阅读说明：本技术 一种降低1,3-丙二醇生产过程中副产物的方法 (Method for reducing by-products in 1, 3-propylene glycol production process ) 是由 宫衡 魏仁全 董纾帆 傅水林 于 2020-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种降低1,3－丙二醇生产过程中副产物的方法,也即,将克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)中σ因子RpoS的编码基因敲除,从而降低了1,3－丙二醇生产过程中副产物的形成。相较于其他方法,本发明的优点是：不但彻底阻断了副产物2,3－丁二醇的形成,而且也显著降低了副产物有机酸的形成。因而,采用本发明的方法,极大地降低了1,3－丙二醇发酵过程中副产物的产生。(The invention discloses a method for reducing byproducts in the production process of 1, 3-propylene glycol, namely, knocking out the coding gene of a sigma factor Rpos in Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae), thereby reducing the formation of byproducts in the production process of 1, 3-propylene glycol. Compared with other methods, the method has the advantages that: not only completely blocks the formation of the byproduct 2, 3-butanediol, but also remarkably reduces the formation of the byproduct organic acid. Thus, the method of the invention greatly reduces the production of byproducts in the fermentation process of the 1, 3-propanediol.)

一种降低1,3-丙二醇生产过程中副产物的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中σ因子RpoS的编码基因，从而降低了1，3-丙二醇生产过程中副产物的形成。

背景技术

1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，应用广泛。例如，1，3-丙二醇可作为单体合成新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(PTT)，PTT一种性能特别优异的聚酯材料。自然界中能生产1，3-丙二醇的微生物大致包括：克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiela pneumoniae)、弗氏柠檬菌(Citrobacter freundi)、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridia butyricum)等等，其中克K.pneumoniae生产性能最好。

但是研究发现K.pneumoniae生产1，3-丙二醇时，还会产生大量副产物，其中最主要的是2，3-丁二醇，此外还有有机酸。2，3-丁二醇的沸点和1，3-丙二醇相近，2，3-丁二醇的存在大大增加了后续精馏精制1，3-丙二醇的成本；此外有机酸也是影响后续1，3-丙二醇分离过程中的主要杂质。因此上述这些副产物的存在，不但增加了原料消耗，而且也导致了后续产品分离纯化的困难。

目前虽然有多种“敲除特定副产物生物合成代谢途径”研究报道，但是降低副产物的效果不太理想。比如，敲除K.pneumoniae的2，3-丁二醇的生物合成途径，虽然可以阻断2，3-丁二醇的产生，但是会严重抑制菌体的生长。再比如，研究表明大部分有机酸(乙酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和3-羟基丙酸等)通过敲除已知的生物合成途径很难降低其分泌，这主要是因为机酸生物合成代谢途径的更为错综复杂。因而迫切需要新的措施来有效控制 1，3-丙二醇发酵过程中副产物的形成。

本发明公开了一种方法，即敲除K.pneumoniae菌中一种全局调控σ因子RpoS的编码基因rpoS，该基因的敲除不但能彻底阻断副产物2,3-丁二醇的形成，也能够有效降低副产物有机酸的形成。经过检索国家知识产权局 (www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局 (www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。

发明内容

σ因子是细菌RNA聚合酶(RNAP)的亚基，在转录起始中起关键作用，是全局调控因子。RpoS是σ因子里的一种，一般认为RpoS在细菌生长稳定期起作用，在K.pneumoniae菌中RpoS常被当作应激因子。但是，本申请的发明人在研究中发现，敲除K.pneumoniae菌中编码RpoS的基因rpoS后极大的降低了1,3-丙二醇发酵副产物生成，表现为：1)副产物2,3-丁二醇的生成完全被阻断；2)副产物有机酸的形成也显著降低。与现有的技术相比，利用本发明生产1，3-丙二醇时，可以显著降低副产物的形成。

本发明是通过以下技术方案实现的：将K.pneumoniae菌中的基因rpoS 敲除，降低了1，3-丙二醇发酵的副产物形成。

根据本发明，所述基因rpoS负责RNA聚合酶的σ亚基RpoS；

根据本发明，所述的副产物为2，3-丁二醇和有机酸；

根据本发明，所述的有机酸具体为：乙酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和3- 羟基丙酸。

根据本发明，用于生产1，3-丙二醇的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(K. pneumoniae)。相比现有生产1，3-丙二醇的方法，本发明的方法的优点是彻底去处副产物2，3-丁二醇的同时，也能显著降低副产物有机酸的形成。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。

实例中，斜面培养基的配方如下：

K₂HPO₄ 3H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0，琼脂2g/L。

种子培养基的配方如下：

K₂HPO₄ 3H₂O 7g/L，(NH₄)₂SO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgCl₂ 7H₂O 0.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0后加入NaCl调节渗透压。

发酵罐培养基的配方如下：

KC l 0.75g/L，NaH₂PO₄ 1.38g/L，(NH₄)₂SO₄ 5.35g/L，Na₂SO₄ 0.28 g/L，MgSO₄6H₂O 0.26g/L，柠檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，调整pH 7.0。

微量元素的配方如下：

ZnCl₂ 34.2g/L，FeCl₃6H₂O 2.7g/L，MnCl₂4H₂O 10g/L，CuCl₂2H₂O 0.85g/L，CoCl₂2H₂O 23.8g/L，H₃BO₃ 0.31g/L，Na₂MoO₄ 0.25g/L

实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法如下：

取1.0mL发酵液稀释7～10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取OD。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10mL，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与OD₆₂₀的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的OD₆₂₀值由标准曲线回归关系式计算得出。发酵液中1，3-丙二醇的测定采用气相色谱法，有机酸的测定采用液相色谱法。产1，3-丙二醇的菌株采用K.pneumoniae菌CCTCC M2014574，以下简称M2014574。

实施例1、敲除rpoS基因后彻底阻断了副产物2，3-丁二醇的形成

将M2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％ NaCl，pH 7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH 78578的基因组序列 (LOCUS：NC＿009648)上的ropS基因(locus＿tag：KNP＿RS16625)设计引物， PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH 78578上ropS基因的相似度为100％。然后用同源重组办法，敲除M2014574基因组的ropS基因(993bp)，获得的重组菌为M2014574△ropS。

将M2014574与M2014574△ropS分别接种于250ml的三角瓶中37℃培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的含量，结果如表1所示。从表1中可以看出，敲除rpoS后的突变株菌体生长和1，3-丙二醇的产量只是略有下降，但是副产物2，3-丁二醇的合成被完全阻断了。

表1：敲除ropS后阻断了副产物2，3-丁二醇的合成

实施例2、敲除rpoS基因后显著降低了有机酸的形成

将M2014574菌株于LB培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％ NaCl，pH 7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的M2014574基因组为模板，依据NCBI登录的克雷伯氏肺炎杆菌MGH 78578的基因组序列 (LOCUS：NC＿009648)上的ropS基因(locus＿tag：KNP＿RS16625)设计引物， PCR反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与MGH 78578上ropS基因的相似度为100％。然后用同源重组办法，敲除M2014574基因组的ropS基因(993bp)，获得的重组菌为M2014574△ropS。

将M2014574与M2014574△ropS分别接种于250ml的三角瓶中37℃培养12小时，培养基为种子培养基添加40g/L甘油。培养12小时后，测定发酵液中的菌体浓度、1，3-丙二醇和有机酸的含量，结果如表2所示。从表 1中可以看出，敲除rpoS后的突变株菌体生长和1，3-丙二醇的产量只是略有下降，但是副产物有机酸(乙酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和3-羟基丙酸)普遍减少，4种副产物有机酸合计从7.23g/L降低到5.21g/L，有机酸合计减少了 30％。所以敲除ropS基因基因后对1，3-丙二醇发酵副产物有机酸的降低效果显著。

表2：敲除ropS后显著降低了副产物有机酸的形成