具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验菌株：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)KLDS 1.0901、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)KLDS 1.8701和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)KLDS 1.0318均分离自新疆传统发酵乳制品，由东北农业大学乳品科学教育部重点实验室工业微生物菌种保藏中心保存。

1.1.2实验细胞：小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞株，其是调控炎症反应的主要细胞，广泛应用于被脂多糖诱导的巨噬细胞炎症模型中。本细胞株由乳品科学教育部重点实验室赵新淮教授惠赠。

1.1.3实验动物：雄性C57BL/6 J小鼠(7周龄)。

1.1.4培养基

1.1.4.1细菌培养基

MRS液体培养基：培养基各成分按照(蛋白胨5.0g、牛肉膏5.0g、胰蛋白胨10.0g、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、酵母粉5.0g、硫酸锰0.25g、硫酸镁0.58g、柠檬酸氢二铵2.0g、吐温-80 1.0g、葡萄糖20.0g)加入后，用蒸馏水定容至1L，充分搅拌均匀，将pH调节至6.2～6.4，121℃条件下灭菌15min，之后于4℃冰箱中贮存备用。MRS固体培养基：每升MRS液体培养基加入16％琼脂。

细胞培养基：完全高糖DMEM培养基。向高糖DMEM中补充10％的热灭活胎牛血清和1％双抗(青霉素浓度100U/mL和链霉素100μg/mL)，经0.22μm滤膜过滤除菌，并于4℃冰箱贮存备用。

高糖DMEM培养基：即向高糖DMEM培养基中加入10％的热灭活胎牛血清和1％的抗生素(青霉素浓度100U/mL、链霉素100μg/mL)，用0.22μm的滤膜过滤除菌后，于4℃冰箱中贮存备用。

1.2实验方法

1.2.1菌株的培养与保藏

将实验菌株以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养，连续活化传代2次，在MRS固体培养基上进行三区划线。37℃恒温培养48h，挑取单菌落进行革兰氏染色观察，镜检其是否为单个菌落，再传代2次直至活力恢复，将第3代培养液与50％甘油按3:2混匀，保藏于-20℃并进行16S rDNA鉴定。

菌株计数：采用平板计数法。将供试菌株以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养，连续活化传代2次，然后涂布在MRS固体培养基上，37℃恒温培养48h后进行平板计数。

(1)稀释：在EP管加入0.9mL无菌PBS，将菌液震荡混匀，向EP管中加入0.1mL菌液混匀，稀释10倍，依次进行梯度稀释，将原菌液稀释为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8CFU/mL。

(2)涂布：吸取各梯度菌液100uL加入MRS固体培养基中，涂布棒放于酒精灯火焰上灼烧灭菌，待涂布棒降至合适温度后，将MRS固体培养基中菌液涂布均匀，每个梯度重复3次，进行编号。

(3)计数：将涂布好的MRS固体培养基，37℃恒温培养48h后，选取菌落数为30-300的菌落进行计数。

1.2.2 RAW246.7细胞培养与保藏

1.2.2.1 RAW246.7细胞活化

从液氮罐中取出RAW246.7细胞冻存管，迅速置于37℃恒温水浴锅反复摇动使其融化。快速转移至超净台，向15mL无菌离心管内加入5mL DMEM高糖培养基，将冻存管中液体转移至离心管中，离心(1000r/min，5min)后，弃去上清液，向细胞沉淀中加入1mL培养基，充分吹打混匀，转移至50mL无菌细胞培养瓶，再向培养瓶中补加3mL培养基，轻轻摇动混匀，37℃、5％CO₂培养箱中培养。每隔1至2天更换新鲜培养基，待细胞生长状态良好(单层细胞贴壁生长至70％-80％)时进行传代。

1.2.2.2 RAW246.7细胞传代

待细胞生长状态良好(单层细胞贴壁生长至70％-80％)时进行传代，弃去培养瓶中原有培养基，2mL无菌PBS洗涤单层细胞2-3次，加入1mL0.25％胰酶消化1-2min，随后加入DMEM高糖培养基终止消化，转移至15mL无菌离心管中，离心(1000r/min，5min)后，弃去上清液，向细胞沉淀中加入3mL培养基，充分吹打混匀后，分别吸取1mL细胞悬液至50mL培养瓶中，再向每个培养瓶中补加3mL培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

1.2.2.3 RAW246.7细胞冻存

待细胞达到传代标准时，弃去培养瓶中原有培养基，2mL无菌PBS洗涤单层细胞2-3次，加入1mL0.25％胰酶消化1-2min，随后加入培养基终止消化，1000r/min离心5min后，弃去上清液向离心管中加入1mL冻存液(冻存液配置：90％血清+10％二甲基亚砜(DMSO)，配置时避光，现用现配)，充分吹打混匀，迅速转移至无菌冻存管，用封口膜封住冻存管瓶口。于4℃冰箱中放置30min，-20℃冰箱中放置2h，后转移至-80℃冰箱中过夜，最后置于液氮中长期冻存。

1.2.3乳杆菌体外抗炎机制的研究

1.2.3.1菌悬液的配置

将供试菌株以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养，连续活化传代2次后，8000g/min离心10min，弃去上清液，再用无菌PBS洗涤菌体2-3次，并用高糖DMEM培养基重新悬浮所需要的浓度，其中混合菌株按1:1:1体积比例将三株乳杆菌混合。

1.2.3.2 LPS溶液的配置

将原装10mg无菌LPS粉末溶于10mL无菌PBS，混合均匀，配置成浓度为1mg/mL LPS原液，至于-20℃放置。使用时再加入高糖DMEM培养基将其稀释为1μg/mL LPS。

1.2.3.3细胞存活率

采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测。细胞分组为：空白组(培养基)、对照组(细胞+培养基)、实验组(培养基+细胞+混合菌株)。取对数生长期的RAW264.7细胞，消化后均匀吹散，以2×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，待细胞贴壁后，弃去培养液，用PBS清洗细胞2次，每组6个复孔。除空白组与对照组外，每孔加入混合乳杆菌(MOI＝0.1、1、10、100、1000)处理细胞，轻轻振荡，放入培养箱孵育24h后，用PBS清洗细胞两次，每孔加入10μLCCK-8溶液。再孵育2h后，使用酶标仪测量450nm出吸光度，根据下列公式计算巨噬细胞的相对存活率。

1.2.3.4PGE2和TNF-α、IL-6和IL-1β的含量检测

采用ELISA法。细胞分组为：空白对照组、单纯LPS处理组、LPS+KLDS1.0901组、LPS+KLDS 1.8701组、LPS+KLDS 1.0318组和LPS+混合乳杆菌组。取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板，每组3个重孔。细胞贴壁后，加入不同乳杆菌(MOI＝10)预处理1h后加入终浓度1μg/mL的LPS，孵育12h后，室温条件下1000r/min离心5min取细胞培养液。按照ELISA试剂盒(市售)说明书步骤操作，绘制标准曲线，测定细胞培养液中PGE2和TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.2.3.5炎症因子mRNA表达检测

采用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerasechain reaction，PCR)法。

(1)细胞中总RNA提取

按照1.2.3.4节中的方法将RAW246.7细胞分组并做相应处理。RAW264.7细胞悬液以2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板中，每组3个复孔，用不同乳杆菌预处理1h后，LPS刺激12h后，PBS洗涤两次细胞。用天根试剂盒(市售)提取细胞总RNA，利用核酸分析仪，以无酶水作为对照进行测定总RNA浓度，A260/A280值在1.8-2.0间方可进行后续试验。

(2)cDNA的生成

按照Promega公司的GoScript^TM Reverse Transcription Mix试剂盒在冰上准备反应体系，轻柔混合后进行反转录反应合成cDNA。

(3)引物核苷酸序列

相关引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。

(4)实时荧光定量PCR

以2μg cDNA为模板，按照Promega公司的qPCR Master Mix试剂盒说明配置反应液，用实时荧光定量PCR系统(ABI 7500)进行两步法PCR扩增。反应条件：预变性95℃10min，PCR 95℃15s，60℃1min，循环40次，10μL反应体系。根据目的基因的Ct值和内参基因β-actin的Ct值，按照2^-ΔΔCt法计算样本中目的基因mRNA的相对表达水平行分析。

1.2.3.6 Western blotting分析

检测NF-κB信号通路中核转录因子抑制剂(inhibitor of nuclear factor(NF)-κB，IκB)，磷酸化核转录因子(phosphorylated Nuclear factor kappa-B，p-NF-κB)以及磷酸化IκB(phosphorylated IκB，p-IκB)蛋白表达水平。

1.2.4乳杆菌体内预防以及治疗结肠炎、溃疡性结肠炎机制的研究

1.2.4.1菌悬液制备

将实验菌株以2％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养，连续活化传代2次后，8000g/min离心10min，弃去上清液，再用无菌PBS洗涤菌体2-3次，并用无菌生理盐水重悬调整乳杆菌浓度为1×10⁹CFU/mL，其中混合菌株按1:1:1体积比例将三株乳杆菌混合。

1.2.4.2小鼠分组和实验设计

将60只雄性C57BL/6J小鼠(7周龄)试喂养1周后，将60只小鼠按照下表1随机分为6组，每组10只。实验共为五周，前四周为预防期，按照下表进行灌胃，然后除空白组外饮用3％DSS水溶液7天，期间饲养温度为22±2℃，湿度为55％±5％，自由采食与饮水，12h光-暗循环。

表1 小鼠实验组别

表1中，LAB1为嗜酸乳杆菌KLDS 1.0901；LAB2为瑞士乳杆菌KLDS 1.8701；LAB3为植物乳杆菌KLDS 1.0318；Mix为体积比为1:1:1的嗜酸乳杆菌KLDS 1.0901、瑞士乳杆菌KLDS 1.8701和植物乳杆菌KLDS 1.0318的混合乳杆菌。

1.2.4.3疾病活动指数

通过疾病活动指数(DAI)评估结肠炎严重情况(phloUC文献E盘)。DAI包括三个方面：体重变化，粪便性状和便血情况，具体评分标准如表2所示。在造模期间，每天测量体重，观察粪便性状和粪便中便血情况。粪便隐血情况采用邻联甲苯胺法测定，具体步骤操作如下：(1)尽快收集粪便标本涂在白瓷板上；(2)滴加邻联甲苯胺液2滴(约0.1mL)于粪便不同位置；(3)滴加氧化剂2滴(约0.1mL)，立即计时并观察颜色变化。(4)2min内有蓝色出现，粪便隐血试验为阳性，2min内不显色为阴性。

表2 疾病活动指数评分

1.2.4.4标品处理

实验结束后，各组小鼠麻醉后眼眶取血，然后颈椎脱臼处死小鼠，在无菌环境下，将小鼠腹部酒精消毒并打开腹腔，切断结肠仔细收集结肠内容物，然后用PBS清洗干净后，测量完整结肠长度，一部分结肠置于4％多聚甲醛用于微观组织病理学变化检测，其余部分结肠保存在-80℃冰箱用于后续炎症因子等检测实验。全血静置一段时间后，3000g离心20min，收集血清，保存-80℃冰箱用于后续实验。

1.2.4.5结肠组织病理学观察及评分

(1)包埋：新鲜结肠组织用4％多聚甲醛固定24h以上，经流水冲洗30min，进行组织修块，放入脱水盒内依次梯度酒精进行脱水(75％乙醇4h，85％乙醇2h，90％乙醇2h，95％乙醇1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯10min，二甲苯I10min，二甲苯II 10min，65℃融化石蜡I1h；65℃融化石蜡II 1h；65℃融化石蜡III 1h，将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。(2)切片：用石蜡切片机切成5μm薄片，40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。(3)染色：(a)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，二甲苯III15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95％乙醇5min，85％酒精5min，自来水洗。(b)苏木素染色：切片入苏木素染液染1-2min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。(c)伊红染色：伊红染液中染色2-3min。(d)脱水封片：切片依次入脱水(无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇Ⅲ5min)透明(二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min透明)，中性树胶封片；(e)显微镜镜检，图像采集分析。

组织学评分具体见表3。

表3 组织学评分

1.2.4.6 AB-PAS(阿利新蓝染色)染色

(1)包埋和(2)切片的方法同1.2.4.5节。(3)染色：(a)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min，二甲苯Ⅱ15min，二甲苯III15min-无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95％酒精5min，85％酒精5min，自来水洗；(b)阿利新蓝染色：切片入阿利新蓝染液中染色5min，自来水洗2min；(c)高碘酸染色：切片入高碘酸染液中15min，自来水洗，蒸馏水洗两遍；(d)雪弗染色：切片入雪弗染液避光染色30min，流水冲洗5min；(e)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；(f)脱水封片：切片依次入脱水(无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇Ⅲ5min)透明(二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min)，中性树胶封片；(g)显微镜镜检，图像采集分析。

1.2.4.7血清中D-乳酸测定

采用ELISA法测定。按照ELISA试剂盒操作说明测定血清中D-乳酸含量。

1.2.4.8结肠组织髓过氧化物酶(MPO)活力检测

准确称取结肠组织，以试剂二溶液为匀浆介质，按重量体积比为1:19加匀浆介质，制备5％组织匀浆，取5％组织匀浆0.9mL加入0.1mL试剂三，充分混匀后37℃水浴15min，取出待测。取0.2mL样品加入0.2mL试剂四，3mL显色剂(对照组加入3mL双蒸水)，混匀37℃水浴30min，加入0.05mL试剂七，60℃水浴10min，取出后立即在460nm处测定吸光度值。其计算公式如下：

1.2.4.9结肠组织炎症因子测定：采用ELISA试剂盒测定。准确称取结肠组织，按重量体积比为1:9加入生理盐水，制备10％组织匀浆，将组织匀浆在4℃条件下，以2500×g离心20min，取出上清液按照ELISA试剂盒操作说明测定PGE2和TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量。

1.2.4.10结肠组织炎症因子和肠道屏障mRNA表达测定：同2.2.3.5部分。

1.2.4.11粪便中短链脂肪酸测定

(1)样品制备

准确称取0.8000±0.010g盲肠内容物放入粪便样本盒中，用HALO-F100粪便处理仪处理，配制10％悬浊液，取500μL悬浊液(若为液体培养基样本则直接吸取500μL，操作如后)于1.5mL离心管中，并加入100μL巴豆酸偏磷酸溶液，-30℃冻结24h，解冻后8000rpm、4℃离心3min去除蛋白质等杂质，取上清用0.22μm水系过滤器过滤后上机测定。

(2)仪器方法

色谱柱：色谱柱Agilent DB-FFAP(毛细管柱30m×0.25mm ID×0.25um)；柱温：75℃，20℃/min升至180℃保持1min，50℃/min升至220℃保持1min；进样口：温度：250℃，进样量：1.0μL，分流比：(5:1)；载气：高纯氮；流速：2.5mL/min保持6.5min，2.8mL/min 2升至2.8mL/min保持2min；检测器：FID；温度：250℃；尾吹：20mL/min；氢气：30mL/min；空气：300mL/min。

2结果与分析

2.1体外实验

2.1.1探究乳杆菌对RAW246.7细胞的存活率影响

如图1所示，不同MOI值的混合乳杆菌作用于RAW246.7细胞24h后，与对照组相比，混合乳杆菌MOI值为0.1、1和10时对细胞存活率无明显改变，MOI值为100(p<0.05)和1000(p<0.01)时对细胞存活率有显著影响。提示乳杆菌活菌体与细胞之间存在营养物质的竞争作用，当乳杆菌与细胞数量比值过大时，可使细胞非药物致病性死亡。后续研究将选用MOI值为10的混合乳杆菌来评估其抗炎功效及分子机理。

2.1.2乳杆菌对LPS诱导RAW264.7中PGE2浓度及COX-2表达量的影响

如图2A所示，RAW264.7细胞培养基中加入LPS刺激后，与NC组相比，PGE2浓度显著增加(P＜0.05)，LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌处理后，相对LPS组，PGE2含量降低(P＜0.05)。COX-2是PGE2的合成酶，PCR结果显示加入1μg/mL LPS刺激后(图2B)，RAW264.7细胞COX-2mRNA相对表达量显著升高，LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌预处理后，COX-2mRNA相对表达量较LPS组显著降低(P＜0.05)。上述结果表明乳杆菌能够下调COX-2转录水平，抑制PGE2分泌量。

2.1.3乳杆菌对LPS诱导RAW264.7细胞因子浓度及表达水平的影响

如图3所示，1μg/mL LPS刺激RAW264.7细胞中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)浓度显著上升(P＜0.05)。而与LPS组相比，LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌处理后，TNF-α、IL-1β和IL-6浓度都不同程度的降低。同时，PCR结果显示，加入1μg/mL LPS刺激后，RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β和IL-6转录水平显著升高，LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌预处理后，TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA相对表达量较LPS组显著降低(P＜0.05)。上述结果表明乳杆菌能够下调TNF-α、IL-1β和IL-6转录水平，抑制这些细胞因子的分泌量。

2.1.4乳杆菌对RAW264.7细胞TLR4蛋白表达的影响

LPS与TLR4受体结合，能够刺激炎症相关的信号通路，如NF-κB通路。因此，利用Western blot方法测定了RAW264.7巨噬细胞中TLR4的蛋白表达水平。如图4所示，Westernblotting分析结果如图所示，相比于NC组，LPS组RAW264.7细胞的TLR4蛋白表达水平显著升高(p<0.05)。而相比于LPS组，LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌组RAW264.7细胞的TLR4的蛋白表达水平显著降低(p<0.05)，这表明乳杆菌干预可以抑制LPS与TLR4受体的结合。

2.1.5乳杆菌对RAW264.7细胞NF-κB信号通路的影响

为探究NF-κB信号通路在乳杆菌抗炎作用中是否具有相关，NF-κB信号通路中关键蛋白被测定。如图5所示，Western blotting分析结果表明，LPS处理RAW246.7细胞后，LPS组与对照组相比较，IκB蛋白表达水平显著降低，p-IκB蛋白表达水平显著增加，而细胞核内NF-κB p65蛋白表达显著增加，细胞质中NF-κB p65蛋白表达显著更低。LAB1，LAB2，LAB3和混合乳杆菌干预后，与LPS组相比，IκB蛋白表达水平显著增加，磷酸化水平显著降低，且NF-κB p65入核减少，细胞质中p65表达增加。上述结果表明，乳杆菌能够通过抑制NF-κB信号通路，缓解炎症程度。

2.2体内实验

2.2.1小鼠体重及DAI评分变化

在造模期间，每天对小鼠体重进行监测，观察粪便性状，测定小鼠粪便隐血及便血情况，并根据DAI评分标准进行评分。

各组小鼠造模期间体重变化如图6A所示。NC组小鼠在造模期间始终平稳增长，而其它各组小鼠从造模第3天起体重开始下降，但与DSS组相比，SASP，LAB1，LAB2，LAB3以及混合组处理显著缓解体重的下降趋势。当饮用DSS溶液第3天时，DSS组部分小鼠粪便成绿色，到第6天时小鼠粪便松散，少部分小鼠出现带血稀便，黏附于肛门处。干预组在饮用DSS溶液后也出现与DSS组相似的症状，但与DSS组相比，各种症状都有所减轻。如图6B所示，为DAI评分，注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，到第7天时，DSS组小鼠DAI评分显著比NC组更高(P<0.05)，但是各组干预组可以显著降低DAI评分，而且混合乳杆菌组与药物组更加接近。

2.2.2小鼠结肠长度变化

在21天实验结束后，脱臼处死小鼠，取出完整结肠进行测量。各种小鼠结肠长度如图7A所示，NC组小鼠结肠长度最长，而DSS组小鼠结肠最短，与NC组相比较，DSS诱导显著降低结肠长度，其他组小鼠结肠长度较DSS组长。且根据图7B所示，与NC组相比，DSS组小鼠结肠长度显著降低(P<0.05)，LAB1，LAB2及LAB3能够提高结肠长度，但与DSS组差异不显著。然而与DSS组相比，混合乳杆菌的灌胃处理显著提高小鼠结肠长度(P<0.05)，与SASP组具有相同趋势(P<0.05)。这表明混合乳杆菌可以更有效的提高小鼠结肠长度。

2.2.3小鼠脾脏重量变化

各组小鼠脾脏指数变化如8图所示，与NC组小鼠相比较，DSS溶液饮用后小鼠脾脏指数显著提高(P<0.05)，SASP，LAB1，LAB2，LAB3以及混合乳杆菌干预后，脾脏指数下降，并且具有显著性差异，其中混合乳杆菌效果更好(P<0.05)，与药物组效果相似。

2.2.4小鼠结肠组织病理学变化

通过对结肠组织切片进行H&E染色，能够直观地观察出小鼠结肠组织的病理变化。如图9所示，NC组小鼠黏膜层上皮细胞完整未见坏死脱落，可见大量杯状细胞，肠腺丰富且排列整齐；黏膜下层间隙大小均匀，未见明显病理变化。而DSS组小鼠黏膜层大面积坏死，黏膜层隐窝结构消失，伴有炎性细胞弥散性浸润；黏膜下层结缔组织增生，组织间隙增大；肠肌层局部可见肌纤维间隙增大，纤维排列疏松，纤维间可见结缔组织增生。SASP，LAB1，LAB2，LAB3及Mix组肠黏膜层有坏死现象，隐窝结构和杯状细胞不同程度破坏，伴有炎症细胞浸润，但较DSS组小鼠组织学病变有所改善。且根据组织学评分图10可见，与NC组相比，DSS组小鼠组织学评分显著提高，而经LAB1，LAB2，LAB3及混合乳杆菌干预后，能够显著降低小鼠组织学评分，其中混合乳杆菌降低程度最高(P<0.05)，与SASP有相似的效果，说明混合乳杆菌能更有效地减轻结肠组织病理损伤。

2.2.5乳杆菌对小鼠结肠中杯状细胞分布影响

通过对结肠组织切片进行AB-PAS染色，能够直观地观察出小鼠结肠中各种杯状蛋白变化。如图11所示，中性黏液物质呈紫红色，酸性黏液物质呈蓝色，根据杯状细胞着色差异，来分别计数分泌中性黏液蛋白杯状细胞数量和分泌酸性黏液蛋白杯状细胞数量。与NC组相比(图12)，DSS组酸性杯状细胞数和中性杯状细胞数都显著降低，而LAB1、LAB2、LAB3及混合乳杆菌作用下这两种杯状细胞都显著增加，且混合乳杆菌对杯状细胞数目的增加的作用优于单一乳杆菌。

2.2.6小鼠结肠组织髓过氧化物酶(MPO)水平

MPO酶是中心粒细胞的功能和激活标志，反应结肠组织中性粒细胞的浸润程度，其酶活越高，代表炎性细胞的浸润程度越深，表明炎症反应越明显。各组小鼠结肠组织MPO酶活变化如图13所示，DSS组的MPO酶活显著高于NC组，表明在给予DSS后，模型组的炎症程度升高。各干预组与DSS组相比，MPO酶活都有一定程度的下降，特别是混合乳杆菌能够极显著降低MPO酶活(P<0.05)，与SASP具有相似效果，说明乳杆菌干预对炎症有一定程度的缓解，且混合乳杆菌缓解效果最佳。

2.2.7小鼠结肠组织PGE2浓度及COX-2表达量

各组小鼠结肠组织PGE2浓度如图14A所示，DSS诱导后，PGE2浓度较NC组显著更高(P<0.05)。相对DSS组，各干预组可显著降低PGE2的水平的上升(P<0.05)，且混合乳杆菌作用效果最佳。COX-2是PGE2的合成酶，如图14B所示，PCR结果显示，与NC组相比较，DSS组COX-2转录显著上调(P<0.05)，而各干预组能够显著抑制这种上调(P<0.05)。其中混合乳杆菌下调趋势最为明显。上述结果表明，混合乳杆菌可以最有效抑制COX-2转录，从而抑制PGE2的分泌。

2.2.8小鼠结肠组织细胞因子浓度

细胞因子水平的变化，在IBD的发病机理中起主要作用。采用ELISA法测定小鼠结肠中细胞因子水平，结果如图15所示，与NC组相比，DSS组小鼠结肠中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高(P<0.05)，而SASP、LAB1、LAB2、LAB3及混合乳杆菌均不同程度降低了促炎细胞因子水平，提高抗炎因子水平。LAB1、LAB2、LAB3能显著降低TNF-α水平(P>0.05)，但是对IL-1β和IL-6的降低作用无显著性；而混合乳杆菌组小鼠结肠中TNF-α、IL-1β和IL-6含量都显著下降(P>0.05)，与药物组效果相似。此外，与NC组相比，DSS组抗炎因子IL-10水平显著减少(P<0.05)，而各干预组中IL-10水平都显著更高(P<0.05)。此外，混合乳杆菌中IL-10水平与对照组相比无显著差异(P>0.05)。各细胞因子mRNA表达量与相应细胞因子分泌量变化相似。与DSS组相比，DSS处理的小鼠结肠组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的基因转录水平显著上调；而在各干预组小鼠结肠中，这些促炎细胞因子水平较DSS组不同程度降低。与DSS组相比，LAB1和LAB2能显著降低TNF-α和IL-6水平(P>0.05)，但是对IL-1β降低作用无显著性。LAB3和混合乳杆菌组均显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的转录水平(P>0.05)且混合乳杆菌组干预组抑制这些炎症细胞因子转录的降低更为明显，与SASP组相似。此外，DSS诱导显著降低了抗炎因子IL-10转录水平，而各干预组均可显著提高其转录水平(P>0.05)，且混合乳杆菌提高效果最为显著。表明混合乳杆菌抑制DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠组织中炎性细胞因子的表达。

2.2.9小鼠血清中D-乳酸水平

通过检测血清D-乳酸浓度，能有效判断肠黏膜修复及评估肠道通透性改变情况。由图16所示，DSS组D-乳酸含量显著高于NC组(P<0.05)。乳杆菌LAB1、LAB2、LAB3及Mix组与DSS组比较是降低的，并且有显著性差异，其中Mix组降低程度最大。表明灌胃嗜酸乳杆菌KLDS1.0901、瑞士乳杆菌KLDS1.8701、植物乳杆菌KLDS1.0318及混合乳杆菌能够降低血清中D-乳酸浓度，对小鼠肠黏膜通透性有所改善。

2.2.10小鼠结肠组织紧密连接蛋白mRNA表达水平

小鼠结肠中紧密连接蛋白mRNA表达水平如图17所示。与NC组相比，DSS能够显著降低ZO-1、Occludin和Claudin-1转录水平(P<0.05)，对E-cadherin转录水平影响不显著。而各干预均不同程度提高了紧密连接蛋白转录水平。LAB1和LAB2能显著提高ZO-1和Occludin转录水平(P>0.05)，但是对Claudin-1作用无显著性；而LAB3和混合乳杆菌均可显著提高小鼠结肠中ZO-1、Occludin和Claudin-1转录水平(P<0.05)，其中混合乳杆菌，其中混合乳杆菌提高效果最为显著。上述结果，表明混合乳杆菌最有效提高小鼠结肠紧密连接蛋白，改善小鼠肠道屏障功能。

2.2.11小鼠结肠组织粘蛋白mRNA表达水平

各组小鼠结肠组织粘蛋白(MUC1和MUC2)mRNA表达水平如图18所示，DSS组粘蛋白MUC1和MUC2表达显著降低较NC组比较(P<0.05)。与DSS组相比较，SASP、LAB1、LAB2、LAB3及Mix组小鼠结肠组织MUC1和MUC2转录水平显著提高(P<0.05)。其中，混合乳杆菌组MUC1表达与NC组无显著性差异(P<0.05)，MUC2表达较NC组更高(P<0.05)。上述结果表明，混合乳杆菌提高结肠组织粘蛋白表达最为显著。

2.2.12肠道菌群的结构与组成

2.2.12.1肠道微生物结构在门水平上的差异

在门水平上，主要包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。与NC组相比，DSS组小鼠肠道中拟杆菌门和变形菌门的相对丰度增加，而厚壁菌门和疣微菌门相对丰度降低。而与DSS组相比，LAB1组、LAB2、LAB3、Mix组均可降低小鼠肠道中的变形菌门，LAB1组和Mix组可提高厚壁菌门降低拟杆菌门相对丰度。可见，乳杆菌的干预能够在门的水平改善小鼠肠道菌群。

3.3.12.1肠道微生物结构在属水平上的差异

在属水平上肠道微生物组成中，与NC组相比，DSS组小鼠肠道中大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)、另枝菌属(Alistipes)、理研菌科RC9属(Rikenellaceae RC9)、拟杆菌属(Bacteroides)的丰度升高，而这些菌属的丰度在LAB1组、LAB2、LAB3、Mix组都有不同程度的降低；然而，与NC组相比，DSS组小鼠肠道中毛螺菌属(LachnospiraceaeNK4A136group)、螺旋菌属(Helicobacter)、瘤胃梭菌属9(Ruminiclostridium9)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)的相对丰度有所降低，而与DSS组相比，除LAB2组外其他干预组均可提高Lachnospiraceae NK4A136group的相对丰度，且所有干预组均可提高瘤胃梭菌属9的相对丰度。由此可知，乳杆菌干预能有效逆转属水平上结肠炎小鼠微生物结构的变化。

2.2.13肠道中的短链脂肪酸含量

如图19所示，为短链脂肪酸标准品TIC图，从图中可见各代谢物色谱分离较好，峰形尖锐对称，能够对各代谢物进行质谱定量。

短链肪酸标准曲线结果见表4。以标准品种各组分与内标的浓度之比为横坐标，峰面积之比为纵坐标，依据各组分在总浓度中所占的比例浓度比例分别对各种组分计算线性和相关系数，以此来考察标准溶液的线性。结果表明，各待测物的在线性范围内的线性良好，相关系数均大于0.99。

表4 SCFAs的标准曲线表

如表5所示，小鼠肠道内容物中SCFAs含量与NC组小鼠相比，DSS组小鼠盲肠内容物中乙酸，丁酸和总酸含量显著降低(P＜0.05)，丙酸，异丁酸，戊酸和异戊酸无显著性变化。与DC组相比，经乳杆菌干预后的小鼠盲肠内容物中，乙酸，丁酸和总酸的浓度均不同程度增加，其中混合乳杆菌组中乙酸含量与DSS组具有显著性差异，但与NC组相比无显著性差异。上述结果表明，乳杆菌干预可以增加小鼠肠道内容物中SCFAs的含量，且混合乳杆菌优于单一菌株效果。

表5 SCFAs含量表

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。