一种具有促进伤口愈合的干细胞因子修复液的制备方法
阅读说明：本技术 一种具有促进伤口愈合的干细胞因子修复液的制备方法 (Preparation method of stem cell factor repair liquid capable of promoting wound healing ) 是由 高宏 林春媛 蒋蕊 于 2020-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有促进伤口愈合的干细胞因子修复液的制备方法,具体地,本发明方面包括以下步骤：s1：提供一待培养的干细胞；s2：在适合干细胞生长的条件下,对所述干细胞进行预培养,得到第一培养物；s3：在低氧培养条件下,继续培养所述的第一培养物,得到第二培养液；s4：分离所述的第二培养液,从而得到培养上清；其中,所述的低氧条件是指氧气的体积百分比为0.1-5％,以N-2、CO-2和O-2的总体积计。本发明方法采用低氧技术培养干细胞,能让干细胞分泌更多的生物活性因子,从而能够更好地促进伤口愈合。(The invention relates to a preparation method of stem cell factor repair liquid for promoting wound healing, and concretely comprises the following steps: s 1: providing a stem cell to be cultured; s 2: preculture the stem cells under the condition suitable for the growth of the stem cells to obtain a first culture; s 3: continuously culturing the first culture under a low-oxygen culture condition to obtain a second culture solution; s 4: separating said second culture fluid to obtain a culture supernatant; wherein the low oxygen condition refers to that the volume percentage of oxygen is 0.1-5 percent, and N is used 2 、CO 2 And O 2 The total volume of (c). The method adopts the hypoxia technology to culture the stem cells, and can lead the stem cells to secrete more bioactive factors, thereby better promoting the wound healing.)
技术领域
本发明涉及生物产品制备领域，具体涉及一种具有促进伤口愈合的干细胞因子修复液的制备方法。
背景技术
皮肤指覆盖在机体外面的组织，是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能。皮肤覆盖全身，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭，所以皮肤是我们身体的保护屏障，但皮肤其实也是非常脆弱的，在生活中经常会有各种各样的原因让皮肤留下伤口，有些伤口三到五天内就会自动愈合的，但是有些人却发现自己的伤口很难愈合，这些伤口如果不注意护理，导致伤口被病菌感染，不但会影响伤口的愈合，甚至还会导致伤口化脓、感染甚至危及生命。
引起伤口难愈合的原因很多，如：年龄、营养状况、全身性的疾病等，尤其那些高龄并患有慢性疾病，如糖尿病的人群，一旦肢体有的伤口，常规药物对这类的伤口作用很小。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是成体干细胞的一种，它在体内对细胞的修复与再生作用已经被初步证实。其在创面愈合中的关键作用包括2个方面：一是直接参与损伤组织的重建，主要包括细胞的增殖、迁移、归巢、分化等；二是以调节性功能细胞的方式，间接参与组织损伤的修复重建，主要涉及干细胞激活后以旁分泌形式分泌大量生物活性分子，促进其他修复细胞的功能。间充质干细胞在培养的过程中会分泌各种生长因子，例如干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF-β)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等。干细胞分泌的生长因子能够促进各种细胞的增殖和分化，产生新的细胞从而代替衰老和损伤的细胞；促进细胞合成和分泌细胞外基质成分，提供良好的营养环境。此外，干细胞的分泌因子中还含有各种细胞外基质蛋白，能够改善皮肤肤质，特别是对皮肤瘢痕和疤痕具有很好修复作用。
然而，目前的干细胞培养多数是在21％氧气浓度的条件下进行，干细胞因子分泌量较低，不能满足愈合伤口的需要。
发明内容
本发明目的在于提供一种促进伤口愈合的干细胞因子修复液的制备方法，该方法使用低氧培养条件，制备的修复液能够有效地促进伤口愈合，并且具有较好的效果。
本发明的第一方面，提供一种干细胞因子修复液的制备方法，包括以下步骤：
s1：提供一待培养的干细胞；
s2：在适合干细胞生长的条件下，对所述干细胞进行预培养，得到第一培养物；
s3：在低氧培养条件下，继续培养所述的第一培养物，得到第二培养液；
s4：分离所述的第二培养液，从而得到培养上清；
其中，所述的低氧条件是指氧气的体积百分比为0.1-5％，以N2、CO2和O2的总体积计。
在另一优选例中，所述低氧培养条件为0.2％≤氧气的体积百分比＜2％，较佳地为0.5-1.5％，更佳地为1％，以N2、CO2和O2的总体积计。
在另一优选例中，预培养的培养条件是指氧气的体积百分比为15-25％，较佳地为20-21％，以N2、CO2和O2的总体积计。
在另一优选例中，低氧培养的条件为5％CO2、1％O2、94％N2，以N2、CO2和O2的总体积计。
在另一优选例中，所述的预培养的培养温度为25-40℃，较佳地为35-38℃，更佳地为37℃。
在另一优选例中，所述的低氧条件的培养温度为25-40℃，较佳地为35-38℃，更佳地为37℃。
在另一优选例中，预培养条件为：所述干细胞在37℃，5％CO2、21％O2和74％N2浓度的常规潮湿环境下培养。
在另一优选例中，预培养的培养时间为2.5-10天，较佳地3-8天，更佳地4-6天。
在另一优选例中，在步骤s2中，市售干细胞被传代培养了至少2代或3代，如3-7代(例如3、4、5、6、或7代)。
在另一优选例中，低氧培养的时间为1-48h，较佳地为12-36h，更佳地为24h。
在另一优选例中，所述的干细胞为人脐带或脂肪间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的制备方法还包括如下步骤：
s5：将稳定剂与得到的培养上清按照1:1-1:10的体积比混合，得到干细胞因子修复液。
在另一优选例中，所述的稳定剂为药用甘油和无菌蒸馏水的混合物。
在另一优选例中，药用甘油和无菌蒸馏水的体积比为1:1-1:5。
在另一优选例中，制备得到的干细胞因子修复液存储在4℃医用冰箱中。
在另一优选例中，所述培养上清为传代干细胞P3-P7的培养上清。
在另一优选例中，所述培养上清为传代干细胞P4-P6的培养上清。
在另一优选例中，所述的传代干细胞为P6人脐带间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的传代干细胞为P4脂肪间充质干细胞。
在另一优选例中，所述预培养和低氧培养均采用选自下组的培养基：无血清培养基、无酚红培养基、或其组合。
在另一优选例中，用0.22um过滤器分离第二培养液。
在另一优选例中，所述的传代干细胞的阳性标志物CD73、CD90和CD105的阳性比例(以干细胞总数计)大于90％。
在另一优选例中，所述的传代干细胞的阳性标志物CD73、CD90和CD105的阳性比例(以干细胞总数计)大于95％。
在另一优选例中，所述传代干细胞的阴性标志物CD31、CD34、CD45和HLA-DR的阳性比例小于5％(以干细胞总数计)。
在另一优选例中，述传代干细胞的阴性标志物CD31、CD34、CD45和HLA-DR的阳性比例小于2％(以干细胞总数计)。
在另一优选例中，所述的培养上清包含：
在另一优选例中，所述的干细胞因子修复液主要用于修复缺血性损伤伤口。
本发明第二方面，提供一种干细胞培养上清，所述的培养上清包含：
在另一优选例中，所述培养上清采用第一方面的干细胞因子修复液的制备方法制备得到。
本发明第三方面，提供一种制品，所述制品包含第二方面所述的培养上清，和药学上可接受的载体。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了经过阿莫西林治疗后无效的伤口，使用本发明方法制备的干细胞因子修复液治疗两周前后的效果。
图2显示了低氧条件与常氧条件间充质干细胞因子分泌比较结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地开发了一种制备促进伤口愈合的干细胞因子修复液的方法，本发明方法采用特定的培养方式，通过正常氧气预培育并结合低氧培养来培养脐带或脂肪干细胞，从而出乎意料地使得培养的干细胞能够分泌更多的有益的生物活性因子。实验表明，采用本发明方法制备的细胞因子修复液能够更有效和更快速地使伤口愈合。在此基础上完成了本发明。
干细胞因子修复液的制备方法
本发明中，干细胞因子修复液的制备方法包括如下步骤：
s1：提供一待培养的干细胞；
s2：在适合干细胞生长的条件下，对所述干细胞进行预培养，得到第一培养物；
s3：在低氧培养条件下，继续培养所述的第一培养物，得到第二培养液；
s4：分离所述的第二培养液，从而得到培养上清；
其中，所述的低氧条件是指氧气的体积百分比为0.1-5％，以N2、CO2和O2的总体积计。
优选地，所述低氧培养条件为0.2％≤氧气的体积百分比＜2％，较佳地为0.5-1.5％，更佳地为1％，以N2、CO2和O2的总体积计。
优选地，预培养的培养条件是指氧气的体积百分比为15-25％，较佳地为20-21％，以N2、CO2和O2的总体积计。
优选地，所述的预培养和低氧条件的培养温度均为25-40℃，较佳地为35-38℃，更佳地为37℃。
优选地，低氧培养的条件为5％CO2、1％O2、94％N2，以N2、CO2和O2的总体积计。
优选地，预培养条件为：所述干细胞在37℃，5％CO2、21％O2和74％N2浓度的常规潮湿环境下培养。
优选地，预培养的培养时间为2.5-10天，较佳地3-8天，更佳地4-6天。
优选地，低氧培养的时间为1-48h，较佳地为12-36h，更佳地为24h。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：
将稳定剂与得到的培养上清按照1:1-1:10的体积比混合，得到干细胞因子修复液。
优选地，所述稳定剂为药用甘油和无菌蒸馏水的混合物，较佳地，药用甘油和无菌蒸馏水的体积比为1:1-1:5。
优选地，制备得到的干细胞因子修复液存储在4℃医用冰箱中。
优选地，上述干细胞为人脐带或脂肪间充质干细胞。
优选地，所述培养上清为传代干细胞P3-P7的培养上清，优选地为P4-P6的培养上清，更优选地为P6人脐带间充质干细胞或P4的脂肪间充质干细胞的培养上清。
优选地，所述的传代干细胞的阳性标志物CD73、CD90和CD105的阳性比例(以总干细胞计)大于90％，较佳地，大于95％；阴性标志物CD31、CD34、CD45和HLA-DR的阳性比例小于5％，较佳地，小于2％。
优选地，本发明方法采用选自下组的培养基：无血清培养基、无酚红培养基、或其组合。
优选地，用0.22um过滤器分离第二培养液。
培养上清
本发明培养上清采用本发明提供的干细胞因子修复液的制备方法制备得到。
优选地，所述培养上清(干细胞因子修复原液)包含：
优选地，所述的培养上清中，VEGF的量为1800-2000pg/ml。
优选地，所述的培养上清中，IGF-1的量为350-450pg/ml。
优选地，所述的培养上清中，HGF的量为2500-3000pg/ml。
优选地，制备得到的干细胞因子修复液主要用于修复缺血性损伤伤口，较佳地，对经过常规OTC消炎药(如青霉素类消炎药)治疗后无效的伤口。
制品
本发明制品包含如上所述的培养上清和药学上可接受的载体。
“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
优选地本发明制品包含培养上清和稳定剂。
优选地，所述稳定剂为药用甘油和无菌蒸馏水的混合物，较佳地，药用甘油和无菌蒸馏水的体积比为1:1-1:5。
低氧培养
本发明的低氧培养是指在常氧培养条件下(即氧气含量约为空气中氧气含量)培养一定时间(如3-4天)，然后在收集培养上清前进行一定时间(如24h)的低氧培养(即低于常氧培养的氧气)。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1.本发明制备方法采用低氧技术培养脐带或脂肪干细胞，能让干细胞分泌更多的生物活性因子，从而能够更有效地促进伤口愈合。
2.本发明制备方法采用无血清培养基培养脐带或脂肪干细胞，安全可靠，不会像传统的动物血清培养法可能会引入异源病原微生物、异源蛋白，甚至引起免疫排斥反应。
3.本发明方法制备得到的干细胞因子修复液能够快速减轻局部炎症、促进侧支循环的建立，从而起到镇痛和促进伤口愈合的显著作用。
4.本发明方法不含细胞、颗粒物质或微生物，安全可靠。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1脐带干细胞因子修复液的制备
一、制备脐带干细胞
1.把检测过传染病四项和其它病毒和微生物并是阴性的健康人的脐带组织放入超净台中，剪成1cm的小段后用无菌生理盐水反复清洗脐带数次，洗去脐带血液后，用手术剪将脐带外壁剪开，用镊子小心剔除三条血管，用镊子取沃顿胶组织至培养皿中，剪成更细小的碎块，放入培养皿中加入适量的无血清无酚红的完全培养基，并放入常规CO2细胞培养箱中。
2.细胞培养72小时后，吸走上清，加入新鲜的无血清无酚红的完全培养基，再放入CO2培养箱中，之后每两天更换一半的培养基，直至看到85％皿底长满细胞。每当培养皿里有85％的细胞时用Gibco的TrypLETM Select消化液消化细胞，再用新鲜的无血清培养基重悬干细胞，接种到细胞培养瓶中。如此传代至P6脐带干细胞。
3.培养至P6的脐带间充质干细胞，取出适量的细胞用抗体标记干细胞，流式细胞仪上机检测干细胞标志物的表达水平。
检测结果表明，间充质干细胞阳性标志物CD73、CD90和CD105的阳性比例≥95％，间充质干细胞阴性标志物CD31、CD34、CD45和HLA-DR的阳性比例＜2％。
二、制备脐带干细胞培养上清
使用P6的脐带干细胞作为干细胞因子修复液的来源。细胞先在37℃，5％二氧化碳、21％氧气和74％N2(体积百分比)的常规潮湿环境下培养，在收获之前24小时，细胞转入到含氧气1％的特殊培养环境，24小时后收集全部的细胞培养上清(干细胞因子修复原液)，储存在4℃医用冰箱里，用于后续的制备。
三、脐带干细胞上清液的过滤
上清液积攒到一定体积后，从冰箱中取出上清液，放进在超净工作台中，用0.2μm无菌过滤器过滤上清液，回收到新的无菌瓶中待用。
四、制备稳定剂
在超净台中，将医用甘油与无菌蒸馏水按体积比1:1的比例混匀(如果需要可以用0.2um的无菌过滤器过滤)。
五、制备脐带干细胞因子修复液
在超净台中，将稳定剂和过滤的上清液按照体积1:6的比例混匀，并分装到1ml的无菌滴瓶里，放置在4°的医用冰箱中。
实施例2脂肪间充质干细胞因子修复液的制备
一、制备脂肪间充质干细胞
采用与实施例1相同的方法，不同点在于将脐带组织替换为吸脂或切脂得到的脂肪组织。传代培养，得到P4脂肪干细胞。
二、制备脂肪间充质干细胞培养上清
使用P4的脂肪干细胞作为干细胞因子修复液的来源。细胞一直在37℃有5％二氧化碳、21％氧气和74％N2(体积百分比)浓度的常规潮湿环境下培养，在收获之前24小时，细胞转入到含氧气1％的特殊培养环境，24小时后收集全部的细胞培养上清，储存在4℃医用冰箱里，用于后续的制备。
三、脂肪间充质干细胞上清液的过滤
上清液积攒到一定体积后，从冰箱中取出上清液，放进在超净工作台中，用0.2um无菌过滤器过滤上清液，回收到新的无菌瓶中待用。
四、制备稳定剂
在超净台中，将医用甘油与无菌蒸馏水按体积比1:1的比例混匀(如果需要可以用0.2um的无菌过滤器过滤)。
五、制备脂肪间充质干细胞因子修复液
在超净台中，将稳定剂和过滤的上清液按照体积1:6的比例混匀，并分装到1ml的无菌滴瓶里，放置在4°的医用冰箱中。
实施例3不同氧气条件间充质干细胞因子分泌情况
实验方法
1.低氧条件(5％CO2、1％O2、94％N2)组：
使用P6的脐带干细胞作为干细胞因子修复液的来源。细胞先在37℃，5％二氧化碳、21％氧气和74％N2(体积百分比)的常规潮湿环境下培养，在收获之前24小时，细胞转入到含氧气1％的特殊培养环境，24小时后收集全部的细胞培养上清(干细胞因子修复原液)。脐带干细胞的培养与上清的收集可参见实施例1。
2.常氧条件(5％CO2、21％O2、74％N2)组：
材料和培养基同“低氧条件”组。使用P6的脐带干细胞作为干细胞因子修复液的来源。细胞一直在37℃，5％二氧化碳、21％氧气和74％N2(体积百分比)的常规潮湿环境下培养，直接收集全部的细胞培养上清。
实验结果
对于低氧条件组与常氧条件组的间充质干细胞因子分泌情况，采用市售的ELISA检测试剂盒进行分析，结果如表1和图2所示。
表1
实验结果表明，相较于常氧培养条件，在收集培养上清前，进行短时间的低氧培养能够显著提升间充质干细胞因子分泌量。其中，VEGF、IGF-1、HGF和KGF的提升幅度最为显著，提升幅度居然高达68％至149％。
实施例4对经过常规OTC药物治疗后无效的伤口的愈合作用
实验对象：4名志愿者，他们是在四肢或脚部患有伤口，并经过阿莫西林治疗半年后无效的受试者。
使用方法：在清洗创伤后，每4小时将实施例1中制备得到的干细胞因子修复液均匀滴撒在患处，再在上面涂阿莫西林，连续使用2周。
测试结果：4名患有伤口的受试者伤口愈合，其中，1名受试者使用本发明制备的干细胞因子修复液前后的对比如图1所示。
结果表明，本发明方法制备得到的干细胞因子修复液能够显著促进经过常规OTC药物(如阿莫西林)治疗后无效的伤口的愈合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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