盐培养基中，竖直生长两周，观察根部生长并统计根长数据。
不同处理下拟南芥各株系的根长表型如图3A所示，统计数据如图3B所示，与对照组相比，盐胁迫组的根长明显更短，说明盐胁迫能够显著减少拟南芥幼苗根系的生长；而在盐胁迫组中，TIR2基因过量表达纯合株系幼苗的根长明显高于野生型株系及突变体株系，说明TIR2基因可以明显提高植物幼苗的盐胁迫抗性，进而提高植物幼苗根系的生长，缓解幼苗遭受的盐胁迫。
实施例4：拟南芥TIR2 互作蛋白的筛选与鉴定
（1）构建启动子T7驱动的TIR2的诱饵蛋白表达载体（pGBKT7-TIR2）：根据拟南芥TIR2基因的CDS序列，设计基因特异引物，其序列如下（5'-3'）：
TIR2-F: ATGGTGAAACTGGAGAACTCGAGG；
TIR2-R: AAGGTCAATGCTTTTAATGAGCTTCATGTTG；
通过PCR技术扩增TIR2基因，并将其扩增产物进行回收、纯化后克隆到pMD18-TSimple克隆载体上，获得pMD18-T-TIR2重组质粒；
（2）将pMD18-T-TIR2重组质粒经过质粒PCR测序确认后，使用限制性内切酶EcoRI与SalI对pMD18-T-TIR2重组质粒和pGBKT7质粒进行双酶切，将TIR2基因连接到pGBKT7中T7启动子后面获得表达载体pGBKT7-TIR2；
（3）将诱饵蛋白表达载体pGBKT7-TIR2转化至酵母菌株Gold Yeast感受态中，涂布到DDO和QDO上孵育，结果如图4A 所示，酵母细胞只在DDO上生长，说明其不具有转录自激活活性，可以用于酵母双杂交筛库实验；
（4）依据酵母双杂交筛库流程，最终获得与TIR2基因互作的两个蛋白：IAA4和IAA8，互作结果如图4B所示。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 拟南芥TIR2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1176
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 1
atggtgaaac tggagaactc gaggaaaccc gaaaaaattt cgaacaagaa catccccatg 60
tccgatttcg tggtcaatct ggatcatggt gatccaacgg cgtacgaaga atactggagg 120
aagatgggtg acaggtgtac ggtgacgata cgtggttgtg atctcatgag ttacttcagc 180
gacatgacga acttgtgttg gttccttgag ccagagcttg aagatgcgat caaggacttg 240
cacggtgttg ttggtaacgc tgcgacggag gatcggtaca tagtggttgg gaccggttcg 300
acgcagcttt gtcaagccgc cgtccacgca ctctcttcac tagccaggag tcaacctgtc 360
agcgtcgtcg ccgccgctcc tttttactcc acatatgtgg aggagacgac atatgttcgg 420
tcgggtatgt acaagtggga aggagacgca tggggtttcg acaaaaaggg tccgtacatc 480
gagctagtga cgtcacctaa taaccctgac ggaaccatca gagagacggt ggtgaaccgt 540
ccagacgacg acgaagccaa agtgatccat gactttgctt attactggcc ccactacact 600
cccatcactc gccgtcaaga ccatgacatc atgctcttca ctttctccaa gatcacaggc 660
cacgctgggt cccgtattgg gtgggcattg gtgaaggaca aggaggtagc taagaagatg 720
gttgagtata ttattgtgaa ctcgattggt gtgtctaagg agtcacaggt tcgaacagct 780
aagatactca acgttctaaa ggagacttgt aagagcgagt ccgagtctga gaatttcttc 840
aagtatggtc gtgagatgat gaagaatcgg tgggagaagc tacgtgaagt tgtgaaagag 900
agcgatgctt tcactcttcc caagtaccct gaagcatttt gcaactactt tggaaaatca 960
ctcgaatctt accctgcgtt tgcgtggcta gggacgaagg aagagacgga tctggtaagt 1020
gaattgagga gacacaaggt aatgagcaga gctggagagc gttgtggatc tgacaagaag 1080
catgtccgag tcagcatgct tagtcgtgaa gacgttttca atgtctttct cgagagactc 1140
gccaacatga agctcattaa aagcattgac ctttag 1176
<210> 2
<211> 391
<212> PRT
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 2
Met Val Lys Leu Glu Asn Ser Arg Lys Pro Glu Lys Ile Ser Asn Lys
1 5 10 15
Asn Ile Pro Met Ser Asp Phe Val Val Asn Leu Asp His Gly Asp Pro
20 25 30
Thr Ala Tyr Glu Glu Tyr Trp Arg Lys Met Gly Asp Arg Cys Thr Val
35 40 45
Thr Ile Arg Gly Cys Asp Leu Met Ser Tyr Phe Ser Asp Met Thr Asn
50 55 60
Leu Cys Trp Phe Leu Glu Pro Glu Leu Glu Asp Ala Ile Lys Asp Leu
65 70 75 80
His Gly Val Val Gly Asn Ala Ala Thr Glu Asp Arg Tyr Ile Val Val
85 90 95
Gly Thr Gly Ser Thr Gln Leu Cys Gln Ala Ala Val His Ala Leu Ser
100 105 110
Ser Leu Ala Arg Ser Gln Pro Val Ser Val Val Ala Ala Ala Pro Phe
115 120 125
Tyr Ser Thr Tyr Val Glu Glu Thr Thr Tyr Val Arg Ser Gly Met Tyr
130 135 140
Lys Trp Glu Gly Asp Ala Trp Gly Phe Asp Lys Lys Gly Pro Tyr Ile
145 150 155 160
Glu Leu Val Thr Ser Pro Asn Asn Pro Asp Gly Thr Ile Arg Glu Thr
165 170 175
Val Val Asn Arg Pro Asp Asp Asp Glu Ala Lys Val Ile His Asp Phe
180 185 190
Ala Tyr Tyr Trp Pro His Tyr Thr Pro Ile Thr Arg Arg Gln Asp His
195 200 205
Asp Ile Met Leu Phe Thr Phe Ser Lys Ile Thr Gly His Ala Gly Ser
210 215 220
Arg Ile Gly Trp Ala Leu Val Lys Asp Lys Glu Val Ala Lys Lys Met
225 230 235 240
Val Glu Tyr Ile Ile Val Asn Ser Ile Gly Val Ser Lys Glu Ser Gln
245 250 255
Val Arg Thr Ala Lys Ile Leu Asn Val Leu Lys Glu Thr Cys Lys Ser
260 265 270
Glu Ser Glu Ser Glu Asn Phe Phe Lys Tyr Gly Arg Glu Met Met Lys
275 280 285
Asn Arg Trp Glu Lys Leu Arg Glu Val Val Lys Glu Ser Asp Ala Phe
290 295 300
Thr Leu Pro Lys Tyr Pro Glu Ala Phe Cys Asn Tyr Phe Gly Lys Ser
305 310 315 320
Leu Glu Ser Tyr Pro Ala Phe Ala Trp Leu Gly Thr Lys Glu Glu Thr
325 330 335
Asp Leu Val Ser Glu Leu Arg Arg His Lys Val Met Ser Arg Ala Gly
340 345 350
Glu Arg Cys Gly Ser Asp Lys Lys His Val Arg Val Ser Met Leu Ser
355 360 365
Arg Glu Asp Val Phe Asn Val Phe Leu Glu Arg Leu Ala Asn Met Lys
370 375 380
Leu Ile Lys Ser Ile Asp Leu
385 390
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggtgaaac tggagaactc gagg 24
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggtcaatg cttttaatga gcttcatgtt g 31
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atagaggacc taacagaact cgccg 25
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