一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法
阅读说明:本技术 一种同时分离提取刺五加甙b和刺五加甙e的方法 (Method for simultaneously separating and extracting eleutheroside B and eleutheroside E ) 是由 宁丹 曹慧璋 易宇阳 谭旭斌 黎震宇 于 2020-11-05 设计创作,主要内容包括:本发明提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,主要步骤包括S1.以乙醇水溶液a提取刺五加根茎粉;S2.减压浓缩步骤S1所得提取液,固液分离;S3.将步骤S1所得清液过非极性树脂,并依次用纯水、乙醇水溶液b洗脱;S4.减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液至浸膏状;S5.向步骤S4所得刺五加浸膏中加入醇溶液搅拌、固液分离;S6.减压浓缩步骤S5所得清液;S7.以热的乙醇水溶液c溶解步骤S6所得析出物,冷却结晶,晶体为甙B;S8.以热的乙醇水溶液d溶解步骤S5所得渣,冷却结晶,晶体为甙E。(The invention provides a method for simultaneously separating and extracting eleutheroside B and eleutheroside E, which mainly comprises the following steps of S1, extracting eleutheroside rhizome powder by using an ethanol water solution a; s2, concentrating the extracting solution obtained in the step S1 under reduced pressure, and carrying out solid-liquid separation; s3, passing the clear liquid obtained in the step S1 through nonpolar resin, and eluting with pure water and ethanol water solution b in sequence; s4, concentrating the ethanol water eluent obtained in the step S3 under reduced pressure to obtain an extract; s5, adding an alcohol solution into the acanthopanax extract obtained in the step S4, stirring and carrying out solid-liquid separation; s6, concentrating the clear liquid obtained in the step S5 under reduced pressure; s7, dissolving the precipitate obtained in the step S6 by using a hot ethanol water solution c, and cooling and crystallizing to obtain a crystal of glycoside B; s8, dissolving the residue obtained in the step S5 with hot ethanol water solution d, cooling and crystallizing to obtain crystal of glycoside E.)
技术领域
本发明属于植物根茎提取加工领域,具体涉及一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法。
背景技术
刺五加(Acanthopanax senticosus)为五加科植物,生于森林或灌丛中,喜温暖湿润气候,耐寒、耐荫蔽,主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北以及山西等地。
刺五加甙B和甙E是刺五加根茎的主要活性成分。在药理上,刺五加甙B具有止血、抗肝毒、改善肝功能的作用;刺五加甙E具有免疫调节、固本强体、抗疲劳、提高机体适应能力、改善血液循环、预防精囊和前列腺萎缩的作用。临床上,包含刺五加甙B和刺五加甙E的刺五加注射液已经被广泛用于短暂性脑缺血、脑动脉硬化、脑血栓、脑栓塞等疾病的治疗。但是,现在临床应用的刺五加注射液为混合物,除主要活性成分甙B和甙E外,还含有甙A、甙B1、甙C、甙D和甙E等;使用刺五加注射液时,可能会由于成分复杂而出现不明原因的不良反应。因此将刺五加甙B和刺五加甙E分离提取,以针对性的应用于临床,具有提升用药效果、降低临床应用风险的重要意义。
相关技术常采用醇水溶液提取,并经大孔树脂纯化的方式,获取刺五加混甙,但是未将其中主要活性成分,刺五加甙B和刺五加甙E分离提取,给刺五加提取物的临床应用带来了不安全性。或者只提取部分刺五加甙B,而舍弃了其他活性成分,造成了资源的浪费。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此,本发明提供了一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法。
一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,包括以下步骤:
S1.以乙醇水溶液a回流提取刺五加根茎粉,获取提取液;
S2.减压浓缩所述提取液,得浓缩提取液,冷却后,所述浓缩提取液固液分离,得一次清液;
S3.将所述一次清液过非极性树脂,并依次用纯水、乙醇水溶液b洗脱,收集乙醇水洗脱液;
S4.减压浓缩所述乙醇水洗脱液至浸膏状,得刺五加浸膏;
S5.在所述刺五加浸膏中加入醇溶液搅拌、降温后,固液分离,得渣和二次清液;
S6.减压浓缩所述二次清液,得浓缩析出物;
S7.以热的乙醇水溶液c溶解所述浓缩析出物,冷却结晶,晶体干燥后,即为所述刺五加甙B;
S8.以热的乙醇水溶液d溶解所述的渣,冷却结晶,晶体干燥后,即为所述刺五加甙E;
所述的刺五加甙B,纯度≥97.65%,收率≥88.3%;
所述的刺五加甙E,纯度≥95.31%,收率≥89.5%。
根据本发明的一种实施方式,步骤S1所述的乙醇水溶液a,乙醇的体积浓度为40~90%。
根据本发明的一种实施方式,步骤S1所述的乙醇水溶液a,添加量为:每克所述刺五加根茎粉添加8~12ml所述乙醇水溶液a。
根据本发明的一种实施方式,步骤S1所述的回流提取,温度为60~85℃。
根据本发明的一种实施方式,步骤S1所述的回流提取,提取次数为2~3次,单次提取时间为1~2h。
根据本发明的一种实施方式,步骤S1所述的提取液,为各次回流提取液的混合液。
根据本发明的一种实施方式,若所述乙醇水溶液a的浓度<40%,所述回流提取温度<60℃,所述提取次数<2,则不能完全提取刺五加根茎粉中的有效成分;若所述乙醇水溶液a的浓度>90%,所述回流提取温度>85℃,所述提取次数>3,会导致溶剂浪费,成本提高,并且未提升刺五加根茎粉中的有效成分的提取效率。
根据本发明的一种实施方式,步骤S2所述的减压浓缩,终点为浓缩提取液中无醇味,即以酒精计检测,测试值约为0。
根据本发明的一种实施方式,步骤S2所述的冷却,温度为4~30℃。
根据本发明的一种优选的实施方式,步骤S2所述的冷却,温度为4~20℃。
所述冷却的目的是,降低所述浓缩提取液中杂质的溶解度,并通过所述固液分离的操作,达到一次除杂的目的。
根据本发明的一种实施方式,步骤S2所述的固液分离为重力沉降、离心、过滤中的一种。
根据本发明的一种实施方式,步骤S3所述的非极性树脂,为D101、LX-100B等大孔非极性树脂。
根据本发明的一种实施方式,步骤S3所述的纯水,体积用量为1~3BV。
步骤S3所述的纯水,洗脱的主要成分为刺五加多糖;所述纯水洗脱的目的是,去除刺五加多糖杂质,达到二次除杂的目的。
根据本发明的一种实施方式,步骤S3所述的乙醇水溶液b,乙醇的体积浓度为40~70%。
根据本发明的一种实施方式,步骤S3所述的乙醇水溶液b,体积用量为2~4BV。
根据本发明的一种实施方式,步骤S4所述的刺五加浸膏,密度为1.1~1.3g/cm3。
根据本发明的一种优选的实施方式,步骤S4所述的刺五加浸膏,密度为1.25~1.3g/cm3。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的醇溶液,为体积浓度是50%~100%的甲醇水溶液或体积浓度是30%~70%的乙醇水溶液。
若所述甲醇水溶液浓度<50%或乙醇水溶液浓度<30%,则刺五加甙E的析出效果变差,不能有效分离刺五加甙B和甙E。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的醇溶液,添加量为:每克所述刺五加浸膏,添加5~10ml所述醇溶液。
根据本发明的一种优选的实施方式,步骤S5所述的醇溶液,添加量为:每克所述刺五加浸膏,添加8~10ml所述醇溶液。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的固液分离为重力沉降、离心、过滤中的一种。
步骤S5中,当所述的固液分离方法为所述的重力沉降时,所述降温后,体系需静置20~30min,以达到固液分层的目的。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的降温,温度为4~40℃。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的降温,温度为4~20℃。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的降温,若温度>40℃,则会导致刺五加甙E随刺五加甙B一起溶解,达不到分离效果。
根据本发明的一种实施方式,步骤S5所述的搅拌,时间为5~10min。
根据本发明的一种实施方式,刺五加甙B和刺五加甙E分离的原因是,在4~40℃温度下,刺五加甙E难溶于体积浓度为50%~100%的甲醇或体积浓度为30%~70%的乙醇水溶液,而刺五加甙B则易溶于所述醇溶液。
根据本发明的一种实施方式,步骤S7所述的乙醇水溶液c,温度为50~70℃,乙醇的体积浓度为90~100%。
根据本发明的一种实施方式,步骤S7所述的乙醇水溶液c,添加量为:每克所述浓缩析出物,添加5~10ml所述乙醇水溶液c。
根据本发明的一种实施方式,步骤S7所述的冷却结晶,条件为将体系冷却至室温并静置12~24h。
根据本发明的一种实施方式,步骤S8所述的乙醇水溶液d,温度为50~70℃,乙醇的体积浓度为90~100%。
根据本发明的一种实施方式,步骤S8所述的乙醇水溶液d,添加量为:每克所述渣,添加5~10ml所述乙醇水溶液d。
根据本发明的一种实施方式,步骤S8所述的冷却结晶,条件为将体系冷却至室温。
所述冷却结晶的作用是,进一步分别纯化刺五加甙B和刺五加甙E,达到三次除杂的目的。
根据本发明的一种实施方式,所述的减压浓缩,浓缩温度为50℃~70℃,压力为-0.06Mpa~-0.1Mpa。
根据本发明的一种实施方式,所述的减压浓缩,蒸出的醇,均回收利用。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明采用简单的加醇分离法,利用刺五加甙E与刺五加甙B在特定浓度醇溶液中溶解度不同的特点,高效分离了刺五加甙B和刺五加甙E。
(2)本发明步骤S3采用非极性树脂纯化一次清液,得到的乙醇水洗脱液中,刺五加总甙含量>74.87%。
(3)本发明通过步骤S2固液分离的一次除杂,步骤S3纯水洗脱的二次除杂,以及步骤S7和S8冷却结晶的三次除杂,提供了纯度高达98.24%的刺五加甙B以及纯度高达96.12%的五加甙E。
(4)通过控制回流提取以及分离提纯的过程参数,使刺五加甙B的收率高达92.7%,刺五加甙E的收率高达92.1%。
(5)本发明所用的醇与水均可回收利用,降低了生产成本。
(6)本发明提供的方法,可操作性强,成本低,易工业化生产,且仅用到了溶剂甲醇、乙醇和水,对环境友好。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
图2是刺五加甙B和刺五加甙E的结构式。
图3是实施例3所得刺五加甙E的高效液相色谱图。
图4是实施例3所得刺五加甙B的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例,并结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的描述,但本发明并不限于这些实施例。
以下所述各实施例的刺五加原料购自亳州地区,其中刺五加甙B为0.79%,刺五加甙E含量为0.3%;所用D101、LX-100B大孔非极性树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
实施例1
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体包括以下步骤:
S1.向100g刺五加根茎粉中,添加800ml体积浓度为40%的乙醇水溶液;并于80℃下,对刺五加根茎粉进行2次回流提取,每次提取时间为2h;收集所有提取液;
S2.将步骤S1所得提取液减压浓缩至无醇味后,静置冷却至4℃,重力沉降,固液分层,取上清液备用;蒸出的乙醇回收利用;
S3.将步骤S3所得上清液上D101大孔非极性树脂后,依次用3BV的纯水,和2BV体积浓度为40%乙醇水溶液进行洗脱,弃去水洗脱液,收集乙醇水洗脱液,刺五加总甙含量为75.32%;
S4.减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液,得密度为1.3g/cm3的刺五加浸膏;
S5.在步骤S5所得的刺五加浸膏中,加入体积浓度为80%的甲醇水溶液,其中甲醇水溶液的添加量为:每克刺五加浸膏,加8ml甲醇水溶液;充分搅拌5min后,冷却至4℃,放置20min后,重力沉降,固液分层,分别收集上清液和渣;
S6.60℃下,减压浓缩步骤S5所得上清液至晶体析出;蒸出的甲醇回收利用;
S7.70℃下,以95%的乙醇水溶液搅拌溶解步骤S6所得的晶体,其中乙醇水溶液添加量为:每克晶体添加5ml乙醇水溶液;放置12h后,晶体结晶析出,收集晶体并干燥即得刺五加甙B;
S8.50℃下,向步骤S5所得的渣中,加入浓度为95%的乙醇水溶液,其中乙醇水溶液添加量为:每克渣添加8ml乙醇水溶液;充分搅拌后,放置冷却结晶,结晶物干燥即得刺五加甙E。
具体的操作流程如图1所示。
实施例2
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体包括以下步骤:
S1.向100g刺五加根茎粉中,添加800ml体积浓度为80%的乙醇水溶液;并于60℃下,对刺五加根茎粉进行3次回流提取,每次提取时间为1h;收集所有提取液;
S2.将步骤S1所得提取液减压浓缩至无醇味后,静置冷却至10℃,重力沉降,固液分层,取上清液备用;蒸出的乙醇回收利用;
S3.将步骤S3所得上清液上D101大孔非极性树脂后,依次用2BV的纯水,和3BV体积浓度为70%乙醇水溶液进行洗脱,弃去水洗脱液,收集乙醇水洗脱液,刺五加总甙含量为74.87%;
S4.减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液,得密度为1.3g/cm3的刺五加浸膏;
S5.在步骤S5所得的刺五加浸膏中,加入体积浓度为70%的甲醇水溶液,其中甲醇水溶液的添加量为:每克刺五加浸膏,加8ml甲醇水溶液;充分搅拌5min后,冷却至10℃,放置20min后,重力沉降,固液分层,分别收集上清液和渣;
S6.60℃下,减压浓缩步骤S5所得上清液至晶体析出;蒸出的甲醇回收利用;
S7.70℃下,以95%的乙醇水溶液搅拌溶解步骤S6所得的晶体,其中乙醇水溶液添加量为:每克晶体添加10ml乙醇水溶液;放置24h后,晶体结晶析出,收集晶体并干燥即得刺五加甙B;
S8.50℃下,向步骤S5所得的渣中,加入浓度为95%的乙醇水溶液,其中乙醇水溶液添加量为:每克渣添加8ml乙醇水溶液;充分搅拌后,放置冷却结晶,结晶物干燥即得刺五加甙E。
实施例3
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体包括以下步骤:
S1.向100g刺五加根茎粉中,添加1200ml体积浓度为50%的乙醇水溶液;并于70℃下,对刺五加根茎粉进行2次回流提取,每次提取时间为1h;收集所有提取液;
S2.将步骤S1所得提取液减压浓缩至无醇味后,静置冷却至15℃,重力沉降,固液分层,取上清液备用;蒸出的乙醇回收利用;
S3.将步骤S3所得上清液上D101大孔非极性树脂后,依次用3BV的纯水,和4BV体积浓度为50%乙醇水溶液进行洗脱,弃去水洗脱液,收集乙醇水洗脱液,刺五加总甙含量为75.16%;
S4.减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液,得密度为1.25g/cm3的刺五加浸膏;
S5.在步骤S5所得的刺五加浸膏中,加入体积浓度为90%的甲醇水溶液,其中甲醇水溶液的添加量为:每克刺五加浸膏,加9ml甲醇水溶液;充分搅拌10min后,冷却至20℃,放置20min后,重力沉降,固液分层,分别收集上清液和渣;
S6.60℃下,减压浓缩步骤S5所得上清液至晶体析出;蒸出的甲醇回收利用;
S7.70℃下,以95%的乙醇水溶液搅拌溶解步骤S6所得的晶体,其中乙醇水溶液添加量为:每克晶体添加10ml乙醇水溶液;放置24h后,晶体结晶析出,收集晶体并干燥即得刺五加甙B;
S8.60℃下,向步骤S5所得的渣中,加入浓度为95%的乙醇水溶液,其中乙醇水溶液添加量为:每克渣添加8ml乙醇水溶液;充分搅拌后,放置冷却结晶,结晶物干燥即得刺五加甙E。
本例所得刺五加甙E的高效液相色谱图如图3所示,刺五加甙B的高效液相色谱图如图4所示。
实施例4
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体包括以下步骤:
S1.向100g刺五加根茎粉中,添加1200ml体积浓度为90%的乙醇水溶液;并于85℃下,对刺五加根茎粉进行3次回流提取,每次提取时间为2h;收集所有提取液;
S2.将步骤S1所得提取液减压浓缩至无醇味后,静置冷却至20℃,离心,固液离,取上清液备用;蒸出的乙醇回收利用;
S3.将步骤S3所得上清液上D101大孔非极性树脂后,依次用2BV的纯水,和4BV体积浓度为70%乙醇水溶液进行洗脱,弃去水洗脱液,收集乙醇水洗脱液,刺五加总甙含量为74.89%;
S4.减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液,得密度为1.25g/cm3的刺五加浸膏;
S5.在步骤S5所得的刺五加浸膏中,加入体积浓度为100%的甲醇水溶液,其中甲醇水溶液的添加量为:每克刺五加浸膏,加5ml甲醇水溶液;充分搅拌10min后,冷却至4℃,放置30min后,重力沉降,固液分层,分别收集上清液和渣;
S6.60℃下,减压浓缩步骤S5所得上清液至晶体析出;蒸出的甲醇回收利用;
S7.70℃下,以95%的乙醇水溶液搅拌溶解步骤S6所得的晶体,其中乙醇水溶液添加量为:每克晶体添加8ml乙醇水溶液;放置17h后,晶体结晶析出,收集晶体并干燥即得刺五加甙B;
S8.60℃下,向步骤S5所得的渣中,加入浓度为95%的乙醇水溶液,其中乙醇水溶液添加量为:每克渣添加8ml乙醇水溶液;充分搅拌后,放置冷却结晶,结晶物干燥即得刺五加甙E。
对比例1
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体步骤与实施例4的区别为:
步骤S4中,减压浓缩步骤S3所得乙醇水洗脱液,得密度为1.01g/cm3的刺五加浸膏。
对比例2
本例提供一种同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,具体步骤与实施例4的区别为:
步骤S5:在步骤S4所得的刺五加浸膏中,加入体积浓度为40%的甲醇水溶液,其中甲醇水溶液的添加量为:每克刺五加浸膏,加8ml甲醇水溶液。
检测例
本例提供实施例1~4以及对比例1~2所得刺五加甙B和刺五加甙E的表征。
其中刺五加甙B和刺五加甙E的结构式如图2所示。
采用2020版的《中国药典刺五加浸膏含量检测》所提供的方法,检测实施例1~4以及对比例1~2所得刺五加甙B和刺五加甙E的纯度。
依据式(1)所示公式计算,实施例1~4以及对比例1~2所得刺五加甙B和刺五加甙E的收率。
其中m(实收甙)为经步骤S1~S8分离提纯后,获取的刺五加甙B或刺五加甙E的质量与相应纯度的乘积;
m(根茎粉)为试验所用根茎粉的质量;
wt%为原料根茎粉中,对应的刺五加甙B或刺五加甙E的质量含量百分数。
测试结果如表1所示。
表1实施例1~4以及对比例1~2所得刺五加甙B和刺五加甙E的测试结果。
由实施例1~4步骤S3可知,经大孔非极性树脂纯化后,得到的乙醇水洗脱液中,刺五加总甙含量>74.87%,说明大孔非极性树脂纯化步骤,可有效去除刺五加洗脱液中的水溶性杂质,提升刺五加甙B和刺五加甙E的纯度。
根据表1所示结果可知:(1)本发明提供的加醇溶液分离的方法,可有效分离刺五加甙B和刺五加甙E,其中刺五加甙B的纯度高达98.24%;刺五加甙E的纯度高达96.12%;(2)若刺五加浸膏的密度不在本发明提供的范围内(对比例1),则会影响刺五加甙B和刺五加甙E加醇分离的效果;(3)若醇溶液的浓度不在本发明提供的范围内(对比例2),同样会影响刺五加甙B和刺五加甙E加醇分离的效果。
综上,本发明提供的,同时分离提取刺五加甙B和刺五加甙E的方法,在保证收率的前提下,可将两者有效分离;其中刺五加甙B的收率高达92.7%,纯度高达98.24%;刺五加甙E的收率高达92.26%,纯度高达96.12%。
上面结合实施例对本发明作了详细说明,但是本发明不限于上述实施例,在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
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