腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用

文档序号：900154 发布日期：2021-02-26 浏览：1次 >En<

阅读说明：本技术 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 (Adc68XY adenovirus vector, virus packaged by same and application ) 是由周东明邢嫚祝丰于 2019-08-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用。本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装,病毒产量高,且获得的病毒感染能力强。同时,本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因,具有很大的应用价值。(The invention provides a novel adenovirus vector AdC68XY, a virus packaged by the same and application thereof. The adenovirus expression vector can be efficiently packaged, the virus yield is high, and the obtained virus has strong infection capacity. Meanwhile, the adenovirus expression vector can contain larger exogenous genes and has great application value.)

技术领域

本发明属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒，它们的制备方法及应用；较佳地，所述腺病毒载体AdC68XY基于合成生物学技术构建。

背景技术

腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为A～G 7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中最常见的是人血清5型腺病毒，即AdHu5。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本发明人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于AdHu5载体。

由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组DNA。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。

综上，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。

发明内容

本发明的目的在于提供基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体AdC68XY。

在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。

在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列和E3序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。

在一个优选例中，前述方法或载体中，所述改造选自：

(a)以AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-35641位序列；

(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第32914-34077位序列；或

(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域插入AdHu5基因组第33193-34703位序列。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点；较佳地包括(但不限于)：HpaI，I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。

在另一优选例中，所述报告基因的表达盒具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述酶切位点包括用于插入外源基因的酶切位点。

在另一优选例中，所述外源基因表达盒可表达获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。

在另一优选例中，所述外源基因为长度在30bp～8.5kb的外源基因，如长度为50bp，100bp，200bp，500bp，1kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，7kb，8kb。

在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体是利用人工合成技术构建。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体具有SEQ ID NO:1(AdC68XY1-EGFP)所示的核苷酸序列，但，其中第29278～31865位由SEQ ID NO:3替换；其中第29278～30431位由SEQ ID NO:4替换；或其中第29278～31865位由SEQ ID NO:5替换。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于插入外源基因、从而表达外源基因。

在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面任一所述的重组腺病毒载体包装获得。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(1)制备前面任一所述的重组腺病毒载体；和(2)将(1)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。

在一个优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞。

在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤活性的蛋白(如杀肿瘤的蛋白))，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。

在一个优选例中，所述的具有免疫原性的蛋白包括但不限于：针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的蛋白疫苗。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，包括：前面任一所述的重组腺病毒载体；前面所述的重组腺病毒；和/或病毒生产细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP的载体构建示意图图中，E1区已完全删除；E3区域部分删除，加入SwaI酶切位点，用于后续外源基因插入。

图2、重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP酶切鉴定结果。其中，M:1kb plus DNA ladder；1-3：BglII、XhoΙ、MfeI酶切结果。

图3A重组腺病毒AdC68XY1-EGFP的病毒噬斑形成。

图3B重组腺病毒AdC68XY2-EGFP的病毒噬斑形成。

图3C重组腺病毒AdC68XY3-EGFP的病毒噬斑形成。

图3D重组腺病毒AdC68XY4-EGFP的病毒噬斑形成。

图4、重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP基因组酶切鉴定结果。其中，M:1kb plus DNA ladder；1-3：BglII、XhoΙ、MfeI酶切结果。

具体实施方式

腺病毒的基因组比较大，以其进行外源基因的表达较为困难。为此，本发明人经过深入的研究，揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体，称为AdC68XY系列载体。一方面，本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强；另一方面，本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有较大的应用价值。

如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。

如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

腺病毒载体

腺病毒的基因组比较大，在先前的技术中，本发明人尝试了较多的改造策略，包括针对其基因组中E1和E3进行全部或部分改造，删除部分的基因，但是鉴于其E4区域的重要作用，现有技术中尚没有针对其E4进行成功改造的先例。而本发明人发现，可以针对E4进行全部或部分改造，以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的区域进行替换、或有限地进行序列删减，可以获得复制能力、感染能力增强的病毒，甚至还可以实现外源基因插入容量的增大。

在本发明中，以黑猩猩型腺病毒AdC68为模板，利用其基因组序列，设计新型的E1/E3删除的复制缺陷型重组腺病毒载体。腺病毒基因组包含E1-E4早期基因，E1A可激活E1B、E2A、E2B、E3和E4的启动子。腺病毒E4区包括7个开放阅读框，其产物分别为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6和ORF6/7。其中，E4ORF6是一个多功能蛋白，参与病毒复制的多个过程，对于腺病毒的复制极为重要。ORF6可与E1B 55-kDa结合，形成ORF6-E1B复合物，该复合物在转录后阶段促进主要晚期病毒mRNA的输出，从而加强晚期病毒基因的表达，同时抑制宿主蛋白的合成。在腺病毒感染的细胞中，ORF6-E1B复合物还参与抑制E1A诱导的p53激活，从而使p53降解，抑制宿主细胞凋亡。而且，ORF6可间接提高病毒DNA合成效率。ORF3与ORF6功能相似，可部分或完全补偿彼此的缺失。为了提高安全性，用作疫苗载体的腺病毒通常为复制缺陷型，即删除了E1基因。因此，通常用整合了AdHu5E1基因的HEK 293细胞包装和扩增非复制型腺病毒。尽管AdHu5E1B 55k和E4ORF6蛋白之间的相互作用相对保守，但黑猩猩型腺病毒E4ORF6蛋白与AdHu5E1B 55k的结合可能不稳定或效率降低，导致非复制型黑猩猩腺病毒产量降低。为避免出现以上问题，提高重组腺病毒AdC68的产量，本发明人将AdC68的E4序列全部或部分替换成AdHu5的E4序列，设计成多个分别带有不同E4序列的重组AdC68载体，分别命名为AdC68XY1、AdC68XY2、AdC68XY3、AdC68XY4；在重组载体的E1删除区，插入绿色荧光蛋白基因。然后，本发明人采用合成生物学技术，全基因组合成带有绿色荧光标记的新型重组腺病AdC68XY1，线性化后在HEK 293细胞中成功包装，并扩增出遗传稳定的重组腺病毒AdC68XY1。在获得重组腺病毒载体AdC68XY1基础上，本发明人按既定设计方案，对AdC68的E4序列作其它多种替换，分别获得AdC68XY2、AdC68XY3、AdC68XY4等载体。这一方法不仅省时省力，而且不需依赖野生型腺病毒基因组DNA。

基于本发明人的新发现，提供了一种重组腺病毒载体(质粒)，该重组腺病毒载体包括：改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中E1全部序列和E3部分序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。

作为本发明的优选方式，所述改造选自：(a)AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；或(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列。

作为本发明的优选方式，还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列和/或酶切位点。应理解，报告基因、酶切位点等元件的设计有时候是为了在进行研究时提供方便观测或检测的途径，而当将本发明的重组腺病毒载体或重组腺病毒应用于临床药学领域时，其并非是必要的；或者，可以在所述报告基因的位置上以能表达具有药学活性的目的蛋白的基因替代。

所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明所述的表达载体中，可以插入外源基因的表达盒，从而表达人们感兴趣的目的蛋白。本发明的腺病毒表达载体可以作为一个表达载体平台，适用于表达多种目的蛋白，所述的目的蛋白没有特别的限制。作为一些可选的实施方式，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。所述的目的蛋白可以是单条，也可以是两条或多条，只要其编码基因的长度在所述腺病毒可容纳的包装容量内。

本发明所述的表达载体中，外源基因表达盒插入位置不唯一，较佳地包括(但不限于)：E1区域，E3区域，E4区域蛋白。

本发明的表达载体中的各元件是可操作性连接的，从而有利于病毒的包装或目的蛋白的有效表达。

作为本发明的优选方式，采用基于合成生物学的技术构建本发明的新型腺病毒载体。与传统生物学的研究方向相反，合成生物学是从最基本的要素开始一步步建立零部件，在此过程中设计、修改遗传物质，最终获得理想的新生物体。但是，应理解，除了合成生物学的技术，在获得了本发明的技术方案后，其它构建本发明的腺病毒载体的方法也应被包含在本发明中。

本发明为新型腺病毒载体的构建提供了一种快速有效的方法，有利于拓展腺病毒载体的应用，同时获得新型重组腺病毒AdC68XY系列载体。

腺病毒

获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如HEK293细胞等。

作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID₅₀)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。

本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，在转染病毒生产细胞4天后，就能够在细胞培养物表面形成清晰而显著的噬菌斑，数量较多，显著由于改造前的腺病毒载体。

本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效转染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低，其表达效率高且长久。本发明的腺病毒载体表达重组工艺简单、价格低廉、疗效持久。

组合物、试剂盒或药盒

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的腺病毒表达有意义的目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤肿瘤细胞活性的蛋白)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽。

如本文所用，“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒/药盒，其中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

细胞

HEK 293细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养液为含有10％胎牛血清的DMEM。

限制性内切酶、感受态细胞、基因组序列

所有限制性内切酶购自New England Biolabs；Stbl2菌种购自苏州新赛美生物科技有限公司(苏州)。

黑猩猩型腺病毒AdC68序列参照GenBank公布序列，即GenBank登录号：AC_000011.1。

腺病毒人血清型5型(AdHu5)的E4序列参照GenBank登录号：AC_000008.1。

实施例1、腺病毒载体AdC68XY及重组腺病毒的制备

1、腺病毒载体AdC68XY的设计

首先，本发明人将AdC68基因组序列中的部分E1和E3序列删除。E1删除大小为2552bp(删除区域为459bp-3010bp)，从而可获得复制缺陷型腺病毒载体。E3删除大小为3721bp(删除区域为AC_000011.1，27615bp-31335bp)。E1/E3删除可使外源基因插入的容量达7.5kb左右。

其次，本发明人将AdC68的E4序列以不同的方式改造或替换成AdHu5的E4序列，获得不同的重组载体，一些优化的重组载体具体如下：

AdC68XY1载体：其中E1/E3删除，在33517bp和36106bp处(对应AC_000011.1)加入酶切位点HpaI，E4序列未改动。同时，本发明人在E1删除区插入了稀有酶切位点I-CeuI和PI-SceI，便于在此区域插入外源基因。在E3删除区插入酶切位点SwaI，以便在此区域也可插入外源基因。在E4区两端加入酶切位点HpaI，以便后续对E4区域进行改造。将以上经修改的AdC68基因组的两侧ITR分别加上PacI酶切位点(便于将重组腺病毒质粒用PacI线性化)，从而获得重组腺病毒载体AdC68XY1。为了便于观察该新型重组腺病毒的包装，本发明人在E1删除区的I-CeuI和PI-SceI酶切位点之间插入CMV-EGFP序列(CMV启动子驱动EGFP表达，SEQ ID NO:2)，使获得的重组腺病毒带有绿色荧光标记(AdC68XY1-EGFP)。AdC68XY1-EGFP序列如SEQ ID NO:1，其元件构成如图1。

AdC68XY2载体：其中E1/E3删除，E4序列全部替换成AdHu5的E4序列：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-36105bp(对应AC_000011.1)；AdHu5E4序列的插入区域(SEQ ID NO:3)为32914bp-35641bp(对应AC_000008.1)。

AdC68XY3载体：其中E1/E3删除，E4区域ORF6/7和ORF6替换成AdHu5：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-34671bp(对应AC_000011.1)；AdHu5E4序列的插入区域(SEQ ID NO:4)为32914bp-34077bp(对应AC_000008.1)。其中，保留了AdC68的ORF1-4序列。

AdC68XY4载体：其中E1/E3删除，E4区域替换成AdHu5的ORF3-6(即ORF1-2和6/7被删除)：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-36105bp(对应AC_000011.1)，AdHu5E4序列的插入区域(SEQ ID NO:5)为33193bp-34703bp(对应AC_000008.1)。

2、重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆的合成

将以上设计的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆序列送至通用生物系统(安徽)有限公司，由该公司合成该分子克隆。

在合成的pAdC68XY1-EGFP载体的序列的基础上，进行进一步改造，分别获得AdC68XY2载体、AdC68XY3载体、AdC68XY4载体。

3、重组腺病毒AdC68XY1-EGFP包装和扩增

将以上合成获得的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆(质粒DNA)用PacI酶切线性化，根据Lipofectamine 2000转染试剂盒的使用说明，将酶切后的AdC68XY1-EGFP质粒DNA转染密度为60-70％的HEK293细胞(6孔板)。转染前，换成无血清培养基，加入DNA/脂质体复合物，转染5小时后，换含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基。在荧光显微镜下隔日观察EGFP荧光强度及细胞病变，直至HEK293细胞出现大量噬斑时收集细胞，在室温与-80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，3500rpm/min离心10min，收集上清置于-80℃超低温冰箱保种。

4、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP的分子克隆及病毒包装

在获得重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP基础上，本发明人按既定设计方案，对AdC68的E4序列作其它多种替换，先将pAdC68XY1-EGFP载体用HpaI酶切，再利用等温重组分子克隆方法，分别获得pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP载体，并按如前所述方法包装、扩增并纯化病毒。

5、重组腺病毒AdC68XY-EGFP鉴定

各重组腺病毒经扩增后，用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒液，测定病毒的滴度并分装置于-80℃超低温冰箱保存。取部分纯化的各重组腺病毒AdC68XY-EGFP，根据DNeasyTissue Kit(QIAGEN，Valencia，CA)试剂盒的使用说明，分离纯化各重组腺病毒基因组DNA，然后作多酶切鉴定。

实施例2、重组腺病毒pAdC68XY-EGFP分子克隆的鉴定

将合成获得的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP质粒DNA用多种酶(MfeI、BglII、XhoI)酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过DNA条带证明pAdC68XY1-EGFP分子克隆是完整、正确的，见图2。

其它经进一步改造获得的重组腺病毒pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP的质粒DNA作相同的酶切鉴定，见图2。

实施例3、重组腺病毒AdC68XY-EGFP的病毒包装与拯救

脂质体转染法将经PacI线性化的pAdC68XY1-EGFP、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP质粒DNA转染到密度约为70％的HEK 293细胞(培养于6孔板)，定期观察绿色荧光蛋白表达情况并拍照记录。随着时间的变化，绿色荧光表达会发生变化，荧光逐渐富集并形成簇状，最终形成噬斑，说明在HEK 293细胞中黑猩猩来源的复制缺陷型腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP都成功包装并复制出具有感染性的病毒颗粒，见图3。

根据图3，E4区域未改造的腺病毒AdC68XY1-EGFP在第10天出现噬斑，噬斑数量为3个。

E4区域删除的AdC68XY2-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为11个。

E4区域改造的AdC68XY3-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为12个。

E4区域改造的AdC68XY4-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为15个。

根据这一结果，E4区域改造后，腺病毒拯救所需时间明显短于未改造组，且噬斑数量明显多于未改造组，证实了E4区域被部分或完全替换成AdHu5源的腺病毒相应区域后，复制能力得到了增强。

并且，对于进一步增加了外源基因插入容量组AdC68XY4-EGFP，E4区域ORF1、ORF2和ORF6/7删除后，其比AdC68XY1少970bp，从而其外源基因插入容量增大，外源基因的插入容量可达8.5kb左右。同时，AdC68XY4在插入容量增加的同时，腺病毒的复制能力、病毒包装等没有受到影响，产量没有受到影响。

实施例4、重组腺病毒AdC68XY-EGFP鉴定

将扩增的重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP经氯化铯梯度离心法纯化，纯化后的各重组病毒滴度分别为6×10¹²vp/L、2×10¹³vp/L、1×10¹³vp/L、2×10¹³vp/L。均可获得较高的滴度。

此实验结果中，E4区域被部分或完全替换成Hu5源的重组腺病毒，病毒产量相对最高，达到了预期的效果，其它E4区域被部分改造的重组腺病毒，病毒产量也有显著提高。因此，本发明的改造，获得了更利于在HEK293细胞中生长的各种重组腺病毒，提高了产量。

分离病毒基因组DNA，用MfeI、BglII、XhoΙ酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过酶切后的基因组DNA条带证明重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP为正确的病毒基因组。见图3。

结论

本发明中，通过对腺病毒AdC68基因组序列进行分析、设计，并利用生物合成技术，整体合成重组腺病毒载体AdC68XY1。为了体现效果，本发明人在质粒中加入绿色荧光蛋白，经转染、病毒包装、扩增、纯化，可直接获得重组腺病毒AdC68XY1-EGFP。经酶切鉴定分析，获得了正确的重组腺病毒载体AdC68XY。在此基础上，本发明人通过常规的分子克隆，对AdC68XY1的E4作进一步替换，获得重组腺病毒AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP，并获得相应的重组腺病毒。所述载体可应用于各种基础研究和临床应用，譬如作为表达载体、疫苗研发、基因治疗等。

本发明不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体AdC68XY，改造后的载体较传统的AdC68载体更适宜在包装细胞HEK293中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本；而且本发明建立了以合成生物学制备重组腺病毒载体的新策略，这种策略无需获得野生型腺病毒，避免复杂的克隆过程，直接合成重组腺病毒的分子克隆，省时省力。这一策略解决了构建重组腺病毒载体的技术瓶颈，为重组腺病毒载体的发展和推广应用提供了坚实的理论和技术支撑。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州相奕生物技术有限公司

<120> 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用

<130> 196276

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35048

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35048)

<223> 重组腺病毒AdC68XY1-EGFP核苷酸序列

<400> 1

gtcgagggat gagcgaccgt taggggcggg gcgagtgacg ttttgatgac gtggttgcga 60

ggaggagcca gtttgcaagt tctcgtggga aaagtgacgt caaacgaggt gtggtttgaa 120

cacggaaata ctcaattttc ccgcgctctc tgacaggaaa tgaggtgttt ctgggcggat 180

gcaagtgaaa acgggccatt ttcgcgcgaa aactgaatga ggaagtgaaa atctgagtaa 240

tttcgcgttt atggcaggga ggagtatttg ccgagggccg agtagacttt gaccgattac 300

gtgggggttt cgattaccgt gtttttcacc taaatttccg cgtacggtgt caaagtccgg 360

tgtttttacg tacgatatca tttccccgaa aagtgccacc tgaccgtaac tataacggtc 420

ctaaggtagc gaaagctcag atctcccgat cccctatggt gcactctcag tacaatctgc 480

tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga ggtcgctgag 540

tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa ttgcatgaag 600

aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgatg tacgggccag atatacgcgt 660

tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 720

ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 780

aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 840

actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 900

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 960

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 1020

ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 1080

cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 1140

tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 1200

atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg gctaactaga 1260

gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga gacccaagct 1320

ggctagcgtt taaacgggcc cgcccgggct tataagccac catggtgagc aagggcgagg 1380

agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 1440

agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 1500

tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 1560

acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 1620

ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 1680

acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 1740

agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 1800

acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 1860

agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 1920

cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 1980

ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 2040

ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta attataagcc cgggcaagct 2100

taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2160

gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2220

aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2280

tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2340

tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagcagatc tgcagatctg aattcatcta 2400

tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggcattatgg gtattatggg tctgcattaa 2460

tgaatcggcc agatatcgac atatgctggc caccgtacat gtggcttccc atgctcgcaa 2520

gccctggccc gagttcgagc acaatgtcat gaccaggtgc aatatgcatc tggggtcccg 2580

ccgaggcatg ttcatgccct accagtgcaa cctgaattat gtgaaggtgc tgctggagcc 2640

cgatgccatg tccagagtga gcctgacggg ggtgtttgac atgaatgtgg aggtgtggaa 2700

gattctgaga tatgatgaat ccaagaccag gtgccgagcc tgcgagtgcg gagggaagca 2760

tgccaggttc cagcccgtgt gtgtggatgt gacggaggac ctgcgacccg atcatttggt 2820

gttgccctgc accgggacgg agttcggttc cagcggggaa gaatctgact agagtgagta 2880

gtgttctggg gcgggggagg acctgcatga gggccagaat aactgaaatc tgtgcttttc 2940

tgtgtgttgc agcagcatga gcggaagcgg ctcctttgag ggaggggtat tcagccctta 3000

tctgacgggg cgtctcccct cctgggcggg agtgcgtcag aatgtgatgg gatccacggt 3060

ggacggccgg cccgtgcagc ccgcgaactc ttcaaccctg acctatgcaa ccctgagctc 3120

ttcgtcgttg gacgcagctg ccgccgcagc tgctgcatct gccgccagcg ccgtgcgcgg 3180

aatggccatg ggcgccggct actacggcac tctggtggcc aactcgagtt ccaccaataa 3240

tcccgccagc ctgaacgagg agaagctgtt gctgctgatg gcccagctcg aggccttgac 3300

ccagcgcctg ggcgagctga cccagcaggt ggctcagctg caggagcaga cgcgggccgc 3360

ggttgccacg gtgaaatcca aataaaaaat gaatcaataa ataaacggag acggttgttg 3420

attttaacac agagtctgaa tctttatttg atttttcgcg cgcggtaggc cctggaccac 3480

cggtctcgat cattgagcac ccggtggatc ttttccagga cccggtagag gtgggcttgg 3540

atgttgaggt acatgggcat gagcccgtcc cgggggtgga ggtagctcca ttgcagggcc 3600

tcgtgctcgg gggtggtgtt gtaaatcacc cagtcatagc aggggcgcag ggcatggtgt 3660

tgcacaatat ctttgaggag gagactgatg gccacgggca gccctttggt gtaggtgttt 3720

acaaatctgt tgagctggga gggatgcatg cggggggaga tgaggtgcat cttggcctgg 3780

atcttgagat tggcgatgtt accgcccaga tcccgcctgg ggttcatgtt gtgcaggacc 3840

accagcacgg tgtatccggt gcacttgggg aatttatcat gcaacttgga agggaaggcg 3900

tgaaagaatt tggcgacgcc tttgtgcccg cccaggtttt ccatgcactc atccatgatg 3960

atggcgatgg gcccgtgggc ggcggcctgg gcaaagacgt ttcgggggtc ggacacatca 4020

tagttgtggt cctgggtgag gtcatcatag gccattttaa tgaatttggg gcggagggtg 4080

ccggactggg ggacaaaggt accctcgatc ccgggggcgt agttcccctc acagatctgc 4140

atctcccagg ctttgagctc ggaggggggg atcatgtcca cctgcggggc gataaagaac 4200

acggtttccg gggcggggga gatgagctgg gccgaaagca agttccggag cagctgggac 4260

ttgccgcagc cggtggggcc gtagatgacc ccgatgaccg gctgcaggtg gtagttgagg 4320

gagagacagc tgccgtcctc ccggaggagg ggggccacct cgttcatcat ctcgcgcacg 4380

tgcatgttct cgcgcaccag ttccgccagg aggcgctctc cccccaggga taggagctcc 4440

tggagcgagg cgaagttttt cagcggcttg agtccgtcgg ccatgggcat tttggagagg 4500

gtttgttgca agagttccag gcggtcccag agctcggtga tgtgctctac ggcatctcga 4560

tccagcagac ctcctcgttt cgcgggttgg gacggctgcg ggagtagggc accagacgat 4620

gggcgtccag cgcagccagg gtccggtcct tccagggtcg cagcgtccgc gtcagggtgg 4680

tctccgtcac ggtgaagggg tgcgcgccgg gctgggcgct tgcgagggtg cgcttcaggc 4740

tcatccggct ggtcgaaaac cgctcccgat cggcgccctg cgcgtcggcc aggtagcaat 4800

tgaccatgag ttcgtagttg agcgcctcgg ccgcgtggcc tttggcgcgg agcttacctt 4860

tggaagtctg cccgcaggcg ggacagagga gggacttgag ggcgtagagc ttgggggcga 4920

ggaagacgga ctcgggggcg taggcgtccg cgccgcagtg ggcgcagacg gtctcgcact 4980

ccacgagcca ggtgaggtcg ggctggtcgg ggtcaaaaac cagtttcccg ccgttctttt 5040

tgatgcgttt cttacctttg gtctccatga gctcgtgtcc ccgctgggtg acaaagaggc 5100

tgtccgtgtc cccgtagacc gactttatgg gccggtcctc gagcggtgtg ccgcggtcct 5160

cctcgtagag gaaccccgcc cactccgaga cgaaagcccg ggtccaggcc agcacgaagg 5220

aggccacgtg ggacgggtag cggtcgttgt ccaccagcgg gtccaccttt tccagggtat 5280

gcaaacacat gtccccctcg tccacatcca ggaaggtgat tggcttgtaa gtgtaggcca 5340

cgtgaccggg ggtcccggcc gggggggtat aaaagggtgc gggtccctgc tcgtcctcac 5400

tgtcttccgg atcgctgtcc aggagcgcca gctgttgggg taggtattcc ctctcgaagg 5460

cgggcatgac ctcggcactc aggttgtcag tttctagaaa cgaggaggat ttgatattga 5520

cggtgccggc ggagatgcct ttcaagagcc cctcgtccat ctggtcagaa aagacgatct 5580

ttttgttgtc gagcttggtg gcgaaggagc cgtagagggc gttggagagg agcttggcga 5640

tggagcgcat ggtctggttt ttttccttgt cggcgcgctc cttggcggcg atgttgagct 5700

gcacgtactc gcgcgccacg cacttccatt cggggaagac ggtggtcagc tcgtcgggca 5760

cgattctgac ctgccagccc cgattatgca gggtgatgag gtccacactg gtggccacct 5820

cgccgcgcag gggctcatta gtccagcaga ggcgtccgcc cttgcgcgag cagaaggggg 5880

gcagggggtc cagcatgacc tcgtcggggg ggtcggcatc gatggtgaag atgccgggca 5940

ggaggtcggg gtcaaagtag ctgatggaag tggccagatc gtccagggca gcttgccatt 6000

cgcgcacggc cagcgcgcgc tcgtagggac tgaggggcgt gccccagggc atgggatggg 6060

taagcgcgga ggcgtacatg ccgcagatgt cgtagacgta gaggggctcc tcgaggatgc 6120

cgatgtaggt ggggtagcag cgccccccgc ggatgctggc gcgcacgtag tcatacagct 6180

cgtgcgaggg ggcgaggagc cccgggccca ggttggtgcg actgggcttt tcggcgcggt 6240

agacgatctg gcggaaaatg gcatgcgagt tggaggagat ggtgggcctt tggaagatgt 6300

tgaagtgggc gtggggcagt ccgaccgagt cgcggatgaa gtgggcgtag gagtcttgca 6360

gcttggcgac gagctcggcg gtgactagga cgtccagagc gcagtagtcg agggtctcct 6420

ggatgatgtc atacttgagc tgtccctttt gtttccacag ctcgcggttg agaaggaact 6480

cttcgcggtc cttccagtac tcttcgaggg ggaacccgtc ctgatctgca cggtaagagc 6540

ctagcatgta gaactggttg acggccttgt aggcgcagca gcccttctcc acggggaggg 6600

cgtaggcctg ggcggccttg cgcagggagg tgtgcgtgag ggcgaaagtg tccctgacca 6660

tgaccttgag gaactggtgc ttgaagtcga tatcgtcgca gcccccctgc tcccagagct 6720

ggaagtccgt gcgcttcttg taggcggggt tgggcaaagc gaaagtaaca tcgttgaaga 6780

ggatcttgcc cgcgcggggc ataaagttgc gagtgatgcg gaaaggttgg ggcacctcgg 6840

cccggttgtt gatgacctgg gcggcgagca cgatctcgtc gaagccgttg atgttgtggc 6900

ccacgatgta gagttccacg aatcgcggac ggcccttgac gtggggcagt ttcttgagct 6960

cctcgtaggt gagctcgtcg gggtcgctga gcccgtgctg ctcgagcgcc cagtcggcga 7020

gatgggggtt ggcgcggagg aaggaagtcc agagatccac ggccagggcg gtttgcagac 7080

ggtcccggta ctgacggaac tgctgcccga cggccatttt ttcgggggtg acgcagtaga 7140

aggtgcgggg gtccccgtgc cagcgatccc atttgagctg gagggcgaga tcgagggcga 7200

gctcgacgag ccggtcgtcc ccggagagtt tcatgaccag catgaagggg acgagctgct 7260

tgccgaagga ccccatccag gtgtaggttt ccacatcgta ggtgaggaag agcctttcgg 7320

tgcgaggatg cgagccgatg gggaagaact ggatctcctg ccaccaattg gaggaatggc 7380

tgttgatgtg atggaagtag aaatgccgac ggcgcgccga acactcgtgc ttgtgtttat 7440

acaagcggcc acagtgctcg caacgctgca cgggatgcac gtgctgcacg agctgtacct 7500

gagttccttt gacgaggaat ttcagtggga agtggagtcg tggcgcctgc atctcgtgct 7560

gtactacgtc gtggtggtcg gcctggccct cttctgcctc gatggtggtc atgctgacga 7620

gcccgcgcgg gaggcaggtc cagacctcgg cgcgagcggg tcggagagcg aggacgaggg 7680

cgcgcaggcc ggagctgtcc agggtcctga gacgctgcgg agtcaggtca gtgggcagcg 7740

gcggcgcgcg gttgacttgc aggagttttt ccagggcgcg cgggaggtcc agatggtact 7800

tgatctccac cgcgccattg gtggcgacgt cgatggcttg cagggtcccg tgcccctggg 7860

gtgtgaccac cgtcccccgt ttcttcttgg gcggctgggg cgacgggggc ggtgcctctt 7920

ccatggttag aagcggcggc gaggacgcgc gccgggcggc aggggcggct cggggcccgg 7980

aggcaggggc ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggt aggttctggt actgcgcccg 8040

gagaagactg gcgtgagcga cgacgcgacg gttgacgtcc tggatctgac gcctctgggt 8100

gaaggccacg ggacccgtga gtttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatctcggt 8160

atcgttgacg gcggcctgcc gcaggatctc ttgcacgtcg cccgagttgt cctggtaggc 8220

gatctcggtc atgaactgct cgatctcctc ctcttgaagg tctccgcggc cggcgcgctc 8280

cacggtggcc gcgaggtcgt tggagatgcg gcccatgagc tgcgagaagg cgttcatgcc 8340

cgcctcgttc cagacgcggc tgtagaccac gacgccctcg ggatcgccgg cgcgcatgac 8400

cacctgggcg aggttgagct ccacgtggcg cgtgaagacc gcgtagttgc agaggcgctg 8460

gtagaggtag ttgagcgtgg tggcgatgtg ctcggtgacg aagaaataca tgatccagcg 8520

gcggagcggc atctcgctga cgtcgcccag cgcctccaaa cgttccatgg cctcgtaaaa 8580

gtccacggcg aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgag acggtcaact cctcctccag 8640

aagacggatg agctcggcga tggtggcgcg cacctcgcgc tcgaaggccc ccgggagttc 8700

ctccacttcc tcttcttcct cctccactaa catctcttct acttcctcct caggcggcag 8760

tggtggcggg ggagggggcc tgcgtcgccg gcggcgcacg ggcagacggt cgatgaagcg 8820

ctcgatggtc tcgccgcgcc ggcgtcgcat ggtctcggtg acggcgcgcc cgtcctcgcg 8880

gggccgcagc gtgaagacgc cgccgcgcat ctccaggtgg ccgggggggt ccccgttggg 8940

cagggagagg gcgctgacga tgcatcttat caattgcccc gtagggactc cgcgcaagga 9000

cctgagcgtc tcgagatcca cgggatctga aaaccgctga acgaaggctt cgagccagtc 9060

gcagtcgcaa ggtaggctga gcacggtttc ttctggcggg tcatgttggt tgggagcggg 9120

gcgggcgatg ctgctggtga tgaagttgaa ataggcggtt ctgagacggc ggatggtggc 9180

gaggagcacc aggtctttgg gcccggcttg ctggatgcgc agacggtcgg ccatgcccca 9240

ggcgtggtcc tgacacctgg ccaggtcctt gtagtagtcc tgcatgagcc gctccacggg 9300

cacctcctcc tcgcccgcgc ggccgtgcat gcgcgtgagc ccgaagccgc gctggggctg 9360

gacgagcgcc aggtcggcga cgacgcgctc ggcgaggatg gcttgctgga tctgggtgag 9420

ggtggtctgg aagtcatcaa agtcgacgaa gcggtggtag gctccggtgt tgatggtgta 9480

ggagcagttg gccatgacgg accagttgac ggtctggtgg cccggacgca cgagctcgtg 9540

gtacttgagg cgcgagtagg cgcgcgtgtc gaagatgtag tcgttgcagg tgcgcaccag 9600

gtactggtag ccgatgagga agtgcggcgg cggctggcgg tagagcggcc atcgctcggt 9660

ggcgggggcg ccgggcgcga ggtcctcgag catggtgcgg tggtagccgt agatgtacct 9720

ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt ggaggcgcgc gggaactcgc ggacgcggtt 9780

ccagatgttg cgcagcggca ggaagtagtt catggtgggc acggtctggc ccgtgaggcg 9840

cgcgcagtcg tggatgctct atacgggcaa aaacgaaagc ggtcagcggc tcgactccgt 9900

ggcctggagg ctaagcgaac gggttgggct gcgcgtgtac cccggttcga atctcgaatc 9960

aggctggagc cgcagctaac gtggtattgg cactcccgtc tcgacccaag cctgcaccaa 10020

ccctccagga tacggaggcg ggtcgttttg caactttttt ttggaggccg gatgagacta 10080

gtaagcgcgg aaagcggccg accgcgatgg ctcgctgccg tagtctggag aagaatcgcc 10140

agggttgcgt tgcggtgtgc cccggttcga ggccggccgg attccgcggc taacgagggc 10200

gtggctgccc cgtcgtttcc aagaccccat agccagccga cttctccagt tacggagcga 10260

gcccctcttt tgttttgttt gtttttgcca gatgcatccc gtactgcggc agatgcgccc 10320

ccaccaccct ccaccgcaac aacagccccc tccacagccg gcgcttctgc ccccgcccca 10380

gcagcaactt ccagccacga ccgccgcggc cgccgtgagc ggggctggac agagttatga 10440

tcaccagctg gccttggaag agggcgaggg gctggcgcgc ctgggggcgt cgtcgccgga 10500

gcggcacccg cgcgtgcaga tgaaaaggga cgctcgcgag gcctacgtgc ccaagcagaa 10560

cctgttcaga gacaggagcg gcgaggagcc cgaggagatg cgcgcggccc ggttccacgc 10620

ggggcgggag ctgcggcgcg gcctggaccg aaagagggtg ctgagggacg aggatttcga 10680

ggcggacgag ctgacgggga tcagccccgc gcgcgcgcac gtggccgcgg ccaacctggt 10740

cacggcgtac gagcagaccg tgaaggagga gagcaacttc caaaaatcct tcaacaacca 10800

cgtgcgcacc ctgatcgcgc gcgaggaggt gaccctgggc ctgatgcacc tgtgggacct 10860

gctggaggcc atcgtgcaga accccaccag caagccgctg acggcgcagc tgttcctggt 10920

ggtgcagcat agtcgggaca acgaagcgtt cagggaggcg ctgctgaata tcaccgagcc 10980

cgagggccgc tggctcctgg acctggtgaa cattctgcag agcatcgtgg tgcaggagcg 11040

cgggctgccg ctgtccgaga agctggcggc catcaacttc tcggtgctga gtttgggcaa 11100

gtactacgct aggaagatct acaagacccc gtacgtgccc atagacaagg aggtgaagat 11160

cgacgggttt tacatgcgca tgaccctgaa agtgctgacc ctgagcgacg atctgggggt 11220

gtaccgcaac gacaggatgc accgtgcggt gagcgccagc aggcggcgcg agctgagcga 11280

ccaggagctg atgcatagtc tgcagcgggc cctgaccggg gccgggaccg agggggagag 11340

ctactttgac atgggcgcgg acctgcactg gcagcccagc cgccgggcct tggaggcggc 11400

ggcaggaccc tacgtagaag aggtggacga tgaggtggac gaggagggcg agtacctgga 11460

agactgatgg cgcgaccgta tttttgctag atgcaacaac aacagccacc tcctgatccc 11520

gcgatgcggg cggcgctgca gagccagccg tccggcatta actcctcgga cgattggacc 11580

caggccatgc aacgcatcat ggcgctgacg acccgcaacc ccgaagcctt tagacagcag 11640

ccccaggcca accggctctc ggccatcctg gaggccgtgg tgccctcgcg ctccaacccc 11700

acgcacgaga aggtcctggc catcgtgaac gcgctggtgg agaacaaggc catccgcggc 11760

gacgaggccg gcctggtgta caacgcgctg ctggagcgcg tggcccgcta caacagcacc 11820

aacgtgcaga ccaacctgga ccgcatggtg accgacgtgc gcgaggccgt ggcccagcgc 11880

gagcggttcc accgcgagtc caacctggga tccatggtgg cgctgaacgc cttcctcagc 11940

acccagcccg ccaacgtgcc ccggggccag gaggactaca ccaacttcat cagcgccctg 12000

cgcctgatgg tgaccgaggt gccccagagc gaggtgtacc agtccgggcc ggactacttc 12060

ttccagacca gtcgccaggg cttgcagacc gtgaacctga gccaggcttt caagaacttg 12120

cagggcctgt ggggcgtgca ggccccggtc ggggaccgcg cgacggtgtc gagcctgctg 12180

acgccgaact cgcgcctgct gctgctgctg gtggccccct tcacggacag cggcagcatc 12240

aaccgcaact cgtacctggg ctacctgatt aacctgtacc gcgaggccat cggccaggcg 12300

cacgtggacg agcagaccta ccaggagatc acccacgtga gccgcgccct gggccaggac 12360

gacccgggca acctggaagc caccctgaac tttttgctga ccaaccggtc gcagaagatc 12420

ccgccccagt acgcgctcag caccgaggag gagcgcatcc tgcgttacgt gcagcagagc 12480

gtgggcctgt tcctgatgca ggagggggcc acccccagcg ccgcgctcga catgaccgcg 12540

cgcaacatgg agcccagcat gtacgccagc aaccgcccgt tcatcaataa actgatggac 12600

tacttgcatc gggcggccgc catgaactct gactatttca ccaacgccat cctgaatccc 12660

cactggctcc cgccgccggg gttctacacg ggcgagtacg acatgcccga ccccaatgac 12720

gggttcctgt gggacgatgt ggacagcagc gtgttctccc cccgaccggg tgctaacgag 12780

cgccccttgt ggaagaagga aggcagcgac cgacgcccgt cctcggcgct gtccggccgc 12840

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ctgaacagta tccgcagcag cgagctgggc aggatcacgc gcccgcgctt gctgggcgaa 12960

gaggagtact tgaatgactc gctgttgaga cccgagcggg agaagaactt ccccaataac 13020

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gacgatcccc gggcgtcgca gggggccacg agccggggca gcgccgcccg taaacgccgg 13140

tggcacgaca ggcagcgggg acagatgtgg gacgatgagg actccgccga cgacagcagc 13200

gtgttggact tgggtgggag tggtaacccg ttcgctcacc tgcgcccccg tatcgggcgc 13260

atgatgtaag agaaaccgaa aataaatgat actcaccaag gccatggcga ccagcgtgcg 13320

ttcgtttctt ctctgttgtt gttgtatcta gtatgatgag gcgtgcgtac ccggagggtc 13380

ctcctccctc gtacgagagc gtgatgcagc aggcgatggc ggcggcggcg atgcagcccc 13440

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ttcgttactc ggagctggca cccttgtacg ataccacccg gttgtacctg gtggacaaca 13560

agtcggcgga catcgcctcg ctgaactacc agaacgacca cagcaacttc ctgaccaccg 13620

tggtgcagaa caatgacttc acccccacgg aggccagcac ccagaccatc aactttgacg 13680

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acgagttcat gtacagcaac aagttcaagg cgcgggtgat ggtctcccgc aagaccccca 13800

atggggtgac agtgacagag gattatgatg gtagtcagga tgagctgaag tatgaatggg 13860

tggaatttga gctgcccgaa ggcaacttct cggtgaccat gaccatcgac ctgatgaaca 13920

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tcggcgtgaa gttcgacact aggaacttca ggctgggctg ggaccccgtg accgagctgg 14040

tcatgcccgg ggtgtacacc aacgaggctt tccatcccga tattgtcttg ctgcccggct 14100

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ccttccagga aggcttccag atcatgtacg aggatctgga ggggggcaac atccccgcgc 14220

tcctggatgt cgacgcctat gagaaaagca aggaggatgc agcagctgaa gcaactgcag 14280

ccgtagctac cgcctctacc gaggtcaggg gcgataattt tgcaagcgcc gcagcagtgg 14340

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gcaagaacag gagctacaac gtactaccgg acaagataaa caccgcctac cgcagctggt 14460

acctagccta caactatggc gaccccgaga agggcgtgcg ctcctggacg ctgctcacca 14520

cctcggacgt cacctgcggc gtggagcaag tctactggtc gctgcccgac atgatgcaag 14580

acccggtcac cttccgctcc acgcgtcaag ttagcaacta cccggtggtg ggcgccgagc 14640

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acgcccgcgc caagagccgg cggcggcgca tcgcccggcg gcaccggagc acccccgcca 15300

tgcgcgcggc gcgagccttg ctgcgcaggg ccaggcgcac gggacgcagg gccatgctca 15360

gggcggccag acgcgcggct tcaggcgcca gcgccggcag gacccggaga cgcgcggcca 15420

cggcggcggc agcggccatc gccagcatgt cccgcccgcg gcgagggaac gtgtactggg 15480

tgcgcgacgc cgccaccggt gtgcgcgtgc ccgtgcgcac ccgcccccct cgcacttgaa 15540

gatgttcact tcgcgatgtt gatgtgtccc agcggcgagg aggatgtcca agcgcaaatt 15600

caaggaagag atgctccagg tcatcgcgcc tgagatctac ggccctgcgg tggtgaagga 15660

ggaaagaaag ccccgcaaaa tcaagcgggt caaaaaggac aaaaaggaag aagaaagtga 15720

tgtggacgga ttggtggagt ttgtgcgcga gttcgccccc cggcggcgcg tgcagtggcg 15780

cgggcggaag gtgcaaccgg tgctgagacc cggcaccacc gtggtcttca cgcccggcga 15840

gcgctccggc accgcttcca agcgctccta cgacgaggtg tacggggatg atgatattct 15900

ggagcaggcg gccgagcgcc tgggcgagtt tgcttacggc aagcgcagcc gttccgcacc 15960

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cgtgaccttg cagcaggtgc tgccgaccgc ggcgccgcgc cgggggttca agcgcgaggg 16080

cgaggatctg taccccacca tgcagctgat ggtgcccaag cgccagaagc tggaagacgt 16140

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ggaaacgcag accgagccca tgatcaagcc cagcaccagc accatggagg tgcagacgga 16320

tccctggatg ccatcggctc ctagtcgaag accccggcgc aagtacggcg cggccagcct 16380

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ccgcgcacct ctgaccctgc cgcgcgcgcg ctaccacccg agcatcgcca tttaaacttt 16620

cgccagcttt gcagatcaat ggccctcaca tgccgccttc gcgttcccat tacgggctac 16680

cgaggaagaa aaccgcgccg tagaaggctg gcggggaacg ggatgcgtcg ccaccaccac 16740

cggcggcggc gcgccatcag caagcggttg gggggaggct tcctgcccgc gctgatcccc 16800

atcatcgccg cggcgatcgg ggcgatcccc ggcattgctt ccgtggcggt gcaggcctct 16860

cagcgccact gagacacact tggaaacatc ttgtaataaa cccatggact ctgacgctcc 16920

tggtcctgtg atgtgttttc gtagacagat ggaagacatc aatttttcgt ccctggctcc 16980

gcgacacggc acgcggccgt tcatgggcac ctggagcgac atcggcacca gccaactgaa 17040

cgggggcgcc ttcaattgga gcagtctctg gagcgggctt aagaatttcg ggtccacgct 17100

taaaacctat ggcagcaagg cgtggaacag caccacaggg caggcgctga gggataagct 17160

gaaagagcag aacttccagc agaaggtggt cgatgggctc gcctcgggca tcaacggggt 17220

ggtggacctg gccaaccagg ccgtgcagcg gcagatcaac agccgcctgg acccggtgcc 17280

gcccgccggc tccgtggaga tgccgcaggt ggaggaggag ctgcctcccc tggacaagcg 17340

gggcgagaag cgaccccgcc ccgatgcgga ggagacgctg ctgacgcaca cggacgagcc 17400

gcccccgtac gaggaggcgg tgaaactggg tctgcccacc acgcggccca tcgcgcccct 17460

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gggagtgcag agtgtgaagc gccgccgctg ctattaaacc taccgtagcg cttaacttgc 17700

ttgtctgtgt gtgtatgtat tatgtcgccg ccgccgctgt ccaccagaag gaggagtgaa 17760

gaggcgcgtc gccgagttgc aagatggcca ccccatcgat gctgccccag tgggcgtaca 17820

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gcgccacaga cacctacttc agtctgggga acaagtttag gaaccccacg gtggcgccca 17940

cgcacgatgt gaccaccgac cgcagccagc ggctgacgct gcgcttcgtg cccgtggacc 18000

gcgaggacaa cacctactcg tacaaagtgc gctacacgct ggccgtgggc gacaaccgcg 18060

tgctggacat ggccagcacc tactttgaca tccgcggcgt gctggatcgg ggccctagct 18120

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gtcagtggac atataaagcc gatggtgaaa ctgccacaga aaaaacctat acatatggaa 18240

atgcacccgt gcagggcatt aacatcacaa aagatggtat tcaacttgga actgacaccg 18300

atgatcagcc aatctacgca gataaaacct atcagcctga acctcaagtg ggtgatgctg 18360

aatggcatga catcactggt actgatgaaa agtatggagg cagagctctt aagcctgata 18420

ccaaaatgaa gccttgttat ggttcttttg ccaagcctac taataaagaa ggaggtcagg 18480

caaatgtgaa aacaggaaca ggcactacta aagaatatga catagacatg gctttctttg 18540

acaacagaag tgcggctgct gctggcctag ctccagaaat tgttttgtat actgaaaatg 18600

tggatttgga aactccagat acccatattg tatacaaagc aggcacagat gacagcagct 18660

cttctattaa tttgggtcag caagccatgc ccaacagacc taactacatt ggtttcagag 18720

acaactttat cgggctcatg tactacaaca gcactggcaa tatgggggtg ctggccggtc 18780

aggcttctca gctgaatgct gtggttgact tgcaagacag aaacaccgag ctgtcctacc 18840

agctcttgct tgactctctg ggtgacagaa cccggtattt cagtatgtgg aatcaggcgg 18900

tggacagcta tgatcctgat gtgcgcatta ttgaaaatca tggtgtggag gatgaacttc 18960

ccaactattg tttccctctg gatgctgttg gcagaacaga tacttatcag ggaattaagg 19020

ctaatggaac tgatcaaacc acatggacca aagatgacag tgtcaatgat gctaatgaga 19080

taggcaaggg taatccattc gccatggaaa tcaacatcca agccaacctg tggaggaact 19140

tcctctacgc caacgtggcc ctgtacctgc ccgactctta caagtacacg ccggccaatg 19200

ttaccctgcc caccaacacc aacacctacg attacatgaa cggccgggtg gtggcgccct 19260

cgctggtgga ctcctacatc aacatcgggg cgcgctggtc gctggatccc atggacaacg 19320

tgaacccctt caaccaccac cgcaatgcgg ggctgcgcta ccgctccatg ctcctgggca 19380

acgggcgcta cgtgcccttc cacatccagg tgccccagaa atttttcgcc atcaagagcc 19440

tcctgctcct gcccgggtcc tacacctacg agtggaactt ccgcaaggac gtcaacatga 19500

tcctgcagag ctccctcggc aacgacctgc gcacggacgg ggcctccatc tccttcacca 19560

gcatcaacct ctacgccacc ttcttcccca tggcgcacaa cacggcctcc acgctcgagg 19620

ccatgctgcg caacgacacc aacgaccagt ccttcaacga ctacctctcg gcggccaaca 19680

tgctctaccc catcccggcc aacgccacca acgtgcccat ctccatcccc tcgcgcaact 19740

gggccgcctt ccgcggctgg tccttcacgc gtctcaagac caaggagacg ccctcgctgg 19800

gctccgggtt cgacccctac ttcgtctact cgggctccat cccctacctc gacggcacct 19860

tctacctcaa ccacaccttc aagaaggtct ccatcacctt cgactcctcc gtcagctggc 19920

ccggcaacga ccggctcctg acgcccaacg agttcgaaat caagcgcacc gtcgacggcg 19980

agggctacaa cgtggcccag tgcaacatga ccaaggactg gttcctggtc cagatgctgg 20040

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aggactacca ggccgtcacc ctggcctacc agcacaacaa ctcgggcttc gtcggctacc 20220

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gcatcccctt ctccagcaac ttcatgtcca tgggcgcgct caccgacctc ggccagaaca 20400

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cctaagctct tgcttcttgc aagccatggc cgcgggctcc ggcgagcagg agctcagggc 20640

catcatccgc gacctgggct gcgggcccta cttcctgggc accttcgata agcgcttccc 20700

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ccagaccgtg cagggtccgc gctcggccgc ctgcgggctc ttctgctgca tgttcctgca 21000

cgccttcgtg cactggcccg accgccccat ggacaagaac cccaccatga acttgctgac 21060

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catcgagaag gccaccgcct tcgaccgcat gaatcaagac atgtaaaccg tgtgtgtatg 21240

ttaaatgtct ttaataaaca gcactttcat gttacacatg catctgagat gatttattta 21300

gaaatcgaaa gggttctgcc gggtctcggc atggcccgcg ggcagggaca cgttgcggaa 21360

ctggtacttg gccagccact tgaactcggg gatcagcagt ttgggcagcg gggtgtcggg 21420

gaaggagtcg gtccacagct tccgcgtcag ttgcagggcg cccagcaggt cgggcgcgga 21480

gatcttgaaa tcgcagttgg gacccgcgtt ctgcgcgcgg gagttgcggt acacggggtt 21540

gcagcactgg aacaccatca gggccgggtg cttcacgctc gccagcaccg tcgcgtcggt 21600

gatgctctcc acgtcgaggt cctcggcgtt ggccatcccg aagggggtca tcttgcaggt 21660

ctgccttccc atggtgggca cgcacccggg cttgtggttg caatcgcagt gcagggggat 21720

cagcatcatc tgggcctggt cggcgttcat ccccgggtac atggccttca tgaaagcctc 21780

caattgcctg aacgcctgct gggccttggc tccctcggtg aagaagaccc cgcaggactt 21840

gctagagaac tggttggtgg cgcacccggc gtcgtgcacg cagcagcgcg cgtcgttgtt 21900

ggccagctgc accacgctgc gcccccagcg gttctgggtg atcttggccc ggtcggggtt 21960

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gccctgctcg ggcatcagct ggaagttggc tttcaggtcg gtctccacgc ggtagcggtc 22320

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ctacctccac ctgagcgggg gggaggacgc gctcatcaag catctggccc ggcaggccac 23220

catcgtcaag gatgcgctgc tcgaccgcac cgaggtgccc ctcagcgtgg aggagctcag 23280

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gcggcgcaaa ctcatgatgg ccgtggtcct ggtgaccgtg gagctggagt gcctgcgccg 23940

cttcttcgcc gacgcggaga ccctgcgcaa ggtcgaggag aacctgcact acctcttcag 24000

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cgtcgtcctc ggcgggggag aaagcaagca gcacggatac catctccgct ccgggtcggg 25260

gtcccgctcg accacacagt agatgggacg agaccggacg attcccgaac cccaccaccc 25320

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aaatccacag cggcggcagc aggtggactg aggatcgcgg cgaacgagcc ggcgcaaacc 25620

cgggagctga ggaaccggat ctttcccacc ctctatgcca tcttccagca gagtcggggg 25680

caggagcagg aactgaaagt caagaaccgt tctctgcgct cgctcacccg cagttgtctg 25740

tatcacaaga gcgaagacca acttcagcgc actctcgagg acgccgaggc tctcttcaac 25800

aagtactgcg cgctcactct taaagagtag cccgcgcccg cccagtcgca gaaaaaggcg 25860

ggaattacgt cacctgtgcc cttcgcccta gccgcctcca cccatcatca tgagcaaaga 25920

gattcccacg ccttacatgt ggagctacca gccccagatg ggcctggccg ccggtgccgc 25980

ccaggactac tccacccgca tgaattggct cagcgccggg cccgcgatga tctcacgggt 26040

gaatgacatc cgcgcccacc gaaaccagat actcctagaa cagtcagcgc tcaccgccac 26100

gccccgcaat cacctcaatc cgcgtaattg gcccgccgcc ctggtgtacc aggaaattcc 26160

ccagcccacg accgtactac ttccgcgaga cgcccaggcc gaagtccagc tgactaactc 26220

aggtgtccag ctggcgggcg gcgccaccct gtgtcgtcac cgccccgctc agggtataaa 26280

gcggctggtg atccggggca gaggcacaca gctcaacgac gaggtggtga gctcttcgct 26340

gggtctgcga cctgacggag tcttccaact cgccggatcg gggagatctt ccttcacgcc 26400

tcgtcaggcc gtcctgactt tggagagttc gtcctcgcag ccccgctcgg gtggcatcgg 26460

cactctccag ttcgtggagg agttcactcc ctcggtctac ttcaacccct tctccggctc 26520

ccccggccac tacccggacg agttcatccc gaacttcgac gccatcagcg agtcggtgga 26580

cggctacgat tgaatgtccc atggtggcgc agctgaccta gctcggcttc gacacctgga 26640

ccactgccgc cgcttccgct gcttcgctcg ggatctcgcc gagtttgcct actttgagct 26700

gcccgaggag caccctcagg gcccggccca cggagtgcgg atcgtcgtcg aagggggcct 26760

cgactcccac ctgcttcgga tcttcagcca gcgtccgatc ctggtcgagc gcgagcaagg 26820

acagaccctt ctgactctgt actgcatctg caaccacccc ggcctgcatg aaagtctttg 26880

ttgtctgctg tgtactgagt ataataaaag ctgagatcag cgactactcc ggacttccgt 26940

gtgttcctga atccatcaac cagtctttgt tcttcaccgg gaacgagacc gagctccagc 27000

tccagtgtaa gccccacaag aagtacctca cctggctgtt ccagggctcc ccgatcgccg 27060

ttgtcaacca ctgcgacaac gactatttaa atccacaata catgcccata ttagactatg 27120

aggccgagcc acagcgaccc atgctccccg ctattagtta cttcaatcta accggcggag 27180

atgactgacc cactggccaa caacaacgtc aacgaccttc tcctggacat ggacggccgc 27240

gcctcggagc agcgactcgc ccaacttcgc attcgccagc agcaggagag agccgtcaag 27300

gagctgcagg atgcggtggc catccaccag tgcaagagag gcatcttctg cctggtgaaa 27360

caggccaaga tctcctacga ggtcactcca aacgaccatc gcctctccta cgagctcctg 27420

cagcagcgcc agaagttcac ctgcctggtc ggagtcaacc ccatcgtcat cacccagcag 27480

tctggcgata ccaaggggtg catccactgc tcctgcgact cccccgactg cgtccacact 27540

ctgatcaaga ccctctgcgg cctccgcgac ctcctcccca tgaactaatc acccccttat 27600

ccagtgaaat aaagatcata ttgatgatga ttttacagaa ataaaaaata atcatttgat 27660

ttgaaataaa gatacaatca tattgatgat ttgagtttaa caaaaaaata aagaatcact 27720

tacttgaaat ctgataccag gtctctgtcc atgttttctg ccaacaccac ttcactcccc 27780

tcttcccagc tctggtactg caggccccgg cgggctgcaa acttcctcca cacgctgaag 27840

gggatgtcaa attcctcctg tccctcaatc ttcattttat cttctatcag atgtccaaaa 27900

agcgcgtccg ggtggatgat gacttcgacc ccgtctaccc ctacgatgca gacaacgcac 27960

cgaccgtgcc cttcatcaac ccccccttcg tctcttcaga tggattccaa gagaagcccc 28020

tgggggtgtt gtccctgcga ctggccgacc ccgtcaccac caagaacggg gaaatcaccc 28080

tcaagctggg agagggggtg gacctcgatt cctcgggaaa actcatctcc aacacggcca 28140

ccaaggccgc cgcccctctc agtttttcca acaacaccat ttcccttaac atggatcacc 28200

ccttttacac taaagatgga aaattatcct tacaagtttc tccaccatta aatatactga 28260

gaacaagcat tctaaacaca ctagctttag gttttggatc aggtttagga ctccgtggct 28320

ctgccttggc agtacagtta gtctctccac ttacatttga tactgatgga aacataaagc 28380

ttaccttaga cagaggtttg catgttacaa caggagatgc aattgaaagc aacataagct 28440

gggctaaagg tttaaaattt gaagatggag ccatagcaac caacattgga aatgggttag 28500

agtttggaag cagtagtaca gaaacaggtg ttgatgatgc ttacccaatc caagttaaac 28560

ttggatctgg ccttagcttt gacagtacag gagccataat ggctggtaac aaagaagacg 28620

ataaactcac tttgtggaca acacctgatc catcaccaaa ctgtcaaata ctcgcagaaa 28680

atgatgcaaa actaacactt tgcttgacta aatgtggtag tcaaatactg gccactgtgt 28740

cagtcttagt tgtaggaagt ggaaacctaa accccattac tggcaccgta agcagtgctc 28800

aggtgtttct acgttttgat gcaaacggtg ttcttttaac agaacattct acactaaaaa 28860

aatactgggg gtataggcag ggagatagca tagatggcac tccatatacc aatgctgtag 28920

gattcatgcc caatttaaaa gcttatccaa agtcacaaag ttctactact aaaaataata 28980

tagtagggca agtatacatg aatggagatg tttcaaaacc tatgcttctc actataaccc 29040

tcaatggtac tgatgacagc aacagtacat attcaatgtc attttcatac acctggacta 29100

atggaagcta tgttggagca acatttgggg ctaactctta taccttctca tacatcgccc 29160

aagaatgaac actgtatccc accctgcatg ccaacccttc ccaccccact ctgtggaaca 29220

aactctgaaa cacaaaataa aataaagttc aagtgtttta ttgattcaac agttaactta 29280

caggattcga gcagttattt ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc 29340

cccccgcaca gccttgaaca tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac 29400

gttccacaca gtttcagagc gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg 29460

gcactcccgc atctgcacct cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat 29520

cacggttatc tggaagaagc agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc 29580

ggccggtggt gtcgcatcag gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg 29640

ctgctcaggg ggtccgggtc cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc 29700

agtcgtctgg tgcggcgggc gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac 29760

gtgcaacaca gaaccaccag gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa 29820

ctcatcgcgg gaaggatgct acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag 29880

tggtgccccc tccagaacac gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc 29940

accacctccc ggtaccacat caccctctgg ttgaacatgc agccccggat gatcctgcgg 30000

aaccacaggg ccagcaccgc cccgcccgcc atgcagcgaa gagaccccgg gtcccggcaa 30060

tggcaatgga ggacccaccg ctcgtacccg tggatcatct gggagctgaa caagtctatg 30120

ttggcacagc acaggcatat gctcatgcat ctcttcagca ctctcaactc ctcgggggtc 30180

aaaaccatat cccagggcac ggggaactct tgcaggacag cgaaccccgc agaacagggc 30240

aatcctcgca cagaacttac attgtgcatg gacagggtat cgcaatcagg cagcaccggg 30300

tgatcctcca ccagagaagc gcgggtctcg gtctcctcac agcgtggtaa gggggccggc 30360

cgatacgggt gatggcggga cgcggctgat cgtgttcgcg accgtgtcat gatgcagttg 30420

ctttcggaca ttttcgtact tgctgtagca gaacctggtc cgggcgctgc acaccgatcg 30480

ccggcggcgg tctcggcgct tggaacgctc ggtgttgaaa ttgtaaaaca gccactctct 30540

cagaccgtgc agcagatcta gggcctcagg agtgatgaag atcccatcat gcctgatggc 30600

tctgatcaca tcgaccaccg tggaatgggc cagacccagc cagatgatgc aattttgttg 30660

ggtttcggtg acggcggggg agggaagaac aggaagaacc atgattaact tttaatccaa 30720

acggtctcgg agtacttcaa aatgaagatc gcggagatgg cacctctcgc ccccgctgtg 30780

ttggtggaaa ataacagcca ggtcaaaggt gatacggttc tcgagatgtt ccacggtggc 30840

ttccagcaaa gcctccacgc gcacatccag aaacaagaca atagcgaaag cgggagggtt 30900

ctctaattcc tcaatcatca tgttacactc ctgcaccatc cccagataat tttcattttt 30960

ccagccttga atgattcgaa ctagttcgtg aggtaaatcc aagccagcca tgataaagag 31020

ctcgcgcaga gcgccctcca ccggcattct taagcacacc ctcataattc caagatattc 31080

tgctcctggt tcacctgcag cagattgaca agcggaatat caaaatctct gccgcgatcc 31140

ctgagctcct ccctcagcaa taactgtaag tactctttca tatcctctcc gaaattttta 31200

gccataggac caccaggaat aagattaggg caagccacag tacagataaa ccgaagtcct 31260

ccccagtgag cattgccaaa tgcaagactg ctataagcat gctggctaga cccggtgata 31320

tcttccagat aactggacag aaaatcgccc aggcaatttt taagaaaatc aacaaaagaa 31380

aaatcctcca ggtggacgtt tagagcctcg ggaacaacga tgaagtaaat gcaagcggtg 31440

cgttccagca tggttagtta gctgatctgt agaaaaaaca aaaatgaaca ttaaaccatg 31500

ctagcctggc gaacaggtgg gtaaatcgtt ctctccagca ccaggcaggc cacggggtct 31560

ccggcgcgac cctcgtaaaa attgtcgcta tgattgaaaa ccatcacaga gagacgttcc 31620

cggtggccgg cgtgaatgat tcgacaagat gaatacaccc ccggaacatt ggcgtccgcg 31680

agtgaaaaaa agcgcccgag gaagcaataa ggcactacaa tgctcagtct caagtccagc 31740

aaagcgatgc catgcggatg aagcacaaaa ttctcaggtg cgtacaaaat gtaattactc 31800

ccctcctgca caggcagcaa agcccccgat ccctccaggt acacatacaa agcctcagcg 31860

tccatgttaa cagcttaccg agcagcagca cacaacaggc gcaagagtca gagaaaggct 31920

gagctctaac ctgtccaccc gctctctgct caatatatag cccagatcta cactgacgta 31980

aaggccaaag tctaaaaata cccgccaaat aatcacacac gcccagcaca cgcccagaaa 32040

ccggtgacac actcaaaaaa atacgcgcac ttcctcaaac gcccaaaact gccgtcattt 32100

ccgggttccc acgctacgtc atcaaaacac gactttcaaa ttccgtcgac cgttaaaaac 32160

gtcacccgcc ccgcccctaa cggtcgcccg tctctcagcc aatcagcgcc ccgcatcccc 32220

aaattcaaac acctcatttg catattaacg cgcacaaaaa gtttgaggta tattattgat 32280

gatggttaat taagaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 32340

gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 32400

aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc 32460

tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 32520

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 32580

ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 32640

tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 32700

agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 32760

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 32820

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 32880

gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 32940

cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 33000

atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 33060

agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 33120

gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 33180

ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 33240

cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 33300

ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 33360

atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 33420

gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 33480

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 33540

gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 33600

gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 33660

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 33720

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 33780

tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 33840

ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 33900

ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 33960

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ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 34080

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tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 34200

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 34260

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcttt 34320

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 34380

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 34440

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 34500

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 34560

cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 34620

cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 34680

gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 34740

attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa 34800

ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc 34860

gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg 34920

attacgccaa gcttgcatgc ctgcaggttt aaacttaatt aaccatcttc aataatatac 34980

ctcaaacttt ttgtgcgcgt taatatgcaa atgaggcgtt tgaatttggg gaggaagggc 35040

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<210> 2

<211> 1426

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1426)

<223> CMV-EGFP核苷酸序列

<400> 2

cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60

atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120

cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180

tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240

tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300

ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360

acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 420

gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480

tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540

cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600

ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 660

aagctggcta gcgtttaaac gggcccgccc gggcttataa gccaccatgg tgagcaaggg 720

cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg 780

ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct 840

gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct 900

gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt 960

caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg 1020

caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga 1080

gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa 1140

ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa 1200

cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca 1260

gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca 1320

gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt 1380

gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaa 1426

<210> 3

<211> 2728

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2728)

<223> AdHu5 E4核苷酸序列

<400> 3

tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 60

ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 120

tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 180

gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 240

ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 300

atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 360

ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 420

ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 480

agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 540

gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 600

gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat 660

gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac 720

caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg 780

actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat 840

gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 900

ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac 960

actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg 1020

cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg 1080

atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 1140

aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa 1200

cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc 1260

actctctcaa agcatccagg cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact ccttcatgcg 1320

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tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac gcgctcccct 1500

ccggtggcgt ggtcaaactc tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt aagatgttgc 1560

acaatggctt ccaaaaggca aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag gctaaaccct 1620

tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa ataattctca 1680

tctcgccacc ttctcaatat atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta 1740

aaaatctgct ccagagcgcc ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa 1800

attcaggttc ctcacagacc tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc 1860

gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca 1920

gcgcggccac ttccccgcca ggaaccatga caaaagaacc cacactgatt atgacacgca 1980

tactcggagc tatgctaacc agcgtagccc cgatgtaagc ttgttgcatg ggcggcgata 2040

taaaatgcaa ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat 2100

cgtagtcatg ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca 2160

ccatttttct ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa 2220

aaacatttaa acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag 2280

acggactacg gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac 2340

caccgacagc tcctcggtca tgtccggagt cataatgtaa gactcggtaa acacatcagg 2400

ttgattcaca tcggtcagtg ctaaaaagcg accgaaatag cccgggggaa tacatacccg 2460

caggcgtaga gacaacatta cagcccccat aggaggtata acaaaattaa taggagagaa 2520

aaacacataa acacctgaaa aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct cccgctccag 2580

aacaacatac agcgcttcca cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga 2640

aaacctatta aaaaaacacc actcgacacg gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa 2700

agggccaagt gcagagcgag tatatata 2728

<210> 4

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1164)

<223> AdHu5 E4 ORF6/7核苷酸序列

<400> 4