高效液相色谱用多肽超分子手性填料及制备方法与应用
阅读说明：本技术 高效液相色谱用多肽超分子手性填料及制备方法与应用 (Polypeptide supermolecule chiral filler for high performance liquid chromatography, preparation method and application ) 是由 王跃飞 齐崴 范玉琪 苏荣欣 于 2020-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明公开了高效液相色谱用多肽超分子手性填料及制备方法与应用,制备方法为：(1)合成<Sub>L</Sub>-Phe-<Sub>L</Sub>-Phe-<Sub>L</Sub>-Lys,在其N-端接枝具有π-π堆积效应的9-芴基甲氧基羰基作为保护基团；(2)取步骤1)获得的产物,加入超纯水中,搅拌分散均匀,调节pH,静置反应至少24h,离心去除上清,得到多肽组装体,即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料。本发明以对多肽分子进行理性设计,设计合成了数种多肽衍生物,继而通过自组装方法合成得到多肽组装体,即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料,本发明的填料对手性化合物有良好的拆分效果,可以实现手性化合物,特别是手性药物的高效快速分离。(The invention discloses a polypeptide supermolecule chiral filler for high performance liquid chromatography, a preparation method and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) synthesis of L ‑Phe‑ L ‑Phe‑ L -Lys, to whose N-terminus 9-fluorenylmethoxycarbonyl group having a pi-pi stacking effect is grafted as a protecting group; (2) adding the product obtained in the step 1) into ultrapure water, uniformly stirring and dispersing, adjusting pH, standing for at least 24h, centrifuging to remove supernatant, and thus obtaining a polypeptide assembly, namely the polypeptide supramolecular chiral filler for the high performance liquid chromatography. The invention designs and synthesizes a plurality of polypeptide derivatives by rational design of polypeptide molecules, and then synthesizes a polypeptide assembly by a self-assembly method, namely the polypeptide supermolecule chiral filler for the high performance liquid chromatography.)
技术领域
本发明属于高效液相色谱手性填充材料及其制备技术领域，具体涉及高效液相色谱用多肽超分子手性填料及制备方法与应用。
背景技术
近年来，手性药物一直是医药行业的前沿领域。自然界里有很多手性化合物，这些手性化合物具有两个对映异构体。当一个手性化合物进入生命体时，它的两个对映异构体通常会表现出不同的生物活性。对于手性药物，一个异构体可能是有效的，而另一个异构体可能是无效甚至是有害的。因而建立起快速高效的手性分离方法，对药代动力学研究和手性药物产品质量具有重要意义。目前，高效液相色谱法(HPLC)在手性药物拆分中的应用是最广泛的,是药物质量控制、立体选择性的药理学和毒理学研究的重要手段。高效液相色谱法手性拆分依据其原理可分为手性衍生法、手性流动相法和手性固定相法。其中手性固定相法(CSP)需要手性固定相的填充材料，手性固定相法直接对手性对映体进行拆分，其中被分离的对映体与手性固定相之间由于能量差异形成暂时的非对映异构体复合物。手性固定相法具有较高的手性拆分能力和良好的耐用性,可对较多药物对映体进行快速、高效的分离，具有广泛的应用前景。当前常用作手性固定相的填充材料包括多糖类衍生物、大环抗生素类、分子印迹聚合物、环糊精类、蛋白质等。但目前尚未有采用多肽超分子组装体作为手性填料的报道。多肽超分子自组装是多肽通过自上而下的短肽自组装途径，形成微观结构高度有序的超分子手性纳米结构的过程。由于多肽超分子纳米结构的内在手性以及众多结合位点的存在，与不同的手性药物的结合能力的差异，从而具有高效、快速分离手性药物的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离效率高、应用潜力大的高效液相色谱用多肽超分子手性填料。
本发明的第二个目的是提供高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法。
本发明的第二个目的是提供高效液相色谱用多肽超分子手性填料的应用。
本发明的技术方案如下：
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-Lys，在L-Phe-L-Phe-L-Lys的N-端接枝具有π-π堆积效应的9-芴基甲氧基羰基作为保护基团；
(2)按比例，取2-10mmol步骤1)获得的产物，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至3-12.6，在20-35℃下静置反应至少24h，离心去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料。
还可以在L-Phe-L-Phe-L-Lys的C端还连接有L-Lys或L-Asp。
上述制备方法制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料。
所述手性填料的微观结构为纳米球、纳米带、纳米纤维或纳米片。
上述高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用。
本发明的优点：
本发明以对多肽分子进行理性设计，设计合成了数种多肽衍生物，继而通过自组装方法合成得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料，本发明的填料对手性化合物有良好的拆分效果，可以实现手性化合物，特别是手性药物的高效快速分离。
附图说明
图1为实施例1制备的多肽超分子组装体的扫描电子显微镜(SEM)图。
图2为实施例1制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-α-甲基苄胺拆分的液相色谱图。
图3为实施例3制备的多肽超分子组装体的SEM图。
图4为实施例3制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-2-苯基丙酸拆分的液相色谱图。
图5为实施例5制备的多肽超分子组装体的SEM图。
图6为实施例5制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-1-苯基乙醇拆分的液相色谱图。
图7为实施例7制备的多肽超分子组装体的SEM图。
图8为实施例7制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-α-甲基苄胺拆分的液相色谱图。
图9为实施例9制备的多肽超分子组装体的SEM图。
图10为实施例9制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-2-苯基丙酸拆分的液相色谱图。
图11为实施例11制备的多肽超分子组装体的SEM图。
图12为实施例11制备的高效液相色谱用多肽超分子手性填料对R/S-1-苯基乙醇拆分的液相色谱图。
具体实施方式
Fmoc为9-芴基甲氧基羰基的缩写。
Fmoc-L-Phe-L-Phe-L-Lys简写为Fmoc-FFK，结构如式(I)：
Fmoc-L-Phe-L-Phe-L-Lys-L-Lys简写为Fmoc-FFKK，结构如式(II)：
Fmoc-L-Phe-L-Phe-L-Lys-L-Asp简写为Fmoc-FFKD，结构如式(III)：
Fmoc-FFK，Fmoc-FFKK和Fmoc-FFKD是委托GL Biochem Ltd.(Shanghai,China)生产制备。
下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-Lys，在L-Phe-L-Phe-L-Lys的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFK；
(2)取3.314mg(5mmol)步骤(1)获得的产物Fmoc-FFK，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至12.6，在25℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的微观结构为堆积的纳米片结构，见图1。
实施例2
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-α-甲基苄胺(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL，加入实施例1制备获得的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min，见图2。
实施例3
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-Lys L-Lys，在L-Phe-L-Phe-L-Lys L-Lys的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFKK；
(2)取4.045mg(5mmol)步骤(1)获得的产物Fmoc-FFKK，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至12.6，在25℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的结构为长条状纳米带，见图3。
实施例4
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-2-苯基丙酸(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL加入实施例3制备获得的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min，见图4。
实施例5
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-LysL-Asp，在L-Phe-L-Phe-L-Lys L-Asp的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFKD；
(2)取3.980mg(5mmol)步骤(1)获得的产物Fmoc-FFKD，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至12.6，在25℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的微观结构为纳米球，见图5。
实施例6
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-1-苯基乙醇(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL，加入实施例5制备获得的的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min，见图6。
实施例7
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-Lys，在L-Phe-L-Phe-L-Lys的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFK；
(2)取6.628mg(10mmol)步骤(1)获得的产物Fmoc-FFK，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至11，在20℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的微观结构为堆积的纳米片结构，见图7。
实施例8
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-α-甲基苄胺(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL，加入实施例7制备获得的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min。见图8。
实施例9
高效液相色谱用多肽超分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-LysL-Lys，在L-Phe-L-Phe-L-LysL-Lys的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFKK；
(2)取1.618mg(2mmol)步骤(1)获得的产物，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至10，在30℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的微观结构为长条状纳米带，见图9。
实施例10
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-2-苯基丙酸(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL加入实施例9制备获得的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h后，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min，见图10。
实施例11
高效液相色谱用多肽分子手性填料的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成L-Phe-L-Phe-L-LysL-Asp，在L-Phe-L-Phe-L-LysL-Asp的N-端接枝简称为Fmoc的9-芴基甲氧基羰基为保护基团，得到Fmoc-FFKD；
(2)取1.592mg(2mmol)步骤(1)获得的产物Fmoc-FFKD，加入1mL超纯水中，搅拌分散均匀，调节pH至3，在35℃下静置反应24h，8000rpm下离心处理15min，去除上清，得到多肽超分子组装体，即为高效液相色谱用多肽超分子手性填料；该手性填料的微观结构为混合的纳米纤维与无规则块状纳米结构，见图11。
实施例12
高效液相色谱用多肽超分子手性填料在拆分外消旋手性化合物混合物的应用
以色谱纯的正己烷为溶剂，配置浓度为5mM R/S-1-苯基乙醇(外消旋手性药物)混合溶液，取1mL，加入实施例11制备获得的的全部高效液相色谱用多肽超分子手性填料中，培育24h，取出200μL正己烷层，用0.45mm的有机微孔滤膜过滤得滤液，在254nm下的紫外检测，利用HPLC检测溶液反应后的手性药物相对含量，流动相为正己烷：异丙醇(v/v)＝7:3，流速为0.5ml/min，见图12。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。