阅读说明：本技术 小麦基因TaAn在提高植物DON耐受性和FHB抗性中的应用 (Application of wheat gene TaAn in improving DON tolerance and FHB resistance of plants ) 是由 廖玉才 刘刚 杨鹏 左东云 李和平 张静柏 黄涛 何伟杰 粘俊娜 易述远 于 2020-11-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物基因工程技术领域,具体涉及利用小麦基因TaAn提高植物的DON耐受性和赤霉病抗性。通过筛选小麦悬浮细胞抑制差减杂交cDNA文库及RACE克隆基因全长的方法,从小麦品种郑麦9023中分离得到一个受DON诱导的基因TaAn。利用农杆菌介导的遗传转化方法,使该基因在拟南芥中超量表达,提高了转基因拟南芥对DON耐受能力和对赤霉病的抗性；利用农杆菌介导的遗传转化方法,使该基因在小麦中组成型表达,提高了转基因小麦对DON耐受能力,研究证实了该基因作为植物抗赤霉病功能的新用途。(The invention belongs to the technical field of plant genetic engineering, and particularly relates to a wheat gene TaAn Improve the DON tolerance and the gibberellic disease resistance of the plants. Separating a gene induced by DON from Zheng wheat 9023 of a small wheat variety by screening a wheat suspension cell inhibition differential hybrid cDNA library and a RACE clone gene full length method TaAn . The gene is overexpressed in arabidopsis thaliana by utilizing an agrobacterium-mediated genetic transformation method, so that the DON tolerance capacity and the gibberellic disease resistance of the transgenic arabidopsis thaliana are improved; the agrobacterium-mediated genetic transformation method is utilized to make the gene constitutively expressed in wheat, the DON tolerance capability of transgenic wheat is improved, and researches prove that the gene is used as a plantNew use of the compound for resisting head blight is provided.)

小麦基因TaAn在提高植物DON耐受性和FHB抗性中的应用

技术领域

本发明属于小麦转基因技术领域，具体涉及利用小麦基因TaAn提高植物的DON耐受性和FHB抗性。所述的基因为小麦TaAn基因，该基因被证实是一种具有抗菌肽功能的新的小麦基因，在植物的防御反应中起着重要的作用。TaAn基因受到DON的诱导，参与植物细胞防御反应的调控。超表达该基因可以提高拟南芥对DON的耐受性及FHB的抗性；组成型表达该基因可以提高小麦对DON的抗性。利用基因TaAn有望提高植物的赤霉病抗性，为转基因小麦抗赤霉病育种提供新的安全的抗性种质资源。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，由镰刀菌引起的小麦赤霉病(Fusariumhead blight, FHB)是世界范围内的重要真菌病害，致病真菌主要包括禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、燕麦镰刀菌(Fusarium avenaceum)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)和梨孢镰刀菌(Fusarium poae)等，其中禾谷镰刀菌是世界范围内的最主要致病菌。在小麦主产区每隔4-5年都会有一次大规模的赤霉病流行。2010年以来，赤霉病大区流行的频率在我国呈逐年上升的趋势，基本上每隔1-2年就会有一次大范围流行，其中2012年最为严重。从2000到2018年，我国平均每年受赤霉病影响的小麦耕地面积约450万公顷，占小麦总耕地面积的20％，平均每年造成小麦产量损失约为341万吨。赤霉病菌主要在花期侵染小麦穗部，并通过穗轴的维管束感染周围小穗，引起小麦穗部枯萎，籽粒发育异常，并伴随红色霉斑。禾谷镰刀菌在侵染小麦过程中会产生多种真菌毒素，如玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalenol,DON)、雪腐镰刀菌烯醇(Nivalenol,NIV)，其中以DON为主，严重威胁小麦的产量和品质。DON对动物的慢性毒性效应表现为呕吐，食欲下降，体重减轻，流产以及免疫抑制。

TaAn基因编码73个氨基酸，在NCBI数据库中没有功能注释，属于小麦未知功能蛋白。我们在前期研究中，从小麦悬浮细胞的抑制差减杂交文库(suppression subtractivehybridization，SSH)中筛选到一个523bp的EST片段，受到DON的强烈的诱导，之后通过 3’RACE和5’RACE克隆到了基因的全长，将该基因命名为TaAn。鉴于在小麦中的TaAn基因能否提高植物的FHB抗性尚无报道，因此，从小麦中分离到TaAn基因，在拟南芥中超表达该基因后，能够提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性，在小麦中组成型表达该基因，可以提高小麦的FHB抗性，对于培育小麦抗病新品种具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供小麦的TaAn基因在植物赤霉病抗性改良中的应用。通过筛选小麦悬浮细胞抑制差减杂交cDNA文库及RACE克隆基因全长的方法，从小麦中分离得到一个受DON诱导的基因TaAn，进一步将该基因在拟南芥中超量表达提高了转基因拟南芥对DON耐受能力和对赤霉病的抗性，通过将该基因在小麦中组成型表达提高了转基因小麦对DON耐受能力，研究证实了该基因作为植物抗赤霉病功能的新用途。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

小麦基因TaAn的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

小麦基因TaAn在提高植物对DON的耐受性和赤霉病抗性中的应用：在本发明的具体实施例中，利用PCR扩增小麦基因TaAn的编码区域，并在两端分别添加EcoR I和BamH I酶切位点，连接到中间载体PTRAkc-VDM1-ERH中，得到植物超量表达载体 PTRAkc-35SS-TaAn，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化拟南芥，获得TaAn基因超量表达的转基因拟南芥，通过接种DON毒素和禾谷镰刀菌5035的孢子液，结果表明，转基因拟南芥的根长和鲜重都明显高于野生型，T₂代和T₃代转基因株系的发病指数显著降低，验证了转基因拟南芥的抗赤霉病能力。利用PCR扩增小麦基因TaAn的编码区域，并在两端分别添加 Sma I和Spe I酶切位点，连接到中间载体pCAMBIA3300中，得到植物组成型表达载体 pCAMBIA3300-Ubi-TaAn，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化小麦，获得TaAn基因组成型表达的转基因小麦，通过苗期接种DON，结果表明，转基因小麦的根长与野生型和对照相比， DON的抑制作用显著减弱，验证了转基因小麦的抗DON毒素的能力。其中，所述的植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaAn和植物组成型表达载体pCAMBIA3300-Ubi-TaAn包含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的优点在于：

本发明克隆的TaAn基因可以提高拟南芥和小麦植株对真菌毒素DON的耐受性，并且显著提高了转基因拟南芥对赤霉病病原菌禾谷镰刀菌的抗性。

本发明所使用的植物超表达载体pTRAkc-35SS-TaAn能够在拟南芥中高效表达TaAn基因，植物组成型表达载体pCAMBIA3300-Ubi-TaAn能够在小麦中组成型表达TaAn基因，使提高小麦的赤霉病抗性和DON毒素的耐受性成为可能。

附图说明

图1：本发明分离克隆TaAn基因及功能鉴定的总体技术路线图。

图2：TaAn基因的全长序列克隆的电泳图。A图为3’RACE产物，B图为5’RACE产物，C图为TaAn基因的全长cDNA。

图3：TaAn基因在郑麦9023(Z9)和苏麦3号(S3)两个小麦品种中，接种DON、禾谷镰刀菌5035和Tri5^－孢子液后的表达模式。图3中的A图为小麦品种Z9和S3接种DON 毒素后TaAn基因的表达模式；图3中的B图为小麦品种Z9和S3接种不同的禾谷镰刀菌菌株5035和Tri5^－后TaAn基因的表达模式。表明本发明的TaAn基因能被DON和产毒菌株禾谷镰刀菌5035诱导表达，而Tri5基因缺失的菌株Tri5^－对TaAn基因的表达没有影响。

图4：中间载体PTRAkc-VDM1-ERH的结构图谱。

图5：本发明构建的拟南芥超量表达载体PTRAkc-35SS-TaAn的结构图谱。

图6：转基因拟南芥的分子鉴定及表达量分析。A图为转基因拟南芥的PCR鉴定，引物为TaAn-F2/TaAn-R2，目的产物大小为281bp；B图为转基因拟南芥中TaAn基因的表达量分析，扩增TaAn基因的引物为TaAn-F3/TaAn-R3，目的片段大小为281bp；内参基因Actin的扩增引物为Actin-F/Actin-R，目的片段大小为135bp。

图7：T₂代转基因拟南芥幼苗在不同浓度DON(0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL及15ng/μL)条件下处理2周后的表型。

图8：T₃代拟南芥接种禾谷镰刀菌5035孢子液后，7天和10天的表型。

图9：本发明构建的小麦组成型表达载体Pcambia3300-Ubi-Nos的中间载体结构图谱。

图10：本发明构建的小麦组成型表达载体Pcambia3300-Ubi-TaAn的结构图谱。

图11：T₂代转基因小麦植株PCR鉴定结果。

图12：T₂代转基因小麦幼苗在不同浓度DON(0mM、10mM、20mM)条件下处理1 周后的表型。

具体实施方式

实施例1：分离克隆TaAn基因的全长序列

从小麦的悬浮细胞的抑制差减杂交文库(SSH)中筛选得到523bp的EST片段，受到DON的强烈诱导(发明人的前期工作，未发表)。根据该序列，设计了该片段特异引物 TaAn-F1/TaAn-F2和TaAn-R1/TaAn-R2，与3’-RACE和5’-RACE通用引物组合(见表1)，按照RACE试剂盒(购自Clontech公司)说明书操作，PCR反应体系的总体积为50μL，cDNA 模板1μL(约100ng)、10×KOD plus buffer酶反应缓冲液5μL、2.5mM dNTP 5μL、10μM 引物1.5μL、1μLKOD酶，加双蒸水至50μL。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、 60℃30s、72℃3min、35个循环，72℃延伸5min。PCR扩增结果如图2，3’RACE得到 422bp的片段(图2中的A图)，5’RACE得到468bp的片段(图2中的B图)，二者拼接之后得到523bp的片段，设计引物TaAn-F3/TaAn-R3(表1)扩增TaAn全长并测序得到523bp 的片段(图2中的C图，SEQ ID NO.1)。

表1基因克隆所用到的引物

表1的说明：引物名称后的英文字母F，R分别代表正向引物和反向引物。

实施例2：检测小麦品种中TaAn基因的表达模式

选择两种小麦品种，郑麦9023(对FHB感病，国审品种，国审麦2003027，简称Z9，参见Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducible expression of a fusionprotein containing a Fusarium-specific antibody and a fungal chitinaseprotects wheat against Fusarium pathogens and mycotoxins.Plant BiotechnologyJournal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)和苏麦3号(对FHB抗病，1970年由江苏地区农科所选育，对赤霉病高抗，简称S3，参见Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducibleexpression of a fusion protein containing a Fusarium-specific antibody and afungal chitinase protects wheat against Fusarium pathogens andmycotoxins.Plant Biotechnology Journal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)，作为表达谱分析的材料。种子催芽后，置于4℃冰箱春化处理(催芽和春化处理是本领域的常规方法)2周，移栽至温室。在小麦扬花初期，选择生长状态一致的小麦穗子，用剪刀剪去麦穗中部小穗的麦芒，用微量注射器注入10μL， 5×10⁵个/mL的孢子液或是无菌水或是15μL1.5mg/mL的DON溶液，每株接种一个做过标记的中部小穗，套上透明塑料袋保湿3天后揭掉袋子，接种孢子液的小穗分别于24h、48h、72h和96h取样，接种DON毒素的小穗于4h、12h、24h和48h取样。将所取的样品首先置于液氮中冻存，然后置于-80℃冰箱保存。利用Trizol(购自Invitrogen公司)试剂提取总 RNA(试验步骤按照Trizol试剂说明书操作)。利用反转录酶SuperScript^TMⅢ(购自Invitrogen 公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为： 65℃5min，50℃60min，70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物对 TaAn-F3/TaAn-R3(见表1)基因进行特异的PCR扩增。同时用引物Actin-F/Actin-R对小麦 Actin基因(AB181991)做特异扩增(扩增产物长135bp)，以作为内参基因进行定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(荧光检测实时定量分析为本领域常用方法，参见文献：Li等， Resistance to Fusarium head blight and seedling blight in wheat isassociated with activation of a cytochrome P450 gene.Phytopathology.2010.100:183-191)。结果表明(图3A)，TaAn基因受到DON毒素的强烈诱导，接种4h后在Z9和S3中分别诱导表达305倍和440倍，在Z9中 12h时到达诱导高峰值，为17040倍，随后表达量逐渐降低，而在S3 24h时达到到高峰值，为2729倍，随后表达量逐渐降低，但是诱导效率仍然很高。24h时在Z9和S3中诱导倍数分别为7354倍和2729倍，在48h时的诱导倍数分别为5793倍和1715倍。由此可见， DON能快速激活TaAn基因，激活后表达量会急剧上升，在Z9中12h的表达量是4h的 56倍，尽管在24h和48h时表达量缓慢下降，但其表达量仍是4h的24倍和19倍。如图 3B所示，TaAn基因同时也受到禾谷镰刀菌5035产毒真菌(由发明人所在试验室1999年在武汉分离与保存的一种高致病力禾谷镰刀菌菌株，参见Xu等，Disruption of the chitinsynthase gene Chs1 from Fusarium asiaticum results in an altered structure ofcell walls and reduced virulence.Fungal Genetics and Biology.2010.47:205-215)的诱导，但是非产毒菌Tri5^－(由发明人所在试验室构建与保存的一种禾谷镰刀菌Tri5基因缺失突变菌株，参见Xu等，Disruption of the chitin synthase gene Chs1 fromFusarium asiaticum results in an altered structure of cell walls and reducedvirulence.Fungal Genetics and Biology.2010.47:205-215)对其表达没有影响。在禾谷镰刀菌5035在麦穗中开始产毒后(36h)，TaAn基因开始诱导表达，而且该基因的诱导表达只与DON有关，与小麦品种及其FHB抗性(即遗传背景)没有关系。

实施例3：TaAn基因超量表达载体的构建和转化拟南芥

为了能更好的分析TaAn基因的功能，将TaAn基因在拟南芥中超量表达，从转基因拟南芥的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建方法如下：以小麦品种郑麦9023(Z9)DON处理12h后的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用引物TaAn-F2/TaAn-R2(请见表1)，扩增出包含TaAn基因完整编码区的cDNA片段(见序列表SEQ ID NO:2所示的序列)，在该cDNA片段的两端分别添加EcoRI和BamH I酶切位点，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30 sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物电泳后，切取234bp左右的目的片段，用DNA片段回收试剂盒(购自Axgen公司)，向凝胶中加入3倍体积的DE-A缓冲液(试剂盒自带)，75℃水浴溶解6min，使凝胶完全溶解后，加入1.5倍体积的DE-B缓冲液(试剂盒自带)，移入回收柱中，以12000rpm离心1min，弃流出的液体，向回收柱中加入500μL washing buffer 1，12000rpm离心1min，再向回收柱中加入700μL washing buffer 2， 12000rpm再离心1min，重复用washing buffer 2洗涤一次，加入25μL elution buffer，静置 2min后，12000rpm离心2min，得到纯化的PCR产物即TaAn基因，将上述纯化后的PCR 产物分别用EcoR I和BamH I酶切后，无水乙醇沉淀回收。同时也将载体PTRAkc-VDM1-ERH (见图4，由华中农业大学麦类作物分子生物技术试验室改造)分别用EcoR I和BamH I酶切后，切胶回收载体骨架约7500bp，最后将酶切好的目的片段用T₄ DNA ligase(NEB)连接到载体骨架中，构建得到超量表达载体，其后转化大肠杆菌DH5α，通过筛选阳性克隆，得到重组载体的PTRAkc-35SS-TaAn(图5)。

转基因植株的遗传转化与筛选鉴定：

TaAn基因的遗传转化拟南芥

通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法将上述超表达载体PTRAkc-35SS-TaAn转入到拟南芥中，农杆菌介导的拟南芥的遗传转化方法是参考Zhang Xiuren等人报道的方法(Zhang Xiuren等，Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thalianausing the floral dip method，Nature protocols，1:641-646，2006)。具体操作步骤如下：拟南芥培养至顶生花序约3cm时，去除其顶生花序以刺激侧生花序生长。在侧生花序长至6～10cm时进行转化。转化前使土壤吸足水分，并将已授粉的小花及幼嫩角果去除。根癌农杆菌划线培养至出现单菌落，挑取单菌落至5mL YEB培养基中，28℃、200r/min振荡培养40h，按1：100比例接种至50mL YEB培养基中，28℃、200r/min振荡培养至OD₆₆₀达0.8左右，6000r/min离心15min 收集菌体，用等体积转化重悬液重悬菌体沉淀。将拟南芥植株莲座叶以上部分全部浸入重悬液中，保持15sec。转化后的植株平放于铺有润湿滤纸的托盘中，盖上保鲜膜以保持湿度，1h 后，按照同样的方法再处理一次。黑暗条件下保持24h后将植株取出直立，于22℃、8h光照条件下培养。待植株正常开花结实后收获种子，干燥后-20℃保存备用。收获的种子放入离心管中，先用浓度为70％酒精处理1min，再用0.15％次氯酸溶液处理2min，无菌水清洗数次；播种在1/2MS培养基(pH 5.7，含Kan 50mg/mL)上以筛选阳性转化子，每皿约1000粒种子， 4℃春化3～4d后，于22℃、8h光照条件下培养。能正常生长的植株长至5、6片叶后移栽至营养土中。

转基因拟南芥阳性植株的分子鉴定与表达量分析

提取转基因T₀代植株新鲜叶片提取DNA(使用植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司产品)，目的基因引物TaAn-F2/TaAn-R2进行PCR阳性检验，结果见图6中的A图。

转基因拟南芥性植株TaAn基因的表达量分析

利用Trizol(购自Invitrogen公司)试剂提取转基因阳性植株An-1和An-2的总RNA(试验步骤按照Trizol试剂说明书操作)。利用反转录酶SuperScript^TMⅢ(购自Invitrogen公司) 将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃ 5min，50℃60min，70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物对 TaAn-F3/TaAn-R3(见表1)基因进行特异的PCR扩增。同时用引物Actin-F/Actin-R对小麦 Actin基因(AB181991)做特异扩增(扩增产物长135bp)，以作为内参基因进行半定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，28个循环。电泳检测 PCR产物的浓度。结果表明(见图6的B图)，TaAn基因在转基因拟南芥中大量表达。

实施例4：TaAn超量表达转基因拟南芥T₂/T₃代株系在DON胁迫下的生长状况

本实施例选取转TaAn基因的超量表达的T₂代株系(编号为An-1)进行了不同浓度的DON 胁迫试验。具体步骤如下：将超量表达转基因株系(An-1)种子按常规方法消毒(先用浓度为70％酒精处理1min，再用0.15％次氯酸溶液处理2min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L 卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，将野生型拟南芥(非转基因，简称WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，在4℃春化处理2天，置于20℃，生长7天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有0ng/μL、5ng/μL、10ng/μL及15ng/μL四种不同浓度DON的1/2MS培养基上。生长2周后，测量转基因植株和野生型植株的根长和鲜重，试验重复3次，每次每个株系20株苗。试验结果表明(图7)，在0ng/μL和5ng/μL两种浓度DON的条件下，野生型和转基因植株的根长和鲜重没有明显差异，但是DON能够抑制拟南芥的生长。在10ng/μL及15ng/μL DON浓度下，野生型和转基因植株的生长均受到了抑制，但是转基因植株的根长和鲜重都明显高于野生型，而且在15ng/μL DON浓度下差异最大。因此选择15ng/μL DON浓度进行后续的DON胁迫试验。

不同转基因株系(编号为An-1和An-2)T₂/T₃株系在15ng/μL DON浓度下的胁迫试验。具体步骤如下：将超量表达转基因株系(An-1和An-2)T₂/T₃种子消毒(浓度为70％酒精处理1 min，0.15％次氯酸处理2min，无菌水清洗5次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型拟南芥(WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2天，置于20℃，生长7天后挑选发芽好且长势一致的幼苗转移到含有15ng/μL DON浓度的1/2MS培养基上。生长2周后，测量转基因拟南芥和野生型拟南芥的根长和鲜重，试验重复3次，每次每个株系20株苗。试验结果表明(表2)，不同转基因株系(An-1和An-2)T₂/T₃材料在15ng/μL DON浓度下，根长和鲜重均较野生型要高，说明TaAn基因的超量表达确实能够提高转基因拟南芥的 DON耐受性，具体结果见表2。

表2转基因株系(An-1和An-2)T₂/T₃材料在15ng/μL DON浓度下处理2周的根长与鲜重

a表示在0.05水平具有显著性差异

b表示在0.01水平具有显著性差异

实施例5：TaAn超量表达转基因拟南芥T₂代株系的FHB抗性分析

本实施例选取了不同转基因株系(编号为An-1和An-2)T₂/T₃株系，接种禾谷镰刀菌5035孢子液，浓度为5×10⁵个/mL后，分析植株的发病情况。具体步骤如下：将超量表达转基因株系(An-1和An-2)T₂/T₃种子消毒(浓度为70％酒精处理1min，0.15％次氯酸处理2 min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型拟南芥(WT) 播种于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，4℃春化处理2天，置于20℃，生长7天后移栽到小钵中。试验用的土壤为炭泥土：蛭石：珍珠岩＝2：1：1(重量比)混合而成。置于短光照条件(8小时光照/16黑暗)20℃生长35天左右，此时拟南芥开花比较茂盛，选取生长状态比较一致的植株，进行禾谷镰刀菌5035孢子喷雾接种，每株均匀喷雾一次。具体接种方法如下：调整好浓度的孢子液添加0.001％的Silwet L-77，选择喷雾效果较好的小型喷雾器，均匀喷撒至拟南芥的花序部位，并注意随时震荡喷雾器，使孢子液均匀悬浮，避免孢子液的沉淀；喷雾接种后的拟南芥用大的塑料罩子罩住保湿，避光保湿2天，让孢子充分萌发，相对湿度为100％，每天喷水保湿；2天后转入光照培养，继续喷水保湿；接种后的第7天和第10天分别对发病情况进行调查。每次接种20株，三次重复。

拟南芥调查主要对花序(F)、老角果(OS)及新角果(NS)发病情况进行统计，最终的发病指数(Fusarium-Arabidopsis disease，FAD)是三者之和，即FAD value＝F+NS+OS具体打分标准见表3(Urban等，Arabidopsis is susceptible to the cereal ear blightfungal pathogens Fusarium graminearum and Fusarium culmorum，The PlantJournal，32:961-973)。

表3拟南芥接种禾谷镰刀菌5035调查统计方法

结果表明，转基因植株在第7天和第10天的FAD值均要低于野生型(表4)。其中，T₂代转基因株系An-1在第7天和第10天的FAD值为6.59和8.41，与WT相比分别降低了41％和38％，而An-2在第7天和第10天的FAD值为5.10和5.91，与WT相比分别降低了55％和57％，T₃代转基因株系的FAD值也明显降低(图8)。因此上述结果说明，在拟南芥中超表达TaAn基因可以提高拟南芥植株的FHB抗性。

表4拟南芥接种禾谷镰刀菌5035后的发病指数(FAD)调查

b表示在0.01水平具有显著性差异。

实施例6：TaAn基因组成型表达载体的构建和转化小麦

Pcambia3300-Ubi-TaAn植物表达载体的构建

为了能更好的分析TaAn基因的功能，将TaAn基因在小麦中组成型表达，从转基因小麦的表型研究该基因的功能。小麦组成型表达载体构建方法如下：以小麦品种郑麦9023(Z9) DON处理12h后的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用引物TaAn-F2/TaAn-R2(请见表1)，扩增出包含TaAn基因完整编码区的cDNA片段(见序列表SEQ ID NO:2所示的序列)，在该cDNA片段的两端分别添加Sma I和Spe I酶切位点，反应条件为：94℃预变性5min； 94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸1min。PCR产物电泳后，切取234bp左右的目的片段，用DNA片段回收试剂盒(购自Axgen公司)，向凝胶中加入3 倍体积的DE-A缓冲液(试剂盒自带)，75℃水浴溶解6min，使凝胶完全溶解后，加入1.5 倍体积的DE-B缓冲液(试剂盒自带)，移入回收柱中，以12000rpm离心1min，弃流出的液体，向回收柱中加入500μLwashing buffer 1，12000rpm离心1min，再向回收柱中加入700 μL washing buffer 2，12000rpm再离心1min，重复用washing buffer 2洗涤一次，加入25μL elution buffer，静置2min后，12000rpm离心2min，得到纯化的PCR产物即TaAn基因，将上述纯化后的PCR产物分别用Sma I和Spe I酶切后，无水乙醇沉淀回收。同时也将载体 pCAMBIA3300-Ubi-Nos(见图9，由华中农业大学麦类作物分子生物技术试验室改造)分别用 Sma I和Spe I酶切后，切胶回收载体骨架约10688bp，最后将酶切好的目的片段用T₄ DNA ligase(NEB)连接到载体骨架中，构建得到超量表达载体，其后转化大肠杆菌DH5α，通过筛选阳性克隆，得到植物组成型表达载体pCAMBIA3300-Ubi-TaAn(图10)。

转基因小麦的农杆菌遗传转化与筛选鉴定

热激法转化农杆菌EHA105

取-80℃保存的农杆菌感受态于室温片刻待其部分融化，处于冰水混合物状态时插入冰中。每100μL感受态加入0.01-1μg质粒DNA，用手轻轻敲打管底混匀，依次于冰上放置5min，液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h。6000r/min离心1min，留取100μL上清轻轻吹打重悬菌块后涂布含相应抗生素(卡那霉素25μg/mL，利福平50μg/mL)的LB固体平板上，28℃倒置培养2-3d。

农杆菌菌体PCR鉴定

挑取平板上生长出的单菌落继续接种于LB平板(卡那霉素25μg/mL，利福平50μg/mL) 上，分格子划线扩大培养，28℃培养1-2d。用灭菌的牙签挑取已纯化的单菌落于50μLddH₂O 中，混匀，沸水煮15min。12000r/min离心1min后，置于冰上，取10μL上清液作为模板。PCR反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，1.25mmol/L dNTPs 2μL，10μmol/L primer各0.5μL， Easy Taq酶(5U/μL)0.3μL，模板10μL，补ddH₂O至25μL。PCR反应程序为：95℃ 5min；95℃30s，60℃(根据引物不同有所改变)30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 10min， 10℃ 10min。

小麦农杆菌遗传转化体系

选取小麦扬花10-14d后体被白色绒毛的嫩绿色幼嫩小麦麦粒，无菌环境下倒入三角瓶中，用70％乙醇消毒30s，0.1％升汞消毒6-8min，无菌水冲洗5次，每次2min，整个过程中需不断晃动三角瓶，使种子与液体充分接触。无菌条件下用解剖针剥取半透明、大小约为0.8-1.2mm的幼胚，盾片向上，接种于诱导培养基上，每皿接种60-80枚，25℃黑暗培养 7-9d，诱导愈伤。

转化前一天接种培养农杆菌，将保存好的含有目的质粒的农杆菌菌液按照1：50的比例接种于含2mmol/L MgSO₄、100mg/L Rif、100mg/L Carb、25mg/L Kana的YEB液体培养基中，28℃，220r/min恒温震荡暗培养过夜，至菌体悬浮液OD600＝1.0即可用于转化(培养时间约为17-20h，具体时间依菌株而定)。4℃，4500×g离心10min收集菌体，弃去上清，用浸染液重悬，调节其浓度至OD600＝0.8-0.9，加入200μM AS，28℃，220r/min恒温摇床暗培养1-3h，加入100mg/L的L-抗坏血酸及浓度为0.015％的SilwetL-77，由此构成农杆菌浸染液。选取生长状态好的愈伤于50mL的三角瓶中，不封口干燥处理30min后加入农杆菌浸染液，浸没愈伤，20MHz超声波处理30s，28℃，100r/min恒温震荡暗培养30 min。浸染结束后，去掉浸染液，将愈伤转移至带有whatman 1号滤纸的培养皿中(已加入200 μL dd H₂O)，分堆堆放，每堆直径约2cm，高1cm，于超净工作台内风干滤纸。23℃黑暗共培养3d。

共培养后，将粘连的愈伤转至恢复培养基上，25℃暗培养10d后将愈伤用新鲜恢复培养基继代一次，25℃黑暗培养10d。PMI筛选体系中材料的筛选过程：将恢复培养后的愈伤转至甘露糖10g/L的分化筛选培养基(PI)上，25℃光照条件下筛选2周；将分化出绿点的愈伤转入甘露糖5g/L的再生筛选培养基(PII)上，25℃光照条件下筛选2周；将分化出的绿苗转至甘露糖15g/L的生根培养基(PIII)上，25℃光照条件下培养3周。将筛选出的抗性苗转至无筛选剂的壮苗培养基(MST1)中，25℃光照条件下生根壮苗2-3周，待抗性苗长出健壮的根后4℃春化2周，然后移栽进温室，在PMI体系中，筛选出的表现比较好的材料不用壮苗，可直接春化后移栽。

转基因阳性小麦植株的筛选鉴定

提取T₂代转基因小麦新鲜叶片提取DNA(使用植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司产品)，目的基因引物TaAn-WF/TaAn-WR进行PCR阳性检验，结果见图11。1号泳道中为水对照，2号泳道为未转化的X76小麦(阴性对照)，3号和4号泳道为转入TaAn基因的阳性植株。

表5转基因小麦筛选鉴定所用到的引物

表5的说明：引物名称后的英文字母W代表小麦，F和R分别代表正向引物和反向引物。

实施例7：TaAn组成型表达转基因T₂代小麦在DON胁迫下的生长状况

本实施例选取转TaAn基因的组成型表达的T₂代小麦株系(编号为An-1)进行了不同浓度的DON胁迫试验。具体步骤如下：将野生型小麦(非转基因，简称WT)和组成型表达转基因株系(An-1)种子按常规方法消毒(先用浓度为70％酒精处理1min，再用0.15％次氯酸溶液处理2min，无菌水清洗数次)，在1/2MS培养基上发芽，然后分别将播于含DON(0mM、10mM、20mM)的1/2MS培养基上，在4℃春化处理3天，置于20℃，生长7天后测量转基因植株和野生型植株的根长，试验重复3次，每次每个株系20株苗。试验结果表明(图12)，在 10mM、20mM两种浓度DON的条件下，野生型小麦X76的根长受到DON的显著抑制，但是转基因小麦An-1的根长与野生型和对照相比，DON的抑制作用显著减弱。试验结果表明(表 6)，不同转基因株系(An-1和An-2)T₂材料在10mM、20mM的DON浓度下，根长较野生型要高，说明TaAn基因的组成型表达确实能够提高转基因小麦的DON耐受性，具体结果见表2。

表6小麦转基因株系(An-1和An-2)T₂材料在10mM、20mM的DON浓度下处理1周的根长

a表示在0.05水平具有显著性差异

b表示在0.01水平具有显著性差异。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 小麦基因TaAn在提高植物DON耐受性和FHB抗性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagaaacaca tcaagcacac actgacacac gatcagtagc agagaagacc tgagttttct 60

ctaagcttgg agagcagagg aaagaaagaa agaaagagag ggacggggaa attttagtgg 120

tgtagaagct tagcagagta taaatggggt tttgctgtgg gtgttcggat gtcaaggtgc 180

tccccaagaa caactccttg gcttcctcgc cctcgccgtc cgctaaagat tccagcgatg 240

gcgccaagaa gaagcagcct caagccgtaa agaaggaagg gaaagagaag aaaaggagca 300

accttgaccg ggccgccatg gcgtcgcccc gcctcccctt ccattctcga cccggcctaa 360

tgtaatagag tttgcagatt ttcagaacaa tagtgcatac aacatacaat cctgtagctt 420

ctcttattag cttacgcccg ggtttgcctc ggttgttccg ctgaagattt catttgtact 480

gtgtccacgt gtactgtttt attcatggac ggtcggttga tcc 523

<210> 2

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggggtttt gctgtgggtg ttcggatgtc aaggtgctcc ccaagaacaa ctccttggct 60

tcctcgccct cgccgtccgc taaagattcc agcgatggcg ccaagaagaa gcagcctcaa 120

gccgtaaaga aggaagggaa agagaagaaa aggagcaacc ttgaccgggc cgccatggcg 180

tcgccccgcc tccccttcca ttctcgaccc ggcctaatgt aa 222

<210> 3

<211> 73

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Phe Cys Cys Gly Cys Ser Asp Val Lys Val Leu Pro Lys Asn

1 5 10 15

Asn Ser Leu Ala Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Lys Asp Ser Ser Asp

20 25 30

Gly Ala Lys Lys Lys Gln Pro Gln Ala Val Lys Lys Glu Gly Lys Glu

35 40 45

Lys Lys Arg Ser Asn Leu Asp Arg Ala Ala Met Ala Ser Pro Arg Leu

50 55 60

Pro Phe His Ser Arg Pro Gly Leu Met

65 70