阅读说明：本技术 一种筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法 (Method for screening strain for anaerobic synthesis of biosurfactant ) 是由 赵峰 于 2020-06-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法。该方法是以厌氧盒和96孔培养板为培养装置,以厌氧培养液的排油圈直径作为筛选指标。主要步骤：样品预处理,涂布LB琼脂平板、根据菌落形态挑选菌落,接种至96孔培养板、置于厌氧盒中培养,培养液排油圈直径测定,厌氧扩大培养和表面张力测定验证。本发明方法是一种简便、高效、高通量的筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法,为环境样品中生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与研究奠定了方法基础。(The present invention relates to a method for screening strains of anaerobically synthesized biosurfactants. The method takes an anaerobic box and a 96-hole culture plate as a culture device, and takes the diameter of an oil discharge ring of anaerobic culture solution as a screening index. The method mainly comprises the following steps: pretreating a sample, coating an LB agar plate, selecting a bacterial colony according to the bacterial colony morphology, inoculating the bacterial colony to a 96-hole culture plate, placing the culture plate in an anaerobic box for culture, measuring the diameter of an oil discharge ring of a culture solution, performing anaerobic amplification culture and verifying surface tension measurement. The method is a simple, convenient, efficient and high-throughput method for screening the strain of the anaerobic synthetic biosurfactant, and lays a method foundation for the development and research of strain resources of the anaerobic biosurfactant producing strain in an environmental sample.)

一种筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法

技术领域

本发明涉及环境生物技术和微生物资源开发领域，具体为一种用于筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，是一种简便、高效、高通量的筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，为环境样品中生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与研究奠定方法基础。

背景技术

生物表面活性剂主要是由微生物合成的具有表面活性的代谢产物，包括糖脂类、脂肽类等，具有降低表/界面张力、乳化、增溶等功能。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂具有活性高、低毒或无毒、易生物降解、生态友好等优点，在石油开采、环境污染修复、农业、医药、食品等领域具有广阔的应用前景。当前菌种资源开发得到的生物表面活性剂产生菌基本上只能够在有氧条件下合成生物表面活性剂，限制了生物表面活性剂产生菌在某些缺氧环境中的高效应用，如油藏原位产表面活性剂驱油以及河流底泥的污染修复等领域。目前已报道的能够在厌氧条件下合成生物表面活性剂的菌种资源还比较匮乏，可检索到的文献资料不足 10 篇，而筛选到的能够厌氧合成生物表面活性剂的野生型菌则更少。

自然界中存在着丰富的微生物资源，如土壤、油藏、底泥等环境的缺氧特性形成了其独特的微生物类群和丰富物种多样性与代谢功能多样性，为筛选能够厌氧合成生物表面活性剂的微生物菌株提供了可能。然而筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株，采用目前文献报道的方法和已存在的筛选方法，筛选效率低、操作繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，有利于解决现有生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源匮乏，生物表面活性剂厌氧产生菌的筛选操作繁琐、筛选效率低等问题，采用该方法可以简单、高效地筛选获得厌氧合成生物表面活性剂的菌种资源。

本发明所提供的筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌株的方法，以厌氧培养盒和96孔培养板为培养装置，以厌氧培养液的排油圈直径作为筛选指标，具体步骤如下：

1）环境样品预处理后涂布LB琼脂平板，厌氧培养；2）挑取不同形态的单菌落接种至装有液体发酵培养基的96孔培养板中，厌氧培养；3）取厌氧培养液，测定其排油圈直径，4）选取厌氧培养液排油圈直径为10~125mm的菌株，进行厌氧扩大培养和厌氧发酵液的表面张力测定验证。

步骤1）环境样品包括泥样、土样和水样等，其中水样进行普通滤纸过滤除去悬浮物，泥样和土样利用无菌去离子水和玻璃珠制备悬液。在超净工作台中取0.1mL~0.5 mL预处理后的环境样品涂布LB琼脂平板，共涂布3~5个LB琼脂平板，涂布后的LB平板水平放置于厌氧培养盒中，将厌氧培养盒放在恒温培养箱中培养3~6天；培养温度为25℃~45℃。

步骤2）利用无菌牙签从厌氧培养后的LB琼脂平板上挑取若干菌落形态不同的单菌落，分别接种至装有0.08~0.12 mL液体培养基的96孔培养板的小孔中，至少留下两孔不接种作为空白对照，并覆盖上无菌膜；96孔培养板水平放置于厌氧培养盒中，将厌氧培养盒放在恒温培养箱中培养4~8天；培养温度为25℃~45℃。

步骤2）挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落；而相同形态的单菌落中挑取至少一个。

步骤3）取直径90~150mm规格的培养皿放置在毫米网格坐标纸上，培养皿中加入20~50 mL去离子水，中央滴入20~50 μL粘度2~50 mPa·s的石油，待油膜均匀铺开后，利用带有无菌枪头的移液枪或八联排抢分别从96孔培养板的小孔内取10~20μL培养液，滴在油膜上，测量排油圈直径。

步骤4）选取的能够厌氧合成生物表面活性剂的潜在目标菌株，为厌氧培养液排油圈直径为10~125mm的菌株；厌氧管中装有8~18mL的发酵培养基，利用无菌注射器从96孔培养板小孔中取0.05~0.10mL培养液接种到厌氧管中，恒温、80~120rpm，培养8~12天；培养温度为25℃~45℃。取8mL厌氧发酵液在5000~8000 rpm/min条件下离心5~10min，去除菌体，利用表面张力仪测定上清液的表面张力，厌氧发酵液表面张力20~40mN/m的菌株即为能够厌氧合成生物表面活性剂的菌株。

发酵培养基配方为甘油20~40g，KH₂PO₄ 2~4g，NaNO₃ 2~5g，K₂HPO₄ 3~6g， MgSO₄ 0.2~0.8 g，去离子水1L。

本发明进一步公开了用于筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株方法，在厌氧合成生物表面活性剂微生物的菌种资源开发利用方面的应用，实验结果显示：本发明方法能够有效地从含有厌氧合成生物表面活性剂菌株的菌源中筛选出能够厌氧合成生物表面活性剂的微生物菌株，筛选效率高，简便可靠，筛选通量高、速度快，省时省力。

本发明更加详细的描述如下：

LB琼脂培养基：蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂17-20 g，补加去离子水至1L，pH6.5-7.0。

发酵培养基：甘油20~40g，KH₂PO₄ 2~4g，NaNO₃ 2~5g， K₂HPO₄ 3~6g，MgSO₄ 0.2~0.8g，加去离子水至1L，pH 6.5-7.0。

1）环境样品预处理

环境样品可包括泥样、土样和水样等，其中采集的水样利用普通滤纸过滤去除不溶性悬浮物，采集的泥样和土样等称取5~10g至无菌250mL三角瓶中，加入无菌去离子水50~100mL和玻璃小珠10~20颗，在摇床上25℃、160~200rpm，振荡2~4h，制备成悬液。

2）培养基的制备

LB琼脂培养基的制备：用电子天平分别称量10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，18g琼脂粉，加去离子水混匀，定容到1L，调pH至7.0，分装到三角瓶后，于121℃灭菌20min；待培养基冷却至50-60℃后，每个平板中30mL培养基，倾倒平板备用。

发酵培养基的制备：用电子天平分别称量20~40g甘油，2~5g NaNO₃，2~4g KH₂PO₄，3~6g K₂HPO₄，0.2~0.8g MgSO4，在去离子水中混匀后使用容量瓶中定容到1L，分装到三角瓶后，于121℃灭菌20min。对于厌氧管中培养用的发酵培养基，配置好的发酵培养基加热至煮沸，维持15min，在通高纯氮气的条件下，用注射器取8~18ml上述培养基分装到20ml的厌氧管中，于115℃灭菌30min备用。

3）获得单菌落

在超净工作台中，取预处理后的环境样品过滤液或悬液0.1~0.5mL涂布到LB琼脂培养基平板上，共涂布3~5个LB琼脂平板；将LB平板水平放置于厌氧培养盒中，并打开除氧袋；厌氧培养盒放在30℃恒温培养箱中，培养温度为25℃~45℃，培养3~6天。

4）单菌落接种至96孔培养板中厌氧培养

利用无菌牙签挑取LB平板上菌落形态不同的单菌落，分别接种到装有0.08~0.12mL发酵培养基的96孔培养板的小孔中，并设置3个小孔不接种作为空白对照，覆盖上无菌膜；水平放置于厌氧培养盒中，并打开除氧袋；厌氧培养盒放在恒温培养箱中，培养温度为25℃~45℃，培养4~8天。挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落；而相同形态的单菌落中至少挑取一个。

5）厌氧培养液的排油圈直径测定

取直径90mm的培养皿放置在毫米网格坐标纸上，培养皿中加入20~30 mL去离子水，中央滴入20 μL粘度2~50 mPa·s的石油，待油膜均匀铺开在水面上。在超净工作台中，利用带有无菌枪头的移液枪，分别从96孔培养板的小孔内取10μL培养液，滴在油膜上，测量排油圈直径。厌氧培养液的排油圈直径为10~125mm的菌株，即为能够厌氧合成生物表面活性剂的目标菌株。

6）厌氧合成生物表面活性剂菌株的厌氧扩大培养验证

取0.05~0.10mL 的5）中筛选出的目标菌株培养液接种到装有8~18mL发酵培养基的20ml厌氧管中，在培养温度为25℃~45℃，60~120rpm下，培养8~12天。培养结束后，在5000~8000 rpm条件下离心5~10min，去除菌体，上清液利用全自动表面张力仪BZY-1进行表面张力测定，厌氧发酵液表面张力为20~40mN/m的菌株即为能够厌氧合成生物表面活性剂的菌株，验证该高效筛选方法的准确性，并最终获得厌氧合成生物表面活性剂的菌种资源。

本发明主要解决了厌氧合成生物表面活性剂菌种筛选效率低、操作复杂、筛选通量低等问题，重点考察了厌氧培养盒和96孔培养板相结合在筛选厌氧合成生物表面活性剂菌种方面的可行性和实验效果，主要的难点在于尽可能多的挑选LB琼脂平板上的形态不同的单菌落。

本发明公开的筛选厌氧合成生物表面活性剂菌株方法的有益效果在于：

利用该方法筛选能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种，简单实用、筛选效率高；利用该方法可筛选不同类型环境样品中可能存在的能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种资源，为生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与研究奠定方法基础。具体如下：1）利用厌氧发酵液的排油圈直径大于10mm作为生物表面活性剂厌氧产生菌的筛选标准，筛选效率高，简单实用。 2）将厌氧培养盒和96孔培养板相结合加入到菌种筛选过程，简便实现厌氧培养的同时，也提高了筛选通量和速度。

附图说明

图1为厌氧发酵液的排油圈照片。

具体实施方式

结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可从生化试剂材料公司购买到。

实施例1

LB琼脂培养基：蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，琼脂18 g，补加去离子水至1L，pH7.0。

发酵培养基：甘油40g，NaNO₃ 4g，K₂HPO₄ 3.5g，KH₂PO₄ 2.5g，MgSO₄ 0.6 g，加去离子水至1L，pH 7.0。

1）环境样品预处理

环境样品可包括泥样、土样和水样等，其中采集的水样利用普通滤纸过滤去除不溶性悬浮物，采集的泥样和土样等称取10g至无菌250mL三角瓶中，加入无菌去离子水100mL和玻璃小珠15颗，在摇床上25℃、180rpm，振荡3h，制备成悬液。

2）培养基的制备

LB琼脂培养基的制备：用电子天平分别称量10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，18g琼脂粉，加去离子水混匀，定容到1L，调pH至7.0，分装到三角瓶后，于121℃灭菌20min；待培养基冷却至60℃后，每个平板中30mL培养基，倾倒平板备用。

发酵培养基的制备：用电子天平分别称量40g甘油，4.0g NaNO₃，2.5g KH₂PO₄，3.5gK₂HPO₄，0.5g MgSO4，在去离子水中混匀后使用容量瓶中定容到1L，分装到三角瓶后，于121℃灭菌20min。对于厌氧管中培养用的发酵培养基，配置好的发酵培养基加热至煮沸，维持15min，在通高纯氮气的条件下，用注射器取18ml上述培养基分装到20ml的厌氧管中，于115℃灭菌30min备用。

3）获得单菌落

在超净工作台中，取预处理后的环境样品过滤液或悬液0.3mL涂布到LB琼脂培养基平板上，共涂布5个LB琼脂平板；将LB平板水平放置于厌氧培养盒中，并打开除氧袋；厌氧培养盒放在30℃恒温培养箱中培养4天。

4）单菌落接种至96孔培养板中厌氧培养

利用无菌牙签挑取LB平板上菌落形态不同（东秀珠, 蔡妙英等. 2001. 常见细菌系统鉴定手册. 科学出版社. 北京.）的单菌落，分别接种到装有0.1mL发酵培养基的96孔培养板的小孔中，并设置3个小孔不接种作为空白对照，覆盖上无菌膜；水平放置于厌氧培养盒中，并打开除氧袋；厌氧培养盒放在30℃恒温培养箱中培养8天。挑取单菌落时，挑取尽可能多的不同形态的单菌落；而相同形态的单菌落中至少挑取一个。

5）厌氧培养液的排油圈直径测定

取直径90mm的培养皿放置在毫米网格坐标纸上，培养皿中加入30 mL去离子水，中央滴入20 μL粘度20 mPa·s的石油，待油膜均匀铺开在水面上。在超净工作台中，利用带有无菌枪头的移液枪，分别从96孔培养板的小孔内取10μL培养液，滴在油膜上，测量排油圈直径。厌氧培养液的排油圈直径为10~125mm的菌株，即为能够厌氧合成生物表面活性剂的目标菌株。

6）菌株厌氧合成生物表面活性剂的扩大培养验证

取0.05mL 的5）中筛选出的目标菌株培养液接种到装有18mL发酵培养基的20ml厌氧管中，在30℃、80 rpm下，培养12天。培养结束后，在6000 rpm/min条件下离心5min，去除菌体，上清液利用全自动表面张力仪BZY-1进行表面张力测定，厌氧发酵液表面张力为20~40mN/m的菌株即为能够厌氧合成生物表面活性剂的菌株，验证该高效筛选方法的准确性，并最终获得厌氧合成生物表面活性剂的菌种资源。

实施例2

应用本发明方法从某油田油藏采出液中筛选能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种，具体过程如下：

在超净工作台中，取某油田的油藏采出液0.5 ml，涂布到LB琼脂平板上，共涂布5个LB琼脂平板，待LB琼脂平板吸收液体后，放置于厌氧培养盒中，并打开厌氧盒中的除氧袋；厌氧培养盒放在39℃恒温培养箱中培养4天，获得厌氧生长的单菌落。

在超净工作台中，用无菌牙签挑取5个LB平板上的共计93个单菌落，分别接入每孔装有0.1 ml发酵培养基的96孔培养板中，其中A1、D6、H12三个孔为不接菌的对照，并覆盖无菌膜。96孔培养板放置于厌氧培养盒中，并打开厌氧盒中的除氧袋；厌氧培养盒放在39℃恒温培养箱中培养8天，获得每个菌株的厌氧发酵液。

对各个小孔内的厌氧发酵液进行排油圈直径测定，筛选具有厌氧合成生物表面活性剂潜力的菌株，记录下菌株编号，获得了8株具有生物表面活性剂产生潜力的菌株，结果如表1所示，编号分别为A4，A5，B3，B11，C10，E11，G6和H3。

用无菌注射器分别取0.05mL菌株的厌氧发酵液，分别接种到装有18ml发酵培养基的20ml厌氧管中，于39 ℃，80 rpm/min的条件下，培养12天。培养结束后，测定厌氧发酵液的表面张力，进一步验证阳性菌株厌氧合成生物表面活性剂的能力，选取能将厌氧发酵液表面张力降低到20~40mN/m的菌株，即为能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种。为了验证本发明方法的可靠性，结果为阴性的菌株，在此也进行了厌氧扩大培养和厌氧发酵液的表面张力检测，实际应用时可不做此步。各个菌株的厌氧发酵液表面张力值，如表1所示。

实施例2的结果（如表1所示）表明，厌氧发酵液排油圈直径为2~10mm的菌株，经后期厌氧管中扩大培养，其厌氧发酵液的表面张力在45~60 mN/m之间，不接菌的对照发酵液表面张力为62±1 mN/m；而厌氧发酵液排油圈直径为10~25mm的菌株，经后期厌氧管中扩大培养，其厌氧发酵液的表面张力在30~45 mN/m之间；证明了此方法作为生物表面活性剂厌氧产生菌筛选方法的可靠性。在96孔板中，除去A1、D6、H12三个不接菌的对照，对93个菌株通过厌氧发酵液排油圈直径测定，可以排除85个菌株，只需对8个阳性菌株进行下一步的厌氧扩大培养，表面张力测定验证表明，8个阳性菌株中有6株菌的厌氧发酵液表面张力为30~40mN/m，其中有2株菌的厌氧发酵液表面张力为30~35mN/m，菌株编号分别为B11和H3。结果充分显示出了此发明方法作为筛选厌氧合成生物表面活性剂菌种方法的高效性和可靠性。

表1：某油田油藏采出液中厌氧合成生物表面活性剂菌种的筛选结果

实施例3

应用本发明方法从底泥样品中筛选能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种，具体过程如下：

称取10g底泥至250mL三角瓶中，加入无菌去离子水100mL，玻璃小珠10颗，在25℃摇床振荡2h，得到底泥水悬液。

在超净工作台中，取底泥水悬液0.2 ml，涂布到LB琼脂平板上，共涂布5个LB琼脂平板，待LB琼脂平板吸收液体后，放置于厌氧培养盒中，并打开厌氧盒中的除氧袋；厌氧培养盒放在39℃恒温培养箱中培养4天，获得厌氧生长的单菌落。

在超净工作台中，用无菌牙签挑取5个LB平板上的共计93个单菌落，分别接入每孔装有0.1 ml发酵培养基的96孔培养板中，其中A1、D6、H12三个孔为不接菌的对照，并覆盖无菌膜。96孔培养板放置于厌氧培养盒中，并打开厌氧盒中的除氧袋；厌氧培养盒放在39℃恒温培养箱中培养8天，获得每个菌株的厌氧发酵液。

对各个小孔内的厌氧发酵液进行排油圈直径测定，筛选具有厌氧合成生物表面活性剂潜力的菌株，记录下菌株编号，获得了13株具有生物表面活性剂产生潜力的菌株，结果如表2所示，编号分别为A11，B9，C5，C7，D3，D9，D10，E6，F6，F10，G2，G9和H7。

用无菌注射器分别取0.05mL该13个菌株的厌氧发酵液，分别接种到装有18ml发酵培养基的20ml厌氧管中，于39 ℃，80 rpm/min的条件下，培养12天。培养结束后，测定厌氧发酵液的表面张力，选取能将厌氧发酵液表面张力降低到20~40mN/m的菌株，即为能够厌氧合成生物表面活性剂的菌种，13个菌株的厌氧发酵液表面张力值，如表2所示。

实施例3的结果（如表2所示）表明，经涂布LB琼脂平板进行单菌落厌氧分离、96孔板厌氧培养和厌氧发酵液的排油圈直径测定共获得的13株具有厌氧合成生物表面活性剂潜力的菌株；再经厌氧扩大培养和表面张力测定验证，有10株菌的厌氧发酵液表面张力为30~40mN/m，其中获得3株厌氧合成生物表面活性剂潜力较大的菌种，厌氧发酵液排油圈直径为15~25mm、表面张力为30~35mN/m，菌株编号分别为A11，D3和G2。实施例2结果再次证明了此方法作为筛选厌氧合成生物表面活性剂菌种方法的高效性和可靠性。

表2：某底泥样品中厌氧合成生物表面活性剂菌种的筛选结果

本发明方法是一种简便、高效的筛选能够厌氧合成生物表面活性剂菌种的方法，为生物表面活性剂厌氧产生菌的菌种资源开发与应用研究奠定了方法学基础。