间充质干细胞来源的一种诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症中的应用
阅读说明：本技术 间充质干细胞来源的一种诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症中的应用 (Application of induced extracellular vesicle derived from mesenchymal stem cell in treating Alzheimer's disease ) 是由 赵陆 寇晓星 施松涛 于 2020-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症产品中的应用。本发明发现采用诱导性细胞外囊泡治疗阿尔茨海默症具有以下优势：IEVs的产量更加丰富,单个MSC能够产出300-1000个IEVs；IEVs的制备流程简单,耗时短,对试剂和设备的要求低,治疗效果好。因此,以MSCs来源的IEVs为基础的细胞外囊泡疗法具备良好的应用前景。本发明发现IEVs作为生理性囊泡可以通过血脑屏障到达颅内；并且可以结合脑内代谢产物β淀粉样蛋白通过非经典途径直接经过颅骨排出体外到达头发表层,从而发挥治疗作用。(The invention provides application of induced extracellular vesicles in a product for treating Alzheimer's disease. The invention discovers that the following advantages are achieved when the induced extracellular vesicles are used for treating the Alzheimer's disease: the yield of IEVs is richer, and a single MSC can yield 300-1000 IEVs; the preparation process of IEVs is simple, short in time consumption, low in requirements on reagents and equipment and good in treatment effect. Therefore, the extracellular vesicle therapy based on IEVs derived from MSCs has good application prospect. The present invention finds that IEVs as physiological vesicles can reach the cranium through the blood brain barrier; and can be combined with the intracerebral metabolite beta amyloid protein and directly discharged out of the body through the skull by a non-classical way to reach the surface layer of the hair, thereby playing a therapeutic role.)
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及间充质干细胞来源的一种诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症是最常见的神经退行性疾病，最主要的疾病表现是认知障碍，痴呆症的50％-75％是由阿尔茨海默症造成的。2018年美国报道阿尔茨海默症成为2014年和2015年全因死亡的第六大疾病，并且以15.7％的上升率成为十大全因死亡疾病变化之首。30年来，生物医学研究者们一直在努力寻找阿尔茨海默症的治疗对策，然而目前尚没有能够有效改善症状的药物。已有研究表明细胞外泌体(exosomes)能够通过搬运或清除脑内代谢产物β淀粉样蛋白从而改善症状，然而临床研究并未见效果。
细胞凋亡是细胞程序性死亡，其特征包括明显的细胞收缩、染色质浓缩和细胞膜出泡。细胞凋亡产生大量的凋亡小体，含有多种细胞成分。星形孢菌素(staurosporine，STS)能够在体外诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的细胞凋亡，在此过程中会产生大量的细胞外囊泡。以往研究主要集中在细胞凋亡本身，对伴随产生的细胞外囊泡缺乏系统和深入的研究。本申请的发明人/课题组的前期研究证实，STS体外诱导产生的细胞外囊泡对MSCs的稳态有重要的调节作用，能够显著改善骨质疏松小鼠的骨质破坏情况。目前还未有通过细胞外囊泡治疗阿尔茨海默症的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症产品中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症产品中的应用。
细胞外囊泡—这个词是由国际细胞外囊泡学会(ISEV)创造的术语，根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径可以对囊泡进行分类：外泌体(exosomes)直径为30-150nm，起源于内吞途径，其密度约为1.11-1.19g mL-1；微粒/微囊泡(microparticles/microvesicles)直接从质膜释放，直径约100-1000nm；凋亡小体(apoptotic body/bleb)直径约为50nm-2μm，由细胞凋亡产生；肿瘤小泡(large oncosomes)直径约1-10μm，由肿瘤细胞释放产生；以及其他各种EV亚群。由于不同EV亚群的大小以及它们的所包含的生物分子存在差异，因此现在已经有几个小组开始表征EV亚群的组成。最近的论文声称，基于一般表面蛋白质组学分析或个别EV群体的转录谱，对细胞外囊泡进行了成功的亚群分类。目前可以通过差速离心、过滤、免疫亲和、层析、流式细胞分选、密度梯度离心选取不同密度区域等多种手段大致分离不同的细胞外囊泡亚群，但是这些方法都不能完全纯化到特定的亚群，分离到的通常是富集了某一个亚群同时带有其他细胞外囊泡亚群。
优选地，所述诱导性细胞外囊泡为间充质干细胞来源的诱导性细胞外囊泡。
优选地，所述间充质干细胞包括口腔颌面部组织、骨髓、脂肪、脐带来源的间充质干细胞。
优选地，所述诱导性细胞外囊泡为骨髓间充质干细胞来源的诱导性细胞外囊泡。
本发明还提供一种产品，所述产品活性成分包括如上所述的诱导性细胞外囊泡，所述产品用于治疗阿尔茨海默症。
优选地，所述产品具有如下任意一种或多种用途：
(1)增加CA1区神经元数目；
(2)减少β-淀粉样蛋白沉积；
(3)抑制阿尔茨海默病脑中的炎症反应；
(4)增加头部皮肤β-淀粉样蛋白的表达；
(5)清除神经元内的β-淀粉样蛋白。
优选地，所述产品为药物。
优选地，所述药物还包括医学上可接受的载体。
优选地，所述药学上可接受的载体包括抗氧化剂和稳定剂。
本发明的有益效果：本发明提供了诱导性细胞外囊泡在治疗阿尔茨海默症产品中的应用，拓展了治疗阿尔茨海默症的新方法。与外泌体相比，诱导性细胞外囊泡(inducedextracellular vesicles,IEVs)更具有优势，主要体现在：IEVs的产量更加丰富，单个MSC能够产出300-1000个IEVs；IEVs的制备流程简单，耗时短，对试剂和设备的要求低，治疗效果好。因此，以MSCs来源的IEVs为基础的细胞外囊泡疗法具备良好的应用前景。本发明发现IEVs可以通过血脑屏障到达颅内；并且可以结合脑内代谢产物β淀粉样蛋白通过非经典途径直接经过颅骨排出体外到达头发表层，从而发挥治疗作用。
附图说明
图1为诱导收集骨髓间充质干细胞来源的IEVs的具体操作流程图。
图2为通过透射电镜观察的骨髓间充质干细胞来源的IEVs电镜图。
图3为纳米粒子跟踪分析所显示骨髓间充质干细胞来源的IEVs的颗粒直径分布图。
图4为采用流式细胞技术对骨髓间充质干细胞来源的IEVs的表面膜蛋白进行分析结果图。
图5A-D为骨髓间充质干细胞来源的IEVs的内容物分析：图5A为DIA定量技术对MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs蛋白组学定量分析结果；图5B为筛选IEVs的特异性高表达的蛋白绘制的热图；图5C为差异蛋白的GO富集分析IEVs表达Annexin V，Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntexin4分子的结果；图5D为Western Blot验证MSCs、MSCs-Exosomes、MSCs-IEVs表达Annexin V,Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntexin 4的结果。
图6为骨髓间充质干细胞来源的IEVs对阿尔茨海默病脑组织结构的影响：图6A通过HE染色比较分析了野生型(WT)、给予和未给予IEVs治疗的阿尔茨海默病模型(AD)海马齿状回区(SGZ)结构的变化。图6B为CA1区神经元宽度的变化。说明给予该IEVs治疗后AD小鼠海马区大小和CA1区神经元数目较未治疗前有所恢复。
图7为骨髓间充质干细胞来源的IEVs对阿尔茨海默病脑炎症和Aβ的影响：图7A通过免疫荧光染色比较了该IEVs治疗后阿尔茨海默病模型(AD)DG区小胶质细胞的表达减少。图7B为免疫荧光染色说明IEVs治疗后阿尔茨海默病模型(AD)海马区Aβ斑块减少。说明给予该IEVs治疗能够显著改善阿尔茨海默病脑的炎症和Aβ斑块(β-淀粉样蛋白)沉积。
图8为小鼠尾静脉注射绿色荧光标记的IEVs，分别于1天、3天、7天检测脑组织中该IEVs的表达情况，说明其能够通过血脑屏障进入脑组织。
图9为小脑延髓池注射(CM)注射IEVs，分别于1天、6天检测该IEVs从颅内外排过程。说明其可能从颅内经颅骨排出至皮肤表面。
图10为尾静脉注射IEVs治疗后，头顶皮肤Aβ的表达情况。图10A为头部皮肤代谢产物Aβ的表达(400×)；图10B为头部皮肤代谢产物Aβ的表达的统计结果。说明给予该IEVs治疗后能够恢复阿尔茨海默症小鼠头顶皮肤Aβ表达的减少。
图11为骨髓间充质干细胞来源的IEVs对Aβ的清除。图11A为Aβ与该IEVs的结合；图11B为IEVs对神经元内Aβ的清除。说明体外骨髓间充质干细胞来源的IEVs与Aβ结合，并且能够清除神经元内的Aβ。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种诱导性细胞外囊泡的制备方法，包括以下步骤：
(1)IEVs的提取：
体外培养MSCs(口腔颌面部组织、骨髓、脂肪或脐带来源的MSCs)，采用星形孢菌素、紫杉醇或紫外照射等多种方法诱导处细胞，本实施例以星形孢菌素诱导提取IEVs为例，体外培养MSCs细胞汇合80％-90％时，用PBS冲洗2遍，加入含500nM星形孢菌素的无血清培养基，以37℃孵育16-24h，收集细胞上清液，4℃下800g离心10分钟，收取上清液4℃下2000g离心10分钟，再次收集上清液4℃下16000g离心30分钟，所得沉淀物即为IEVs。1ml PBS重悬清洗沉淀，4℃下16000g再次离心30分钟，即得到清洗后的IEVs。使用时，取适量PBS等缓冲液重悬IEVs。
(2)IEVs的检测：
采用流式细胞技术对提取的IEVs进行定量分析；采用透射电镜(TEM)观察，大部分囊泡的直径都在1um以下，200nm左右。
纳米粒子跟踪分析(NTA)结果与透射电镜观察结果相符，1um以下的IEVs颗粒直径平均为244nm，见图2(透射电镜)及图3(纳米粒子跟踪分析)。
使用流式细胞技术对IEVs的表面膜蛋白进行分析见，图4，MSCs来源的IEVs能够表达和MSCs相似的表面蛋白，即CD29,CD44,CD73,CD166阳性，CD34,CD45阴性。同时，IEVs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白CD9,CD63,CD81和C1q。此外，IEVs的膜表面分布有大量的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)。
利用蛋白DIA定量技术完成MSCs，MSCs-Exosoms(外泌体)，MSCs-IEVs的蛋白组学定量分析。结果显示，170种蛋白在IEVs中特异性高表达，结合差异蛋白的GO富集分析结果，进行western blot验证，发现MSCs-IEVs能特异性高表达Annexin V,Flotillin-1，Cadherin 11，Integrin alpha 5和Syntexin 4。以上5种蛋白有望成为区分MSCs来源的IEVs和exosomes的特征性蛋白标志物，见图5。
实施例2动物实验
利用APP/PS1转基因阿尔茨海默病小鼠动物模型，通过尾静脉注射约200μL的MSC-IEVs的PBS悬液(IEVs约8×108个)，每周一次，连续四次，全部注射结束后一个月处死动物，收集样本。关于IEVs的示踪相关实验中，先用PKH67对提取收集的IEVs进行膜染色标记，然后进行尾静脉注射，并在相应天数后收集样本，实验结果如图6～11所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。