Ox40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用
阅读说明：本技术 Ox40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用 (OX40 antibody, encoding gene thereof, preparation method of antibody and application of antibody in enhancing human immune function ) 是由 刘明录 王立新 韩庆梅 刘敏 万磊 张传鹏 强邦明 金海锋 韩国英 于 2020-08-20 设计创作，主要内容包括：OX40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用,该抗体包含VH域,该VH域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19中的任一个；还包含VL域,该VL域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20中的任一个。OX40即可增加人体免疫功能,又可以解除免疫抑制功能,从而提高制剂的增强人体免疫功能的效果。(OX40 antibody, its coding gene, a preparation method of the antibody and application of the antibody in enhancing human immunity function, wherein the antibody comprises a VH domain, and the VH domain comprises any one of SEQ ID NO.11, SEQ ID NO.13, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO.17 and SEQ ID NO.19 of amino acid sequence; also comprises a VL domain comprising any of SEQ ID No.12, SEQ ID No.14, SEQ ID No.16, SEQ ID No.18, SEQ ID No.20 of the amino acid sequence. OX40 can increase human body immunity and relieve immunosuppression, thereby improving the effect of the preparation in enhancing human body immunity.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种OX40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)。处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。提高免疫力是人体识别和排除“异己”的生理反应。人体内执行这一功能的是免疫系统。免疫系统中起主要作用的是T细胞。
T细胞中起杀伤作用的是CD4+和CD8+T细胞，当人体遭遇抗原攻击时，一部分原始的CD4+T细胞在T细胞应答过程中形成Treg1型细胞。Treg1型细胞在外围耐受性方面起着至关重要的作用。它在对于炎症免疫反应中限制宿主的组织损伤尤其重要。在肿瘤微环境中，Treg 1型细胞具有重要的免疫功能，可以让肿瘤细胞逃避免疫攻击。Treg1型细胞拥有抑制自身免疫病发展的能力，并且可以限制对微生物病原体的免答疫应的强弱。为了提高自身的免疫功能，需要减少Treg1型细胞的产生。
研究发现，在Treg 1型细胞上存在OX40受体，OX40受体的激活阻断原始或记忆CD4+T细胞产生Treg1型细胞，同时阻断Treg1型细胞产生IL-10和Treg1型细胞的免疫抑制功能。
OX40，又称CD134、TNFRSF4，是肿瘤坏死因子超家族的一员。OX40的配体，即OX40L，是TNF家族的成员，主要在活化的抗原呈递细胞上表达，包括B细胞、巨噬细胞、内皮细胞和DC细胞。OX40是一个受膜约束的受体，它不在休眠的T细胞上表达，但在活化的T细胞上瞬时表达。OX40是一个主要的协同刺激受体，它和CD28共同刺激会促进T细胞增殖。OX40刺激活化的T细胞会导致细胞因子的产生并促进CD4+和CD8+T细胞的增殖，同时OX40的共刺激会延长T细胞生存，并通过抑制效应T细胞的死亡增加记忆T细胞的数量。
OX40蛋白主要存在于暴露抗原的记忆T细胞上。当OX40抗体与OX40蛋白受体结合时，它会触发一个共刺激信号，可以增加T细胞和炎症性细胞因子的产生。OX40抗体激活OX40受体，就可以阻止Treg1型细胞和FOXp3+Treg细胞的形成，也可以阻止IL-10的产生，同时阻止它们的免疫抑制功能。这种机制被认为可以激活休眠的免疫系统，这可能有助于对抗癌细胞，提高自身的免疫功能。目前，虽然有关于OX40方面的专利，但是这些现有专利是针对单克隆抗体，而通过杂交瘤细胞获得的抗体带有鼠源性，对人体的免疫功能增强效果并不理想。
因此，开发一种新OX40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供OX40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用，以提高制剂的增强人体免疫功能的效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了OX40抗体，该抗体包含VH域，该VH域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19中的任一个；
还包含VL域，该VL域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20中的任一个。
在本发明中，作为一种改进，所述抗体是人源化OX40抗体。
在本发明中，作为一种改进，该抗体的VH域、VL域的氨基酸序列组合优选为以下任意一种：
OX40-1的VH区为SEQ ID NO.11，VL区为SEQ ID NO.12；或
OX40-2的VH区为SEQ ID NO.13，VL区为SEQ ID NO.14；或
OX40-3的VH区为SEQ ID NO.15，VL区为SEQ ID NO.16；或
OX40-4的VH区为SEQ ID NO.17，VL区为SEQ ID NO.18；或
OX40-5的VH区为SEQ ID NO.19，VL区为SEQ ID NO.20。
OX40-1、OX40-2等后面的数字，为方便区分而自行标注的编号，无实际的含义。
第二方面，本发明提供了编码基因，包含编码如上所述的OX40抗体的核苷酸序列。
在本发明中，作为一种改进，所述编码基因用以编码VH域的核酸序列为SEQ IDNO.1、3、5、7、9中的任一个；用以编码VL域的核酸序列为SEQ ID NO.2、4、6、8、10中的任一个。
在本发明中，作为一种改进，所述编码基因优选的组合为：
编码OX40-1 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.1，VL区为SEQ ID NO.2；或
编码OX40-2 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.3，VL区为SEQ ID NO.4；或
编码OX40-3 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.5，VL区为SEQ ID NO.6；或
编码OX40-4 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.7，VL区为SEQ ID NO.8；或
编码OX40-5 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.9，VL区为SEQ ID NO.10。
第三方面，本发明提供了抗体的制备方法，包括如下步骤：
分别将编码VH域的核酸序列、编码VL域的核酸序列人工合成，双酶切，编码VH域的核酸序列连接到经双酶切后的pAZ-V5-hCH-IgG1载体上，编码VL域的核酸序列连接到经双酶切后的pAZ-V5-hCL-IgGκ载体上，获得重链和轻链的重组表达载体；然后转染到HEK293T细胞，培养得到的上清液中即可得到所述抗体。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗体的制备方法还包括纯化步骤：
将细胞培养上清液与结合缓冲液1:1混合，过滤；用5-10倍体积的结合缓冲液过ProteinA柱；将准备好的上清样品上样；用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白；用洗脱液过柱，同时收集漏出液，直至漏出液中不含蛋白；收集各收集管中的蛋白，合并蛋白管；PBS透析收集的抗体。
第四方面，本发明提供了OX40抗体在增强人体免疫功能中的应用，是指OX40抗体在制备增强人体免疫功能的药物中能够得到有效应用。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述药物包括试剂盒，该试剂盒包括：
(1)OX40抗体；
(2)抗体稀释液。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明中所述的增强人体免疫功能的制剂，制剂中包含OX40抗体，OX40抗体与OX40蛋白受体结合时，它会触发一个共刺激信号，可以增加T细胞的产生。OX40抗体激活OX40受体，就可以阻止Treg1型细胞和FOXp3+Treg细胞的形成，也可以阻止IL-10的产生，同时阻止它们的免疫抑制功能。OX40即可增加人体免疫功能，又可以解除免疫抑制功能。
附图说明
图1为本发明所述的OX40-VH-1DNA片段(右)和OX40-VL-1DNA(左)片段电泳图。
图2为本发明所述的重组表达载体pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ的示意图。
图3为本发明中用于转染的HEK293T细胞。
图4为本发明中分离培养的PBMC细胞。
图5为本发明所述的流式细胞术检测未添加(上图)/添加(下图)OX40抗体时CD8+T细胞的数量。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
OX40抗体实施例
OX40抗体包含VH域，该VH域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.13、SEQID NO.15、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19中的任一个；还包含VL域，该VL域包含氨基酸序列的SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20中的任一个。其中，所述抗体是人源化OX40抗体。
本实施例以VH域氨基酸序列的SEQ ID NO.11、VL域氨基酸序列的SEQ ID NO.12的抗体OX40-1为例进行描述。
当采用OX40-2、OX40-3、OX40-4、OX40-5、中其他的任一个时，其制备方法、及其他技术参数基本相同，在此不做过多赘述。
实施例2
编码基因，包含编码如上所述的OX40抗体的核苷酸序列。相应的，编码基因用以编码VH域的核酸序列为SEQ ID NO.1、3、5、7、9中的任一个；用以编码VL域的核酸序列为SEQID NO.2、4、6、8、10中的任一个。
本实施例选择编码实施例1所述OX40抗体的编码基因作为具体实施例进行描述，该编码基因中，编码OX40-1 VH区的核酸序列为SEQ ID NO.1，VL区为SEQ ID NO.2。
抗体的制备方法，包括如下步骤：分别将编码VH域的核酸序列、编码VL域的核酸序列人工合成，双酶切，编码VH域的核酸序列连接到经双酶切后的pAZ-V5-hCH-IgG1载体上，编码VL域的核酸序列连接到经双酶切后的pAZ-V5-hCL-IgGκ载体上，获得重链和轻链的重组表达载体；然后转染到HEK293T细胞，培养得到的上清液中即可得到所述抗体。
本发明以如下几个实施例进行详细的描述。
实施例3
pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ表达载体的构建
OX40-VH-1和OX40-VL-1基因的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别将OX40-VH-1和OX40-VL-1区合成人工序列，插入到克隆载体pUC57上得到pUC-OX40-VH-1和pUC-OX40-VL-1；
(2)将pUC-OX40-VH-1和pUC-OX40-VL-1进行双酶切，利用琼胶电泳将含有OX40-VH-1和OX40-VL-1DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的OX40-VH-1和OX40-VL-1DNA片段，即本发明所述的OX40抗体的重链可变区和轻链可变区。
更详细的来讲，本实施例提供的pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ表达载体制备方法，包括如下步骤：
分别将OX40-VH-1和OX40-VL-1区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成并插入克隆载体pUC57上，因此命名为pUC-OX40-VH-1和pUC-OX40-VL-1。
将pUC-OX40-VH-1和pUC-OX40-VL-1进行Fast Digest BamHI(购自NEB公司)和Fast Digest XbaI(购自NEB公司)双酶切，37℃，酶切4h。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；BamHI酶：3μl；XbaI酶：3μl；去离子水补足体积。
利用琼胶电泳将把含有OX40-VH-1和OX40-VL-1DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，12000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的OX40-VH-1和OX40-VL-1DNA片段(见图1)。
同时将pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ两个载体(见图2)进行Fast DigestBamHI(购自NEB公司)和Fast Digest XbaI(购自NEB公司)双酶切，37℃，酶切4h。按照同样的方法进行切胶回收，获得线性化的pAZ-V5-hCH-IgG1和pAZ-V5-hCL-IgGκ载体。
将纯化后的OX40-VH-1DNA片段和pAZ-V5-hCH-IgG1线性化载体在16℃进行过夜连接形成pAZ-hCH-VH-1质粒，同时连接OX40-VL-1和pAZ-V5-hCL-IgGκ形成pAZ-hCL-VL-1质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；OX40-VH-1DNA：4μl；线性化的pAZ-V5-hCH-IgG1：4μl，轻链连接体系相同。
实施例4
pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1两种质粒的纯化实施例。
将上述pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1两种质粒转化到E.coli(TOP10)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42℃热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1两种质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl BufferHBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl WashBuffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心2min，收集质粒DNA。
将上述的pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1两种质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例5
pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1两种质粒共转染HEK293T细胞实施例。
从液氮罐中取出冻存的HEK293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50mL离心管中，并在其中加上5mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，1500rpm，5min。去掉上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后，转入六孔板中，每个孔中补足到3mL培养基。将六孔板平稳放入37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，细胞状态良好时用于实验(见图3)。
转染前一天,将形态良好、生长旺盛处于对数生长期的HEK293T细胞用胰蛋白酶消化后稀释至4×105/mL的密度，接入6孔细胞培养板,轻微振荡使细胞均匀铺在细胞板孔内，每孔2mL，用DMEM高糖培养基培养和传代细胞。平放在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养,待细胞长至80-90％汇合度时,可以开始转染操作。
pAZ-hCH-VH-1和pAZ-hCL-VL-1质粒各取3ug，加入200ul Optipro SFM，混匀后加入8ul转染试剂，再次混匀后室温孵育20min。将DNA-转染试剂复合物滴加至6孔板中，轻轻混匀，37℃培养箱培养48h。收取上清，上清中含有OX40抗体。验证正确后经抗生素筛选获得稳定表达抗体的细胞系，并扩大培养。
实施例6
重组抗体的纯化实施例。
抗体采用ProteinA柱子进行纯化。具体步骤如下：(1)样品准备：将细胞上清与结合缓冲液1:1混合，过滤(防止堵塞柱子)。(2)平衡柱子：用5-10倍体积的结合缓冲液过ProteinA柱。(3)上样：将准备好的上清样品上样，根据柱子的结合能力考虑上样量的体积。(4)洗脱杂蛋白：用结合缓冲液冲洗柱子，直至结合液中不含蛋白。(5)收集抗体：用洗脱液过柱，同时收集漏出液，直至漏出液中不含蛋白。测定各收集管中的蛋白含量，合并蛋白管。(6)PBS透析收集的抗体。
实施例7
PBMC细胞的制备实施例。
取100ml健康捐赠者的新鲜外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞PBMC方法如下：
(1)将外周血100ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心900g/min，25min。此时离心管中自上而下形成4层；血浆、由PBMC构成的白膜层、淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
(2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出PBMC。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、1500rpm/min，5min，离心后弃去上清，收集PBMC细胞，进行培养(见图4)。
实施例8
OX40抗体可促进T细胞的增殖，并抑制IL-10的产生实施例。
将收集到的PBMC平均分成两份进行培养，在其中一份中加入OX40抗体，另一份正常培养，培养15天后，用流式细胞仪检测CD8+T细胞的含量(见图5),加入OX40抗体进行培养的PBMC细胞中CD8+T细胞含量为27.4％，未添加OX40抗体的PBMC细胞中CD3+CD8+T细胞含量为6.3％，说明OX40抗体可促进CD8+T细胞的增殖。同时用ELISA方法检测IL-10的浓度，结果显示，加入OX40抗体后的T细胞中IL-10的浓度远低于不加OX40抗体的T细胞，说明OX40抗体可抑制IL-10的分泌。
实施例9
制备增强人体免疫功能的制剂
(1)OX40抗体；
(2)抗体稀释液；
(3)使用说明书。
其中使用说明书包括如实施例7、8所述的步骤。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> OX40抗体、其编码基因、及抗体的制备方法和在增强人体免疫功能中的应用
<130> 2018
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 366
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 1
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gcagatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaca cctctgtcag cactgcctat 240
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tatgattacg tctcttacta tgctatggac tactggggtc agggaaccac ggtcaccgtc 360
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<211> 372
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 9
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcaacccta gtggtggtag cacaagctac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accactgaca cgtccacgag cacagcttac 240
atggagctga gaagcctgag atctgatgac acggccgtgt attactgtgc tagagatcct 300
tattctagta gttggtatgg agctgaatac tttcaacatt ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcat ca 372
<210> 10
<211> 333
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 10
cagtctgttc tgactcagcc tagatccgtg tctgggtctc ctggacagtc ggttaccatc 60
tcctgcactg gaaccagcag tgacggaggt gattataact atgtctcctg gtaccaacag 120
cacccaggcc aagcccccaa actccttatt tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt 180
tctaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240
caggctgagg acgaggctga ttattactgc agctcatata caagcagcag cactctcgtg 300
gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
<210> 11
<211> 122
<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 11
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
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Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
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Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Glu Phe Pro Ser His
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Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Asn Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
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Glu Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 14
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
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Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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<213> 人种(Homo sapiens)
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Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
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Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 人种(Homo sapiens)
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<400> 19
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<400> 20
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100 105 110
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