具体实施方式

应当理解，本文显示和描述的特定实施方式是实例并且不旨在以任何方式另外限制本申请的范围。

本文提及的已公开专利、专利申请、网站、公司名称和科学文献特此通过引用以其整体并入，如同各自都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。本文引用的任何参考文献与本说明书的具体教导之间的任何冲突应以后者为准。同样，本领域理解的词或短语的定义与本说明书中具体教导的词或短语的定义之间的任何冲突应以后者为准。

如在本说明书中使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”也具体涵盖它们所指的术语的复数形式，除非上下文另有明确规定。术语“约”在本文中用于表示近似、在...的区域内、大致或大约。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所述数值的上限和下限来修饰该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修饰与所述值上下相差20％的数值。

除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有本申请所属领域的技术人员通常理解的含义。本文参考了本领域技术人员已知的各种方法和材料。

在实施例中，本文提供了用于自动化细胞工程系统的盒。图1显示了示例性盒102，其中可以在允许生产各种细胞样品和群体的封闭的、自动化的系统中进行各种过程。此类过程可包括活化、转导、扩增、浓缩、洗涤和收集/收获步骤。

如本文所述，盒和方法在完全封闭的自动化细胞工程系统300(参见图3A、3B)中使用和进行，其上适当地具有用于执行步骤如活化、转导、扩增、浓缩和收获的说明。用于自动生产例如基因修饰的免疫细胞(包括CAR T细胞)的细胞工程系统描述于2018年8月31日提交的美国专利申请号16/119,618(其公开内容通过引用以其整体并入本文)中，在本文也称为自动化细胞工程系统、COCOON^TM或COCOON^TM系统。

例如，用户可以提供预先填充有细胞培养物和试剂(例如，活化试剂、载体、细胞培养介质、营养物、选择试剂等)的自动化细胞工程系统以及用于细胞生产的参数(例如，细胞的起始数量、介质的类型、活化试剂的类型、载体的类型、细胞的数量或要产生的剂量等)。自动化细胞工程系统能够进行各种自动化方法，包括生产基因修饰的免疫细胞培养物(包括CAR T细胞)的方法，而无需来自用户的进一步输入。在一些实施例中，完全封闭的自动化细胞工程系统通过减少细胞培养物在非无菌环境中的暴露来最小化细胞培养物的污染。在另外的实施例中，完全封闭的自动化细胞工程系统通过减少细胞的用户处理来最小化细胞培养物的污染。

如本文所述，自动化细胞工程系统300适当地包括盒102。因此，在实施例中，本文提供了用于自动化细胞工程系统的盒。如本文所用，“盒”是指自动化细胞工程系统的大体独立的、可移除且可替换的元件，其包括一个或多个用于进行本文所述方法的各种元件的室，并且适当地还包括一个或多个细胞介质、活化试剂、洗涤介质等。

图2A显示了用于自动化细胞工程系统的示例性盒102。在实施例中，盒102包括细胞样品输入202。细胞样品输入202在图2A中显示为小瓶或室，其中可以在引入或装载到盒102之前放置细胞样品。在其他实施例中，细胞样品输入202可以简单地是可以连接注射器或含细胞的袋如血袋的无菌锁定管道(例如路厄锁管道连接等)。

盒102进一步包括细胞培养室206。本文描述了细胞培养室206的特征和用途的实例。盒102还包括与细胞培养室206流体连接的泵送系统520(参见图5流程中的示例性位置)。

如本文所用，“流体连接”是指系统的一个或多个组件如盒102的组件通过合适的元件连接，该元件允许流体(包括气体和液体)在组件之间通过而不会泄漏或丢失体积。示例性流体连接包括本领域已知的各种管道、通道和连接，例如硅胶或橡胶管道、路厄锁连接等。应当理解，流体连接的组件还可以包括每个组件之间的附加元件，同时仍然保持流体连接。即，流体连接的组件可以包括附加元件，使得在组件之间通过的流体也可以通过这些附加元件，但不是必须这样做。

泵送系统520适当地是蠕动泵系统，但也可以使用其他泵送系统。蠕动泵是指一类用于泵送流体的正排量泵。流体适当地含在安装在泵壳内的软管中—通常是圆形的。带有多个与转子外圆周连接的“辊子”、“模座”、“刮板”或“叶片”的转子压缩软管。当转子转动时，受压的管部分被挤压关闭(或“闭塞”)，从而迫使要泵送的流体穿过管。此外，当凸轮通过后管打开(“恢复”或“回弹”)时，流体流被引入泵。该过程称为蠕动，并用于使流体穿过软管。通常，有两个或更多个辊子或刮板堵塞管，在它们之间截留大量流体。大量流体然后被输送到泵出口。

盒102还包括与泵送系统流体连接的切向流过滤器204。图2B显示了示例性切向流过滤器。图2C显示了切向流过滤器内部的示意图。切向流过滤，也称为错流过滤，是一种过滤系统或过程，其中进料、入口或输入流体流(图2C中的250)在一部分经过并离开膜时平行于膜面通过(渗透物流—图2C中的252)，而其余部分(滞留物流—图2C中的254)在膜内通过并可以再循环回到输入，变得浓缩，最终可以转到储存或输出。

切向流过滤器204适当地由一系列向其中进料溶液的中空纤维膜构成(尽管也可以使用单根纤维)。滞留物流在中空纤维内通过，将细胞保留在纤维膜内部的溶液中，而多余的体积则经过纤维膜并离开进入渗透物流。这减少了总细胞样品的体积，导致细胞样品的浓缩。膜适当地以独立设备的形式提供，其可包括流量控制器258。

如本文所述，参考图2C，泵送系统520为切向流过滤器204提供滞留物流254，而切向流过滤器的渗透物流252由流量控制器258控制。本文所用的“流量控制器”是指阀、压缩装置、偏流器、泵机构、流体学—包括各种管道设置或其他机构，以控制离开切向流过滤器的纤维膜并进入渗透物流的流体量。提供图2C中的流量控制器258只是为了说明包括用于控制渗透物流252的量的机构，并不表示该机构的结构。

在示例性实施例中，流量控制器258是流量限制器260。“流量限制器”是指阀、逐渐变窄的管道或收缩装置，以控制离开切向流过滤器的渗透物流252的量和速率。流量限制器260放置在切向流过滤器204的下游，使得在激发切向流过滤器204的膜之后发生对渗透物流的控制。图2C中显示流量限制器260仅用于说明目的，并且流量限制器260的位置和运行不受图2C中的描绘的限制。本领域的普通技术人员将容易理解可以使用流量限制器来控制渗透物流252的量和速率的各种方式。合适地，流量限制器260邻近切向流过滤器204的端部262放置(参见图2B)，以限制渗透物流252的量和速率。

在进一步的实施例中，流量控制器258是可以被设置为控制和限制(或增加)渗透物流252的量和速率的附加泵送系统。

在仍进一步的实施例中，流量控制器258是具有多个管道的系统，其也可以定向并放置在盒102内以提供对渗透物流252的量和速率的期望控制(限制或增加)。

在实施例中，盒102进一步包括一个或多个适当地与细胞培养室连接的流体学路径(参见图2A中的盒102内部)。盒102中还包括与细胞培养室流体连接的细胞样品输出208。盒102还适当地包括与切向流过滤器204流体连接的细胞样品输出208。

如本文所述，细胞样品输出208可用于按照各种自动化程序收获细胞，以用于进一步处理、储存或在患者中的潜在用途。细胞样品输出208也可以是如本文所述的样品端口220，其允许细胞样品从盒中移除以例如用于转导如电穿孔，然后返回盒以用于进一步自动化处理。流体学路径的实例包括各种管道、通道、毛细管、微流体元件等，其向盒的元件提供营养物、溶液等，如本文所述。细胞样品输出208也可以只是切向流过滤器的输出，其然后与如本文所述的盒102的另一区段或部分流体连接。

在实施例中，盒102明确排除在切向流过滤器204之前或之后的离心机。已经确定，通过使用本文所述的各种细胞分离过滤器和方法，通过离心程序和使用离心机的额外细胞分离不是必需的。然而，在实施例中，可以使用额外的过滤系统，例如柱过滤和/或磁过滤系统。

在示例性实施例中，切向流过滤器204包括具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径的膜。在实施例中，切向流过滤器204的孔径为约0.2μm至约1.0μm，或约0.3μm至约0.9μm、约0.4μm至约0.8μm、约0.5μm至约0.7μm、约0.6μm至约0.7μm，或约0.40μm、约0.45μm、约0.50μm、约0.55μm、约0.60μm、约0.65μm、约0.70μm、约0.75μm或约0.80μm。在实施例中，纤维直径为约0.30mm至约1.2mm，适当地约0.40mm至约1.0mm、约0.50mm至约0.90mm、约0.60mm至约0.80mm、约0.70mm至约0.80mm，或约0.60mm、约0.65mm、约0.70mm、约0.75mm、约0.80mm、约0.85mm或约0.90mm。

适当地，切向流过滤器204包括约15-20根纤维，适当地为18个过滤器，其具有约10-20cm、适当地约10-15cm或约13cm的纤维内腔总长度。纤维表面积的数量级为约40-70cm²，更合适地约50-60cm²，或约57cm²。在实施例中，期望在切向流过滤器204中使用相对高表面积、大孔径的膜。

用于切向流过滤器204的示例性材料包括聚合物，包括但不限于聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)、纤维素酯、聚(砜)。示例性切向流过滤器包括可从SPECTRUM得到的那些，包括和过滤器，以及它们的变体以安装在期望的盒内。在实施例中，该材料是改性的聚(醚砜)。

在进一步的实施例中，可以将涂层施加到切向流过滤器的表面。适当地，该涂层可有助于减少或消除切向流过滤器204表面上的污垢。示例性的防污涂层包括例如磷脂涂层、聚合物涂层如聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙二醇)涂层等。附加的表面涂层也可以应用于切向流过滤器，以提供稳定性、增加或减少的流量，或其他期望特性。

在进一步的实施例中，附加前置过滤器和后置过滤器(即，在切向流过滤器之前或之后)也可用于本文所述的盒和方法中。例如，磁分离过程可用于从细胞群中进一步消除和分离不期望的细胞和碎片。在此类实施例中，已结合生物分子(例如，抗体、抗体片段等)的磁珠或其他结构可与靶细胞相互作用。然后可以使用各种磁分离方法，包括使用过滤器、柱、流管或通道(带有磁场)等，以将靶细胞群与可能存在于细胞样品中的不期望的细胞、碎片等分离。例如，靶细胞群可以流过管或其他结构并暴露于磁场，从而靶细胞群被磁场保留或拦截，允许不期望的细胞和碎片经过管。然后可以关闭磁场，允许靶细胞群转移至进一步的保留室或盒的其他区域以进行进一步的自动化处理。额外的过滤包括传统的柱过滤，或使用其他过滤膜和结构。

在进一步的实施例中，盒102进一步包括与切向流过滤器204流体连接的固定体积废物收集室510。固定体积废物收集室510用于收集离开切向流过滤器的渗透物流252。通过使用固定体积，允许固定体积废物收集室仅保持预定量的收集的渗透物流252。一旦达到该预定量的渗透物流252，则不允许额外的渗透物流252离开切向流过滤器204，因此细胞样品的体积将不会进一步减少。这导致产生具有预定义和已知的值的细胞浓度和细胞样品体积，例如，预定义以满足最终目标或用于定义体积的进一步处理。固定体积废物收集室510的实例包括各种硬塑料、金属等，它们不会膨胀并因此仅保持固定体积。此外，袋子或软塑料可以使用，但可以放置在硬塑料容器内部或固定壁(例如塑料壁)之间，使得一旦袋子达到预定体积，它就会撞击固定壁或容器，并且袋子的膨胀停止。当固定体积废物收集室510充满容量时，不允许额外的渗透物流252离开，并且然后滞留物流254仅再循环通过切向流过滤器，直到需要收集的时间。适当地，该再循环经由流体学路径(即，在图5的流程中一般地显示为540)发生。固定体积废物收集室510还可以包括将触发和引导渗透物流252以停止和再循环滞留物流254的液面监测器。

在另外的实施例中，可以为盒提供额外的存储能力以增加自动化过程的总体积或用于切向流过滤的额外体积流量的附属体积550与切向流过滤器204流体连接。附属体积550的示例性位置在图5的流程中显示。

盒还可以进一步包括一个或多个流体学路径(一般为540)，其中流体学路径向盒的各个部分包括细胞培养室提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰细胞培养室内的细胞。盒102还进一步包括一个或多个阀522或552，以用于控制流过各个流体学路径(参见图5中流程内的示例性位置)。

在示例性实施例中，如图2A所示，细胞培养室206是不容易弯曲或收缩的平坦且非柔性的室(即，由基本上非柔性的材料如塑料制成)。非柔性室的使用允许细胞保持在基本上不受干扰的状态。如图2A所示，使细胞培养室206定向以便允许免疫细胞培养物遍布细胞培养室的底部。如图2A所示，细胞培养室206适当地保持在与地板或桌面平行的位置，将细胞培养物保持在不受干扰的状态，允许细胞培养物遍布细胞培养室底部的大片区域上。在实施例中，细胞培养室206的总厚度(即，室高度)较低，在约0.5cm至约5cm的数量级上。合适地，细胞培养室的体积为约0.50ml至约300ml，更合适地为约50ml至约200ml，或者细胞培养室具有约180ml的体积。使用低室高度(小于5cm，适当地小于4cm、小于3cm或小于2cm)允许在细胞附近进行有效的介质和气体交换。端口被配置为允许通过流体的再循环进行混合而不干扰细胞。较大高度的静态容器可产生浓度梯度，导致细胞附近区域的氧气和新鲜营养物受到限制。通过受控的流动动力学，可以在没有细胞干扰的情况下进行介质交换。可以从额外的室(不存在细胞)中移除介质，而不会有细胞损失的风险。

如本文所述，在示例性实施例中，盒预先填充有细胞培养物、培养介质、细胞洗涤介质(如果期望的话)、活化试剂和/或载体中的一种或多种，包括这些的任何组合。在进一步的实施例中，这些不同的元件可以稍后通过合适的注射端口等添加。

如本文所述，在实施例中，盒适当地进一步包括pH传感器524、葡萄糖传感器(未示出)、氧传感器526、二氧化碳传感器(未示出)、乳酸传感器/监测器(未示出)和/或光密度传感器(未示出)中的一种或多种。参见图5中流程内的示例性位置。盒也可包括一个或多个采样端口和/或注射端口。此类采样端口220和注射端口222的实例显示在图2A和图5所示的流程中的示例性位置，并且可以包括用于将盒连接到外部装置如电穿孔单元或附加介质源的接入端口。图2A还显示了输入202、可用于温热细胞介质等的试剂温热袋224和次级室230的位置。

在实施例中，盒102适当地包括低温室，其可包括适合于储存细胞培养介质的冷藏区226，以及适合于进行细胞培养物的活化、转导和/或扩增的高温室。合适地，高温室通过热障与低温室隔开。如本文所用，“低温室”是指适当地维持在低于室温，并且更适当地维持在约4℃至约8℃，用于将细胞介质等维持在冷藏温度的室。低温室可包括用于介质的袋子或其他保持器，其包括约1L、约2L、约3L、约4L或约5L的流体。额外的介质袋或其他流体源可以从外部与盒连接，并通过接入端口与盒连接。

如本文所用，“高温室”是指适当地维持在高于室温，并且更适当地维持在允许细胞增殖和生长的温度，即约35-40℃并且更适当地约37℃的室。在实施例中，高温室适当地包括细胞培养室206(也称为增殖室或细胞增殖室)。

在实施例中，切向流过滤器204在盒102中适当地对齐，使得切向流过滤器相对于水平呈约3°至约20°的角度，更适当地为相对于水平呈约5°至约15°或约10°的角度(切向流过滤器204的出口端位于输入端上方/高于输入端)。切向流过滤器204以相对于水平的角度对齐(其中切向流过滤器的出口端(即262)在输入端上方)对于提供期望的流动特性以通过切向流过滤器204产生改进的体积减少和细胞浓缩而言是期望的。

切向流过滤器相对于水平以约3°至约20°的角度对齐也提供了可以减少或避免细胞致敏(或重力沉降)的优点。使用此类角度允许细胞在它们流下切向流过滤器时翻滚出悬浮液。

在实施例中，盒102还可以包括细胞洗涤系统512，其适当地含在盒102内(即，在图2A所示的结构内)，并且与切向流过滤器204流体连接，或者可以与盒内的其他区段连接，这取决于是否期望洗涤细胞。在实施例中，细胞洗涤系统512是含在盒102内的容器或袋子，其适当地包括细胞洗涤介质。在将细胞群转移到盒内或盒外以用于进一步处理或使用之前，细胞洗涤介质适合用于清洁期望的细胞群以去除任何不期望的废细胞或污染。细胞洗涤系统512也可以包括在盒102之外。

盒102还可进一步任选地包括细胞保持室516(图2中不可见，因为它位于盒102内)。图5在盒的流程中显示了细胞保持室516的示例性位置。细胞保持室516适当地是位于盒内的储器或合适的室，细胞群可以在切向流过滤之前或之后保持在其中，如本文所述。

在另外的实施例中，本文提供了用于自动化细胞工程系统300的盒102，其适当地包括细胞培养室206、与细胞培养室流体连接的泵送系统520和与泵送系统流体连接的切向流过滤器204。如本文所述，泵送系统向切向流过滤器提供滞留物流并且切向流过滤器的渗透物流由流量控制器控制。盒还进一步包括与切向流过滤器连接的附属体积550、用于使滞留物流通过切向流过滤器再循环返回的流体学路径540、与切向流过滤器流体连接的固定体积废物收集室510和与切向流过滤器流体连接的细胞样品输出208。

本文描述了用于切向流过滤器204的示例性孔径和纤维直径。在实施例中，切向流过滤器具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径，包括约0.60μm至约0.70μm的孔径和约0.70mm至约0.80mm的纤维直径。

适用于切向流过滤器的材料包括聚合物，例如但不限于聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)。

在示例性实施例中，盒102进一步包括一个或多个流体学路径，其中流体学路径向细胞培养室提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰细胞培养室内的细胞。在实施例中，细胞培养室是具有低室高度的平坦且非柔性的室。

如本文所述，盒102可以进一步包括pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种，并且还可以包括一个或多个采样端口。

在实施例中，切向流过滤器位于盒102内相对于水平呈约3°至约20°的角度。

如本文所述，流量控制器可以是流量限制器、附加泵送系统、具有多个管道的系统或此类控制器的组合。

图3A-3B显示了自动化细胞工程系统300，其中盒102位于其内部(在图3B中自动化细胞工程系统的盖子打开)。还显示了示例性用户界面，其可以包括条形码阅读器，以及通过触摸板或其他类似装置接收使用输入的能力。

本文所述的自动化细胞工程系统和盒适当地具有三个相关体积，细胞培养室体积、运行体积和总体积。适当地，基于过程步骤，盒中使用的运行体积在180mL至460mL的范围内，并且可增加直至约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL或约1L。在实施例中，盒可以容易地实现4*10⁹个细胞-10*10⁹个细胞。过程期间的细胞浓度从0.3*10⁶个细胞/ml到大约10*10⁶个细胞/ml不等。细胞位于细胞培养室中，但介质通过额外的室(例如，错流储器和附属体积)连续再循环以增加运行体积，如本文所述。

包括气体交换管线的流体学路径可以由透气材料制成，诸如例如硅胶。在一些实施例中，在细胞生产方法期间，自动化细胞工程系统使氧气在整个基本刚性的室中再循环。因此，在一些实施例中，自动化细胞工程系统中细胞培养物的氧水平高于柔性透气袋中细胞培养物的氧水平。在细胞培养物扩增步骤中，较高的氧水平可能是重要的，因为增加的氧水平可能支持细胞生长和增殖的增加。

在进一步的实施例中，本文提供了一种在自动处理期间减少细胞样品体积的方法。参考图5的流程描述了本文提供的方法，其仅用于说明目的，但不应被视为限制可进行此类方法的方式。例如，细胞样品可以通过输入202引入盒102。在其他实施例中，细胞样品可以已经在盒102内，例如在转导或细胞扩增阶段之后，例如在细胞培养室206中。将细胞样品例如通过经过阀V11引入250至切向流过滤器204中。切向流过滤器具有滞留物流254和渗透物流252(参见图2C)。如本文所述，渗透物流252由流量控制器258控制以提供期望的细胞浓缩和体积减少。使细胞样品经过滞留物流254，同时通过渗透物流252从细胞样品中去除体积。适当地，渗透物流252通过经过阀v1和v13(虽然阀v13可以去除，如果期望的话)除去至固定体积废物收集室510。一旦达到期望的体积减少，就适当地通过经过阀V1和V10收集具有减少体积的细胞样品至输出208。在其他实施例中，在进一步自动化处理或从盒中移除之前，具有减少体积的细胞样品可以收集在例如细胞保持室516中。

如本文所述，在去除体积步骤之后适当地再循环滞留物流254以重复地使细胞样品经过滞留物流254。例如滞留物流254可以流出切向流过滤器204，通过阀V1、V12和V11，并回到切向流过滤器204。

在利用固定体积废物收集室510的实施例中，一旦达到固定体积的废物，这也将迫使细胞样品通过切向流过滤器(例如通过阀V14、V12和V11)返回，但将不允许任何额外的体积去除，因为一旦固定体积废物收集室含有期望体积，去除体积就适当地停止。

在另外的实施例中，在初始收集细胞样品之后，可以使用细胞洗涤系统512洗涤样品，然后可以重复体积减少方法。细胞洗涤系统512可以例如通过阀V4与细胞保持室516连接，并通过关闭阀V12和V11迫使洗涤溶液进入保持室。

本文所述的方法可进一步包括额外的步骤，包括例如在切向流过滤后的收集后对细胞样品进行电穿孔。这可以通过内部(即，具有盒102)或外部电穿孔系统发生。还可以在切向流过滤后的收集后进行额外的转导步骤。

如本文所述，该方法适当地利用流量控制器，该流量控制器可以是流量限制器、附加泵送系统、具有多个管道的系统或此类控制器的组合。

在实施例中，本文描述的方法和盒用于平台(Octane Biotech(金斯顿,安大略))，该平台在单个turnkey平台中集成了多个单元操作。多个细胞方案提供了非常具体的细胞处理目标。为了提供高效且有效的自动化翻译，所描述的方法利用了结合多个单元操作的应用特定/赞助商特定一次性盒的概念—所有这些都集中在最终细胞疗法产品的核心要求上。多个自动化细胞工程系统300可以一起集成到一个大型的多单元操作中，以用于为个体患者生产大体积细胞或多个不同的细胞样品(参见图4)。

还如图5所示的是各种传感器(例如pH传感器524、溶解氧传感器526)以及采样/样品端口和各种阀(包括旁路止回阀552)以及一个或多个流体学路径540的示例性定位，其适当地包括基于硅胶的管道组件，连接该组件。如本文所述，使用基于硅胶的管道组件允许通过管道组件进行充氧以促进细胞培养物的气体转移和最佳充氧。也显示在图5中的是在盒的流程中使用一个或多个疏水过滤器554或亲水过滤器556。

在另外的实施例中，本文提供了自动化细胞工程系统300。如图3A和3B所示，自动化细胞工程系统300适当地包括可封闭外壳302和含在可封闭外壳内的盒102。如本文所用，“可封闭外壳”是指可打开和关闭的结构，并且如本文所述的盒102可放置在其中并与各种组件如流体供应管线、气体供应管线、电源、冷却连接、加热连接等集成。如图3A和3B所示，可封闭外壳可以打开(图3B)以允许插入盒，并关闭(图3A)以保持封闭、密封的环境以允许利用盒进行本文所述的各种自动化过程。

如本文所述，盒102适当地包括细胞培养室206、与细胞培养室流体连接的泵送系统520和与泵送系统流体连接的切向流过滤器204。如本文所述，泵送系统向切向流过滤器提供滞留物流，并且切向流过滤器的渗透物流由流量控制器控制。盒102还适当地包括与切向流过滤器流体连接的细胞样品输出208。

如图3A-3B所示，自动化细胞工程系统300还进一步包括用于接收来自用户的输入的用户界面304。用户界面304可以是触摸板、平板电脑、键盘、计算机终端或其他合适的界面，其允许用户向自动化细胞工程系统输入期望的控制和标准以控制自动化过程和流程。适当地，用户界面与计算机控制系统耦合以向自动化细胞工程系统提供指令，并控制自动化细胞工程系统的整体活动。此类指令可包括何时打开和关闭各种阀、何时提供介质或细胞群、何时升高或降低温度等。

本文描述了用于自动化细胞工程系统的切向流过滤器204的孔径和纤维直径的示例性特征，并且在实施例中，切向流过滤器具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径，合适的孔径为约0.60μm至约0.70μm，并且纤维直径为约0.70mm至约0.80mm。适合用于切向流过滤器的聚合物在本文中描述，并且包括聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)。

在实施例中，自动化细胞工程系统中的盒进一步包括与切向流过滤器204流体连接的固定体积废物收集室510。在实施例中，自动化细胞工程系统300的盒102进一步包括一个或多个流体学路径540，其中该流体学路径向细胞培养室206提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰细胞培养室内的细胞。在实施例中，细胞培养室是具有低室高度的平坦且非柔性的室。还可以包括流体学路径以用于使滞留物流通过切向流过滤器再循环返回。盒还可以包括与切向流过滤器流体连接的附属体积550。

在自动化细胞工程系统的实施例中，盒102预先填充有培养介质、细胞洗涤介质等。如本文所述，在实施例中，自动化细胞工程系统的盒可进一步包括pH传感器524、葡萄糖传感器、氧传感器526、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种，并且在合适的实施例中包括一个或多个采样端口。

本文描述了示例性流量控制器，包括流量限制器、附加泵送系统和具有多个管道的系统。在实施例中，切向流过滤器在盒内相对于水平呈约3°至约20°的角度。

细胞疗法生产中单元操作的自动化为遍及同种异体和自体细胞疗法应用的普遍优势提供了机会。在患者特异的自体细胞产品的独特场景中，并且这些疗法的临床成功甚至更加强调，由于小批量GMP合规性、经济性、患者可追溯性和过程偏差的早期识别的显著微批次复杂性，自动化的优势特别引人注目。复杂制造方案的相关出现提请注意以下事实：微批次细胞生产中自动化单元操作的端到端集成的价值尚未成为重要研究点。然而，在这些疗法即将获得批准后对这些疗法的预期需求表明，实施完全封闭的端到端系统可以为制造瓶颈如转交时间和覆盖区提供急需的解决方案。

鼓励先进疗法的开发人员在推广临床翻译和扩大临床试验方案的早期考虑自动化。早期自动化可以影响方案开发，避免在后期从手动过程切换到自动化过程时进行可比性研究的需要，并提供对长期商业化路线的更好理解。

在示例性实施例中，本文描述的自动化细胞工程系统包括多个室，并且其中本文描述的各种方法的每个步骤在自动化细胞工程系统的多个室的不同室中执行，在开始该方法之前，活化试剂、载体和细胞培养介质中的每一种都包含在多个室中的不同室中，并且其中多个室中的至少一个保持在用于生长细胞的温度(例如，在约37℃)下并且多个室中的至少一个保持在冷藏温度(例如，在约4-8℃)下。

在实施例中，本文描述的自动化细胞工程系统用温度传感器、pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器监测。因此，在一些实施例中，自动化细胞工程系统包括温度传感器、pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种。在另外的实施例中，自动化细胞工程系统被配置为基于预定义的培养物大小来调节细胞培养物的温度、pH、葡萄糖、氧水平、二氧化碳水平和/或光密度。例如，如果自动化细胞工程系统检测到细胞培养物的当前氧水平太低而无法达到期望细胞培养物大小的必要生长，则自动化细胞工程系统将自动增加细胞培养物的氧水平，例如通过引入充氧细胞培养介质，通过用充氧细胞培养介质替换细胞培养介质，或通过使细胞培养介质流过充氧组件(即，硅胶管道)。在另一个实例中，如果自动化细胞工程系统检测到细胞培养物的当前温度过高并且细胞生长过快(例如，可能的细胞过度拥挤可能导致不期望的特征)，则自动化细胞工程系统将自动降低细胞培养物的温度以保持细胞的稳定生长速度(或指数生长速度，根据需要)。在仍进一步的实施例中，自动化细胞工程系统基于细胞生长速率和/或细胞计数或其他监测的因素如pH、氧、葡萄糖等，自动调整细胞喂养的时间表(即，向细胞培养物提供新鲜介质和/或营养物)。自动化细胞工程系统可以被配置为在低温室(例如，4℃或-20℃)中储存介质(和其他试剂，例如洗涤液等)，并在将温热介质引入细胞培养物之前，在室温室或高温室(例如，分别为25℃或37℃)中温热介质。

另外的示例性实施例

实施例1是一种用于自动化细胞工程系统的盒，其包括细胞培养室、与所述细胞培养室流体连接的泵送系统、与所述泵送系统流体连接的切向流过滤器，其中所述泵送系统为所述切向流过滤器提供滞留物流，并且其中所述切向流过滤器的渗透物流由流量控制器控制，以及与所述切向流过滤器流体连接的细胞样品输出。

实施例2包括根据实施例1所述的盒，其中所述切向流过滤器具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径。

实施例3包括根据实施例2所述的盒，其中所述切向流过滤器具有约0.60μm至约0.70μm的孔径和约0.70mm至约0.80mm的纤维直径。

实施例4包括根据实施例1-3中任一项所述的盒，其中所述切向流过滤器包括选自由聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)组成的群组的聚合物。

实施例5包括根据实施例1-4中任一项所述的盒，其进一步包括与所述切向流过滤器流体连接的固定体积废物收集室。

实施例6包括根据实施例1-5中任一项所述的盒，其进一步包括用于使所述滞留物流通过所述切向流过滤器再循环返回的流体学路径。

实施例7包括根据实施例1-6中任一项所述的盒，其进一步包括与所述切向流过滤器流体连接的附属体积。

实施例8包括根据实施例1-7中任一项所述的盒，其进一步包括一个或多个流体学路径，其中所述流体学路径向所述细胞培养室提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰所述细胞培养室内的细胞。

实施例9包括根据实施例1-8中任一项所述的盒，其中所述细胞培养室是具有低室高度的平坦且非柔性的室。

实施例10包括根据实施例1-9中任一项所述的盒，其进一步包括pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种。

实施例11包括根据实施例1-10中任一项所述的盒，其进一步包括一个或多个采样端口。

实施例12包括根据实施例中任一项所述的盒，其中所述切向流过滤器相对于水平呈约3°至约20°的角度。

实施例13包括根据实施例1-12中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是流量限制器。

实施例14包括根据实施例1-13中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是附加的泵送系统。

实施例15包括根据实施例1-14中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是具有多个管道的系统。

实施例16是一种用于自动化细胞工程系统的盒，其包括细胞培养室、与所述细胞培养室流体连接的泵送系统、与所述泵送系统流体连接的切向流过滤器，其中所述泵送系统为所述切向流过滤器提供滞留物流，并且其中所述切向流过滤器的渗透物流由流量控制器控制；与所述切向流过滤器连接的附属体积；用于使所述滞留物流通过所述切向流过滤器再循环返回的流体学路径；与所述切向流过滤器流体连接的固定体积废物收集室；以及与所述切向流过滤器流体连接的细胞样品输出。

实施例17包括根据实施例16所述的盒，其中所述切向流过滤器具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径。

实施例18包括根据实施例17所述的盒，其中所述切向流过滤器具有约0.60μm至约0.70μm的孔径和约0.70mm至约0.80mm的纤维直径。

实施例19包括根据实施例16-18中任一项的盒，其中所述切向流过滤器包括选自由聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)组成的群组的聚合物。

实施例20包括根据实施例16-19中任一项所述的盒，其进一步包括一个或多个流体学路径，其中所述流体学路径向所述细胞培养室提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰所述细胞培养室内的细胞。

实施例21包括根据实施例16-20中任一项所述的盒，其中所述细胞培养室是具有低室高度的平坦且非柔性的室。

实施例22包括根据实施例16-21中任一项所述的盒，其进一步包括pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种。

实施例23包括根据实施例16-22中任一项所述的盒，其进一步包括一个或多个采样端口。

实施例24包括根据实施例16-23中任一项所述的盒，其中所述切向流过滤器相对于水平呈约3°至约20°的角度。

实施例25包括根据实施例16-24中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是流量限制器。

实施例26包括根据实施例16-25中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是附加的泵送系统。

实施例27包括根据实施例16-26中任一项所述的盒，其中所述流量控制器是具有多个管道的系统。

实施例28是一种在自动化处理期间减少细胞样品体积的方法，所述方法包括将细胞样品引入具有滞留物流和渗透物流的切向流过滤器，其中所述渗透物流由流量控制器控制，使所述细胞样品通过所述切向流过滤器的所述滞留物流，通过所述渗透物流从所述细胞样品中去除体积到固定体积废物收集室，以及收集具有减少体积的所述细胞样品。

实施例29包括根据实施例28所述的方法，其进一步包括在所述去除体积步骤之后再循环所述滞留物流以重复地使所述细胞样品通过所述滞留物流。

实施例30包括根据实施例28-29中任一项所述的方法，其中一旦所述固定体积废物收集室含有期望体积，就停止所述去除体积。

实施例31包括根据实施例28-30中任一项所述的方法，其进一步包括在所述收集后洗涤所述细胞样品，并重复所述方法的步骤(a)-(d)。

实施例32包括根据实施例28-31中任一项所述的方法，其进一步包括在所述收集后对所述细胞样品进行电穿孔。

实施例33包括根据实施例28-32中任一项所述的方法，其中所述流量控制器是流量限制器。

实施例34包括根据实施例28-33中任一项所述的方法，其中所述流量控制器是附加的泵送系统。

实施例35包括根据实施例28-34中任一项所述的方法，其中所述流量控制器是具有多个管道的系统。

实施例36是一种自动化细胞工程系统，其包括可封闭外壳、包含在所述可封闭外壳内的盒，所述盒包括细胞培养室、与所述细胞培养室流体连接的泵送系统、与所述泵送系统流体连接的切向流过滤器，其中所述泵送系统为所述切向流过滤器提供滞留物流，并且其中所述切向流过滤器的渗透物流由流量控制器控制，和与所述切向流过滤器流体连接的细胞样品输出，以及用于接收来自用户的输入的用户界面。

实施例37包括根据实施例36所述的自动化细胞工程系统，其中所述切向流过滤器具有约0.40μm至约0.80μm的孔径和约0.5mm至约0.9mm的纤维直径。

实施例38包括根据实施例37所述的自动化细胞工程系统，其中所述切向流过滤器具有约0.60μm至约0.70μm的孔径和约0.70mm至约0.80mm的纤维直径。

实施例39包括根据实施例36-38中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述切向流过滤器包含选自由聚(醚砜)、聚(丙烯腈)和聚(偏二氟乙烯)组成的群组的聚合物。

实施例40包括根据实施例36-39中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括与所述切向流过滤器流体连接的固定体积废物收集室。

实施例41包括根据实施例36-40中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括用于使所述滞留物流通过所述切向流过滤器再循环返回的流体学路径。

实施例42包括根据实施例36-41中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括与所述切向流过滤器流体连接的附属体积。

实施例43包括根据实施例36-42中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括一个或多个流体学路径，其中所述流体学路径向所述细胞培养室提供再循环、废物去除和均质气体交换以及营养物分配而不干扰所述细胞培养室内的细胞。

实施例44包括根据实施例36-43中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述细胞培养室是具有低室高度的平坦且非柔性的室。

实施例45包括根据实施例36-44中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括pH传感器、葡萄糖传感器、氧传感器、二氧化碳传感器和/或光密度传感器中的一种或多种。

实施例46包括根据实施例36-45中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括一个或多个采样端口。

实施例47包括根据实施例36-46中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述切向流过滤器相对于水平呈约3°至约20°的角度。

实施例48包括根据实施例36-47中任一项所述的自动化细胞工程系统，其进一步包括计算机控制系统，其中所述用户界面与所述计算机控制系统耦合以向所述自动化细胞工程系统提供指令。

实施例49包括根据实施例36-48中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述流量控制器是流量限制器。

实施例50包括根据实施例36-48中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述流量控制器是附加泵送系统。

实施例51包括根据实施例36-48中任一项所述的自动化细胞工程系统，其中所述流量控制器是具有多个管道的系统。

实例

实例1—COCOON ^TM 系统中的切向流过滤

用于细胞疗法应用的切向流过滤(TFF)可以用于在配制之前从收获后的悬浮液流体中分离、澄清、回收和收集细胞。传统TFF过程由两个步骤组成；1)体积减小和2)渗滤。在体积减少步骤期间，通过经由过滤器的渗透物侧的过滤不断地移除大体积(收获试剂和培养介质中的细胞)，直到在处理袋中达到期望的细胞浓度。在渗滤期间，用配制缓冲液替换浓缩的细胞悬浮溶液，并且将最终溶液中不期望的残余蛋白质和污染物降低至可接受的水平。最终的细胞悬浮液将是在准备配制的细胞浓度和缓冲液中。切向流过滤器优于标准过滤器，因为它们可以减少流体体积，同时防止堵塞和避免细胞损伤。由于细胞不被压缩在过滤器上，因此细胞也更容易被取回。

TFF过滤器是单独使用和一次性的，因此它们可以容易地应用到盒中，以便以封闭和自动的方式执行操作。完全封闭的系统允许该过程无菌地执行，因为细胞疗法产品不能最终灭菌或过滤。一种完全一次性系统消除了交叉污染风险并降低了清洁要求。为了增加COCOON^TM的功能性，提供了一种具有集成切向流过滤器的盒。该实例详细描述了TFF系统的开发，以在用于细胞疗法应用的自动化系统中浓缩和洗涤细胞。

方法

COCOON^TM盒中的切向流过滤

用于细胞浓缩的TFF系统通常具有两个泵，一个用于控制进料流速，而一个用于控制渗透物(即废物)流速。每个泵的流速通常基于优化跨膜压力来确定。如果压差太高或太低，则可能导致没有物体流过过滤器，从而使系统无效，或者可能导致堵塞。COCOON^TM一般在单个泵上运行，并且没有压力传感器，因此，不能应用通过TFF进行过滤的传统方法。

用安装在COCOON^TM盒或盒式路径中的TFF过滤器进行实验。如本文所述，盒路径含有用于细胞培养的扩增室、用于细胞处理的附属袋或L形室、用于去除过量介质的TFF和用于收集过量介质的废物袋。COCOON^TM盒适合在其培养室中使高达450mL的培养介质再循环。从COCOON^TM盒的各种附属储器提供超过260cm²增殖室的180mL容量的额外介质体积。来自这些附属储器的另外的介质可以在一次性盒的培养部分内再循环，以提供新鲜的营养物并从增殖室中的细胞中除去废品。

为了产生压差，在渗透物管线中使用流量限制器。基于实验优化，选择理想的渗透物流速，以避免堵塞、最大化细胞回收和最小化体积减少的时间。与此同时，测试了宽范围的过滤器以了解纤维直径、纤维面积、纤维数量、总表面积、细胞类型、滞留物流速、孔径和过滤材料的影响。

固定体积废物容器

几个实验还使用固定体积废物容器。盒通常具有位于流体储器中的柔性废物袋。该袋具有膨胀的能力，在某些情况下可能导致附属袋和TFF的完全排空。过滤器的完全排空由于在过滤器膜上的截留而导致细胞的不可逆损失。为了限制废物袋的容量，它可以固定间隔保持在流体储器中的两个刚性塑料层之间。袋填充到固定体积，此时袋中的压力使得通过附属袋/TFF的再循环继续，而不进一步将流体递送到废物。浓缩外周血单核细胞(PBMC)的定制过滤器

初始细胞浓度实验揭示切向流过滤器的期望性质，例如增加的表面积和大的孔径。Spectrum Labs P-OCTA01-04-N过滤器是一种定制设计的过滤器，以满足这些要求并安装在Cocoon盒中。性质包括：

mPES膜

纤维直径＝0.75

孔径＝0.65μm

纤维数量＝18

内腔＝13cm总长度

表面积＝57cm²

评价、优化该过滤器，然后将其用于概念验证电穿孔集成研究。

使用定制过滤器减少TFF体积

在没有COCOON^TM的情况下进行定制过滤器的初步研究。Research 2iTFF系统(Spectrum Labs)用于监测细胞处理期间的进料、滞留物、渗透物和跨膜压力。仅使用一个控制进料管线流速的泵(除非另有说明)来模拟COCOON^TM仪器性能。来自Nordson EFD的20号规格0.024”I.D./0.036”O.D.流量限制器，其被添加到渗透物管线的末端以模拟先前优化的TFF程序。通过使用该系统，将100mL的细胞悬浮液浓缩至10-20mL。在室温下在工作台上进行TFF。跨膜压力被定义为：

PBMC培养物

1x10⁸个PBMC用1x10⁸个CD3+:CD28+Dynabeads(Invitrogen)刺激并在完全T细胞培养基中使用多个GREX 100(Wilson Wolf)培养容器扩增至多10天，所述完全T细胞培养基包含X-VIVO 15培养基(Lonza)，补充有5％人血清A/B(Sigma)和10ng/mL IL-2(Peprotech)。为了适应可能堵塞过滤器的高粘度血清，已经定义了COCOON^TM中的预洗方案，以在使用TFF过程减少体积之前首先降低血清浓度。将测试浓度的细胞转移到250mL锥形瓶中，并离心或使其在37℃培养箱(5％CO₂，空气湿润)中沉淀2-4小时。将沉淀的细胞悬浮液的上清液减少至10mL，并弃去过量的上清液。将适当的培养基加入到浓缩的细胞悬浮液中，使最终体积为100mL。

分析

使用Nucleocounter NC-200(Chemotec)对稀释前的细胞培养物、稀释的培养物和最终浓缩的细胞悬浮液进行计数，一式两份。TFF之前和之后使用血清学移液管和KrosFlo量表测量体积。从稀释前的初始培养物、TFF之前的上清液和TFF之后的最终浓缩的细胞悬浮液获得残余测试样品。使用人血清ELISA试剂盒(Bethyl Laboratories)测定稀释和浓缩后剩余血清的百分比。对对照细胞和TFF浓缩的细胞悬浮液进行FACS分析以用于CD4+和CD8+表达。

TFF体积减少的成功示范定义如下：

TFF后细胞回收率≥85％

TFF后细胞活力降低≤10％

TFF后初始浓度的残留人血清(用于电穿孔研究)≤10％

结果

切向流过滤器的评价

测试了多种过滤器以了解各种过滤器参数的影响。纤维直径、纤维面积、纤维数量、总表面积、滞留物流速、孔径和过滤器材料都在过滤器减少细胞悬浮液体积的有效性中发挥作用。结果还受溶液(例如培养基类型和血清类型)以及细胞类型(即大小)、细胞数目、细胞浓度和目标最终体积的影响。流体静压也有影响，因此必须根据流体静压来调节流量限制器。大多数组使用人间充质干细胞(hMSC)作为测试的细胞类型。

为了适应渗透物流量的可变性，使用具有固定体积的非柔性废物容器。例如，如果需要从总体积中除去100mL，则使用正好100mL的废物容器。流动的持续时间可以基于最慢的渗透物流来设定。在泵管的任一侧设置带有线内高压止回阀的旁路回路。如果在泵送时间完成之前填充废物，则旁路管线被激活，使得流体以循环方式泵送，从而结束TFF过程。该方法实现了非常一致的废物流速，如表1所示。为了进行附加控制，可以将液面传感器集成到COCOON^TM中，以监测非柔性容器中的液面。

表1：固定体积废物容器组总结

定制切向流过滤器的评估和优化

各种切向流过滤器的测试结果显示了期望的条件。定制过滤器Spectrum Labs P-OCTA01-04-N满足这些规格，但是需要测试和优化。我们希望确保过滤器正确运行，并且最初分离COCOON^TM系统的任何限制；因此，我们使用Spectrum Labs TFF系统评价过滤器。

启动非细胞组以接收过滤器的初始运行参数。当RPMI培养基的体积减少时，存在恒定的跨膜压力(TMP)和通过过滤器的通量(图6A)。然而，如果将血清加入RMPI中，则TMP随时间增加且通量减小(图6B)。这是过滤器被血清中的蛋白质堵塞的标志。

为了控制来自血清的堵塞，将自动背压阀(图7A和7B)或次级泵(图7C)添加到渗透物管线。自动背压阀能够在3分钟的体积减少之后控制渗透物压力。次级泵最初控制渗透物流速为20ml/min，然后在5.5分钟后为10ml/min。在渗透物控制的两种情况下，存在通常恒定的通量、渗透物压力和TMP。结果表明，控制COCOON^TM中TFF渗透物管线上的压力提供了对过滤器堵塞的控制。

在无血清的PBMC悬浮液的体积减少时观察到类似的趋势(图8A和8B)。在渗透物上添加背压控制阀有助于稳定通量、渗透物压力和TMP。这进一步证实了对渗透物控制的需要。

为了获得最大的细胞回收率而不使活力显著损失，优化过程参数。所检查的第一个参数是通过渗透物控制泵的渗透物压力。在浓缩PMBC+0％血清悬浮液时，将再循环泵设定为60mL/min，并将渗透物控制泵设定为0、5、10或15mL/min(图9A-9D)。渗透物泵的速度似乎对通量、TMP或渗透物压力几乎没有影响。选择15mL/min以用于以下实验，因为这将导致最快的TFF持续时间。

还检测了再循环流速。用渗透物泵以15mL/min以及60mL/min或70mL/min的再循环流速通过TFF浓缩0％血清悬浮液中的PBMC(表2)。流速为70mL/min时，细胞回收率较大。

表2：用于渗透物控制的具有0％血清的PMBC的切向流过滤浓度

通过TFF利用在渗透物管线上的流量限制器和70mL/min的再循环流速浓缩0％血清悬浮液中的PBMC(表3)。平均回收率为约89％，活力大于80％。

表3：具有0％血清和流量限制器的PMBC的切向流过滤浓度

许多细胞疗法使用血清，并且在某些情况下，可能无法在TFF之前去除血清。通过TFF利用在渗透物管线上的流量限制器和70mL/min的再循环流速浓缩5％血清悬浮液中的PBMC(表4)。平均回收率约为86％，活力大于80％。

表4：具有5％血清和流量限制器的PMBC的切向流过滤浓度

通过TFF在COCOON^TM盒中浓缩细胞以用于电穿孔

细胞洗涤和浓缩不仅在产品的下游加工之前有用；它还可以用于某些单元操作如电穿孔的中间自动化过程。在将细胞添加到电穿孔单元之前，将细胞适当浓缩至<10mL，并洗掉残留物。对于概念验证，来自两个供体的细胞通过沉淀浓缩至10mL体积，其中总活细胞为4.4x10⁸和4.2x10⁸。然后用90mL补充的Nucleofector^TM溶液(NFS)稀释这两种细胞悬浮液，并使用TFF浓缩至10mL。TFF浓缩后的细胞回收率为92％和87％(图10A)。转染前的细胞活力为92％和74％，并且TFF后下降小于5％(图10B)。

在两组中，在最终的TFF浓缩细胞悬浮液中检测到6％和8％的初始培养物上清液(表5)。

表5：原始培养物上清液、稀释后和浓缩的TFF渗透物以及TFF后的最终细胞悬浮液上清液中可检测到的人血清A/B的百分比。

与未通过TFF浓缩的对照培养物相比，TFF之后的CD4+:CD8+谱没有差异(图11)。

这些结果证明了在过程中转染之前TFF在细胞洗涤和浓缩中的用途。

结论

使用COCOON^TM系统可以适当地进行通过切向流过滤进行的洗涤和浓缩。TFF允许过程保持封闭和自动化，并适合在COCOON^TM一次性盒的范围内。TFF可以浓缩<20ml的细胞悬浮液并通过系统回收>85％的细胞。

对相关领域的普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离任何实施例的范围的情况下，可以对本文描述的方法和应用进行其他合适的修改和调整。

应当理解，虽然本文已经说明和描述了某些实施例，但是权利要求不限于所描述和示出的部件的特定形式或布置。在说明书中，已经公开了说明性实施例，并且虽然使用了特定术语，但是它们仅用于一般和描述性的意义而不是为了限制的目的。根据上述教导，实施例的修改和变型是可能的。因此应当理解，可以以不同于具体描述的方式来实践这些实施例。

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。