根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法
阅读说明：本技术 根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法 (Agrobacterium tumefaciens-mediated chrysanthemum 'shenma' transgenic method ) 是由 亓帅 于晓艳 王爽 张小羽 徐宗大 王金娥 谌堪 于 2020-12-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法,主要包括外植体预培养、菌液制备、共培养、延迟培养和筛选培养几个关键步骤。本发明对影响菊花‘神马’转化过程的多个因素进行了筛选和改良,通过优选外植体、提供足够时间的暗培养以及优化培养基的组成,从而提高了菊花转基因过程的再生转化率,提高了转化体系的稳定性,为后期在菊花中进行转基因功能验证和基因工程育种奠定了基础。(The invention discloses a transgenic method of agrobacterium tumefaciens-mediated chrysanthemum 'shenma', which mainly comprises the key steps of explant pre-culture, bacterial liquid preparation, co-culture, delayed culture and screening culture. The invention screens and improves a plurality of factors influencing the transformation process of the chrysanthemum, improves the regeneration transformation rate of the chrysanthemum in the transgenic process, improves the stability of a transformation system and lays a foundation for carrying out transgenic function verification and genetic engineering breeding in the chrysanthemum at the later stage by optimizing explants, providing dark culture for enough time and optimizing the composition of a culture medium.)
技术领域
本发明涉及菊花转基因技术领域，具体涉及一种根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属的多年生宿根草本植物，为我国原产的十大传统名花，也是世界四大切花之一，其产值和产量在世界花卉中始终位居前列。菊花起源于中国，分布于世界各地，在我国具有2500多年悠久的栽培历史。因其花色万千、花型优美、品种丰富，具有较高的观赏特性而广泛应于城市园林和公园绿化等，是园林中重要的观赏植物之一，深受人们的喜爱。
菊花‘神马’是日本培育的白色秋菊品种，花朵硕大、颜色洁白，是一种优良的切花菊品种，在市场上受到普遍欢迎。同时，切花菊‘神马’也是菊花分子生物学研究中广泛使用的材料。
由于受到物种自身基因型和种源的限制很大，传统菊花育种方法难以获得成功。转基因技术的出现为菊花育种提供了新的思路和途径。根癌农杆菌介导的转基因体系是研究菊花基因功能和获得遗传修饰有机体的常用手段之一。农杆菌介导的菊花转化过程受启动子、农杆菌菌株类型、植物基因型、转化受体类型、伤口、化学物质、预培养时间、菌浓度和侵染时间、选择的程度和时间等诸多因素的影响。
目前菊花转基因过程中仍存在着很大的问题：(1)不同文献对切花菊‘神马’再生和转化体系的条件描述差异较大，如培养基种类、生长激素的种类和浓度等，导致其可重复性差、遗传转化不稳定；(2)外植体脱分化为愈伤组织后，愈伤组织容易出现褐化、死亡等现象，分化成芽率低，导致再生和转化效率低。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法。本发明对影响菊花‘神马’转化过程的多个因素进行了筛选和改良，从而提高了菊花转基因过程的再生转化率，提高了转化体系的稳定性，为后期在菊花中进行转基因功能验证和基因工程育种奠定了基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种根癌农杆菌介导的菊花‘神马’的转基因方法，包括以下步骤：
(1)以菊花‘神马’无菌苗的幼嫩叶片为外植体，将外植体的近轴面朝下接种到预培养基中，在22-24℃、黑暗条件下预培养2d；
(2)将转化有重组表达载体的根癌农杆菌进行活化和培养，收集菌体，并用1/2MS液体培养基重悬，制备得到农杆菌菌液；
(3)将步骤(1)中预培养后的外植体浸入农杆菌菌液中侵染8-12min；
(4)将侵染后的外植体上多余的农杆菌菌液进行吸干处理，然后近轴面朝下接种到共培养培养基中，在22-24℃、黑暗条件下共培养2d；
(5)将步骤(4)中共培养后的外植体用羧苄青霉素溶液冲洗，再用无菌水清洗，将清洗后的外植体近轴面朝下接种到延迟培养基中，在22-24℃、黑暗条件下延迟培养4d；
(6)将延迟培养后的外植体近轴面朝下转到筛选分化培养基中，在22-24℃、黑暗条件下筛选培养10d；然后转至光照周期为光照16h/黑暗8h的培养箱中，在22-24℃条件下进行培养，至分化出苗；
(7)待苗高1-2cm时，将其切下接种到生根培养基中进行培养，获得转基因抗性植株。
优选的，所述预培养基为含有2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6；
所述共培养培养基为含有2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6；
所述延迟培养基为含有400mg/L羧苄青霉素、2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6；
所述筛选分化培养基为含有400mg/L羧苄青霉素、5mg/L卡那霉素、2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6；
所述生根培养基为含有400mg/L羧苄青霉素、5mg/L卡那霉素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
优选的，步骤(1)中，选用20-25d苗龄的菊花‘神马’无菌苗中上部已经充分展开的幼嫩叶片为外植体。
优选的，步骤(1)中，在超净工作台上将菊花‘神马’无菌苗的幼嫩叶片切成5mm×5mm的正方形，叶柄切成5mm长度。
优选的，步骤(2)中，所述根癌农杆菌为根癌农杆菌GV3101。
优选的，步骤(2)中，所述重组表达载体为插入有目的基因的载体质粒为pBI121。
优选的，步骤(2)中，所述活化和培养具体为：将根癌农杆菌放入灭菌后的锥形瓶中，加入10ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，于28℃、200rpm振荡培养箱中振荡过夜培养；在锥形瓶中再加入90ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，振荡培养2-3个小时，直至OD600达0.4-0.6。
优选的，步骤(7)获得转基因抗性植株后，还包括对转基因抗性植株进行基因检测的步骤。
本发明的第二方面，提供上述转基因方法在菊花育种中的应用。
本发明的有益效果：
(1)外植体的选择：菊花组培苗的苗龄以20-25d最佳，此时菊花生长最为旺盛，叶片和叶柄的分生能力最强。通常菊花转化选取的外植体为叶盘，但实验发现叶盘和叶柄均可作为合适的侵染外植体。
(2)足够的暗培养：本发明发现暗培养对于愈伤组织的诱导和愈伤组织的分化都非常重要，在转化前期，从预培养至延迟培养，直至筛选培养的前十天，均需要暗培养。
(3)外植体摆放方式：叶盘和叶柄在培养基中培养一段时间后，往往会出现向后卷曲现象，为了保证其尽可能多的接触培养基，在整个培养过程中，叶盘和叶柄均需采用近轴面(即正面)朝下的方式摆放。
(4)培养基成分：芽的分化是菊花再生和转化过程中较为困难的步骤，2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，既可以诱导产生愈伤组织，也可以经过愈伤组织或不经愈伤组织诱导芽的分化。该培养基极大的提高了外植体再生效率，从而提高了转化效率。
利用上述方法对菊花进行农杆菌转化，再生和转化率高，时间周期短，提高了菊花转基因的效率和稳定性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，菊花是基因工程起步较晚的观赏植物，转化过程受多种因素的影响，菊花遗传转化效率低是菊花基因工程研究中亟待解决的问题之一。
基于此，本发明对影响菊花转化过程的多个因素进行了筛选和改良，从而提高了菊花转基因过程的再生转化率，提高了转化体系的稳定性。
在本发明的一种实施方案中，给出的根癌农杆菌介导的外源基因转化菊花的方法，具体实施步骤如下：
(1)预培养：选用20-25d苗龄的菊花‘神马’无菌苗中上部已经充分展开的幼嫩叶片为外植体，在超净工作台中用手术刀将叶片切成5mm*5mm的正方形，叶柄切成5mm长度，将切好的叶片和叶柄近轴面朝下，接种到预培养培养基中，将其放置在23℃黑暗中预培养2d。培养基为2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(2)菌液制备：载体质粒为pBI121，根癌农杆菌菌株为GV3101。将提前制备好的农杆菌菌液从-80℃冰箱取出，放置于冰盒中，待其融化。在超净工作台中，取500μl菌液于灭菌后的锥形瓶中，再加入10ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，于28℃、200rpm振荡培养箱中振荡过夜培养。第二天上午，在锥形瓶中再加入90ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，振荡培养2-3个小时，直至OD600达0.5左右。在工作台中，将摇好的100ml菌液分装到两个离心管中，4℃、4000rpm离心8min，收集菌体，弃上清，各加50ml1/2MS液体培养基重悬备用。
(3)侵染：在超净工作台中，取出已经预培养2天的菊花叶盘和叶柄，放入备好的OD600＝0.5的农杆菌菌液中侵染10min，期间不断振荡使菌液和外植体充分接触。
(4)共培养：侵染好后，取出叶盘和叶柄，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，近轴面朝下，接种到共培养培养基，将其放置在23℃黑暗中培养2d。该共培养培养基为2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(5)延迟培养：在超净工作台中，将经过共培养2天的叶盘和叶柄放入400mg/L的羧苄青霉素溶液中冲洗3遍，再用无菌水冲洗2遍，期间不断振荡使菌液和外植体充分接触。清洗好后，取出叶盘和叶柄，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液和水分，近轴面朝下，接种到延迟培养培养基，将其放置在23℃黑暗中培养4d。该延迟培养培养基为含有400mg/L羧苄青霉素的2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(6)筛选培养：在超净工作台中，取出已经延迟培养4天的菊花叶盘和叶柄，近轴面朝下，转到筛选分化培养培养基中，放在23℃黑暗条件下筛选培养10d。10天后，将其放在光照周期16h/8h(光/暗)的培养箱中，温度仍为23℃，期间每2周更换一次培养基。筛选培养培养基为含有400mg/L羧苄青霉素+5mg/L卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。在该阶段，外植体会经过愈伤组织进而分化出芽成苗，或由外植体直接分化出苗，出苗时间为20-50d。
(7)获得转基因抗性植株：经过筛选培养后，待抗性植株苗高1-2cm时，将分化出的芽从基部切下接种到生根培养基进行培养。生根培养基为含有400mg/L羧苄青霉素+5mg/L卡那霉素+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。抗性芽约9d后开始生根，30d左右生长为完整的植株。当苗长至一定高度后可移入沙土中培养，获得转基因抗性植株，进而进行转基因检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：
应用本方法在山东省泰安市山东农业大学7#518实验室中进行，提供了一种根癌农杆菌介导的外源基因转化菊花‘神马’的方法，重点解决菊花转基因过程中外植体再生和转化效率低，转化体系不稳定的问题。本实施例中转入的外源基因为菊花SVP同源基因，相应的，载体质粒和农杆菌菌株中均含有该基因序列。
具体实施步骤如下：
(1)预培养：选用25d苗龄的菊花‘神马’无菌苗中上部已经充分展开的幼嫩叶片为外植体，在超净工作台中用手术刀将叶片切成5mm*5mm的正方形，叶柄切成5mm长度，将切好的叶片和叶柄近轴面朝下，接种到预培养培养基中，将其放置在23℃黑暗中预培养2d。培养基为2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(2)菌液制备：载体质粒为pBI121，根癌农杆菌菌株为GV3101。将提前制备好的农杆菌菌液从-80℃冰箱取出，放置于冰盒中，待其融化。在超净工作台中，取500μl菌液于灭菌后的锥形瓶中，再加入10ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，于28℃、200rpm振荡培养箱中振荡过夜培养。第二天上午，在锥形瓶中再加入90ml含有卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，振荡培养2-3个小时，直至OD600达0.5左右。在工作台中，将摇好的100ml菌液分装到两个离心管中，4℃、4000rpm离心8min，收集菌体，弃上清，各加50ml 1/2MS液体培养基重悬，制得农杆菌菌液，备用。
(3)侵染：在超净工作台中，取出已经预培养2天的菊花叶盘和叶柄，放入备好的OD600＝0.5的农杆菌菌液中侵染10min，期间不断振荡使菌液和外植体充分接触。
(4)共培养：侵染好后，取出叶盘和叶柄，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，近轴面朝下，接种到共培养培养基，将其放置在23℃黑暗中培养2d。该共培养培养基为2mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(5)延迟培养：在超净工作台中，将经过共培养2天的叶盘和叶柄放入400mg/L的羧苄青霉素溶液中冲洗3遍，再用无菌水冲洗2遍，期间不断振荡使菌液和外植体充分接触。清洗好后，取出叶盘和叶柄，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液和水分，近轴面朝下，接种到延迟培养培养基，将其放置在23℃黑暗中培养4d。该延迟培养培养基为含有400mg/L羧苄青霉素的2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。
(6)筛选培养：在超净工作台中，取出已经延迟培养4天的菊花叶盘和叶柄，近轴面朝下，转到筛选分化培养培养基中，放在23℃黑暗条件下筛选培养10d。10天后，将其放在光照周期16h/8h(光/暗)的培养箱中，温度仍为23℃，期间每2周更换一次培养基。筛选培养培养基为含有400mg/L羧苄青霉素+5mg/L卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。在该阶段，外植体会经过愈伤组织进而分化出芽成苗，出苗时间为20-30d。
(7)获得转基因抗性植株：经过筛选培养后，待抗性植株苗高1-2cm时，将分化出的芽从基部切下，并将其接种到生根培养基进行培养。生根培养基为含有400mg/L羧苄青霉素+5mg/L卡那霉素+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉的MS培养基，pH为5.8-6。抗性芽约9d后开始生根，30d左右生长为完整的植株。当苗长至一定高度后可移入沙土中培养，获得转基因抗性植株，对获得的转基因抗性植株进行PCR检测，鉴定是否为转基因阳性苗。
经统计，采用本实施例的方法，愈伤组织诱导率为98.9％，出芽率为30.3％，成苗率为70.0％。
对比例1：
外植体选择、侵染方式、培养条件均同实施例1，区别在于步骤(1)、(4)、(5)(6)培养基中添加的激素类型和激素浓度不同。如表1和表2所示，共对包括本申请在内的18种激素组合进行了试验，统计愈伤组织诱导率、出芽率和成苗率：
表1：6-BA和NAA不同激素配比对菊花愈伤诱导和分化能力的影响
表2：6-BA和2,4-D不同激素配比对菊花愈伤诱导和分化能力的影响
表1和表2中，出芽率＝分化出不定芽的外植体数量/诱导出愈伤的外植体数×100％；
成苗率＝成苗的外植体数量/分化出不定芽的外植体数量×100％。
由表1可知，在以6-BA和NAA为添加物的不同浓度配比的9种培养基中，当6-BA浓度为2mg/L、NAA浓度为0.5mg/L时，培养基总体表现最好，最有利于菊花外植体的愈伤诱导和分化。
由表2可知，通过以6-BA和2,4-D为添加物不同激素配比的九种培养基均无法成功获得转基因菊花外植体分化的不定芽，成苗率均为0。
因此，可以确定菊花叶片最佳愈伤诱导和分化培养基MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。
对比例2：
侵染方式、培养条件、培养基成分均同实施例1，区别在于步骤(1)中外植体来源于不同苗龄的无菌组培苗，分别选用25d、50d和65d苗龄的菊花‘神马’的无菌苗中上部叶片进行农杆菌转化试验，统计愈伤组织诱导率和出芽率。
表3：无菌苗苗龄对菊花‘神马’愈伤组织的诱导和分化的影响
如表3所示，随着无菌苗苗龄的增加，不管是愈伤诱导率还是出芽率都呈现明显的下降趋势。其中，苗龄25天的无菌苗出愈率和出芽率最高，分别为98.0％和24.5％，远远高于苗龄50天和65天的无菌苗。因此，无菌苗苗龄对于遗传转化具有一定影响。叶片外植体苗龄越高，再生能力越差，二者呈现负相关关系。接种后20-25天的菊花正处在旺盛生长阶段，叶片为嫩绿色，且已经充分展开，此时为最佳外植体取材时间。
对比例3：
外植体选择、侵染方式等均同实施例1，区别在于：
(1)预培养：光照条件为40-200μmol·m-2s-1，25℃；
(2)延迟培养：光照条件为40-200μmol·m-2s-1，25℃；
(3)筛选培养前10天：光照条件为40-200μmol·m-2s-1，25℃。
经统计，采用对比例3的方法，愈伤组织诱导率为91.2％，出芽率为12.4％，成苗率为32.5％。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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