B细胞免疫疗法
阅读说明：本技术 B细胞免疫疗法 (B cell immunotherapy ) 是由 马克·C·波兹南斯基 鲁克桑德拉·F·西尔布列斯库 于 2020-01-23 设计创作，主要内容包括：通常,本发明的特征在于一种治疗有需要的对象(例如人)中的神经退行性疾病(例如肌萎缩侧索硬化)或创伤性脑损伤的方法,所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的分离的B细胞(例如自体或同种异体或异种B细胞)。(In general, the invention features a method of treating a neurodegenerative disease (e.g., amyotrophic lateral sclerosis) or traumatic brain injury in a subject (e.g., a human) in need thereof, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of isolated B cells (e.g., autologous or allogeneic or xenogeneic B cells).)
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年1月23日提交的美国临时申请号62/798,629、2019年4月24日提交的美国临时申请号62/837,765和2020年1月23日提交的美国临时申请号62/965,032的权益，其内容通过引用以其全文并入本文。
背景技术
退行性疾病是导致细胞、组织或器官退化的医学病症。例如，肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、和亨廷顿病(HD)属于众多的涉及中枢神经系统区域退化的神经退行性疾病。创伤性脑损伤(TBI)也是一种可能会增加发展退行性脑病(例如PD或AD)的风险的障碍的实例。类风湿性关节炎和骨关节炎仍然是涉及炎症的退行性疾病的其他实例。对于这些中的大多数，没有可用的有效的治疗。针对其中一些疾病或障碍的治疗正在研究中。然而，建议的治疗通常非常昂贵，并且涉及重大的风险和并发症。因此，需要更好的方法来治疗退行性疾病，包括神经退行性疾病，例如ALS和TBI。
发明内容
本文提供了包含B细胞(例如，分离的、纯化的、或修饰的B细胞或其组合)的组合物及其用于治疗疾病(例如，如本文所述的神经退行性疾病、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓损伤(SCI)、以及炎性疾病和免疫疾病)的用途。
在第一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的对象中的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
在一些实施例中，神经退行性疾病选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。在一个优选的实施例中，神经退行性疾病是ALS(例如，散发性或家族性ALS)。在又一个优选的实施例中，神经退行性疾病是帕金森病。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有ALS的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的B细胞，其中所述治疗有效量是足以减轻或改善ALS的一个或多个症状的量。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗表现出ALS的一个或多个症状的患有ALS的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的B细胞，其中所述治疗有效量是导致减轻或改善ALS的一个或多个症状的量；监测对象中的一个或多个症状；并且当一个或多个症状开始恶化时，施用第二剂量的B细胞。
在一些实施例中，ALS的一个或多个症状包括难以抬起脚的前部；难以抬起脚趾；单腿或双腿无力；单脚或双脚无力；单踝关节或双踝关节无力；手无力；手笨拙；肌肉痉挛；一个或两个手臂、一条或两条腿、一个或两个肩膀中的或舌头的肌束颤动(肌肉抽搐)；肌肉痉挛；痉挛状态(紧绷和僵硬的肌肉)；以及咀嚼或下咽困难(吞咽困难)、说话或形成单词困难(构音障碍)、以及难以呼吸(呼吸困难)。
在一些实施例中，所述方法包括在施用后1至7天、施用后7至28天、施用后1至28周、施用后1至2个月、施用后2至6个月、施用后2至9个月、或施用后6个月至一年或更长时间监测ALS的一个或多个症状。
在一些实施例中，本发明的特征在于一种通过确定疾病进展的分子标志物的水平(例如，确定用治疗有效量的B细胞治疗前后神经退行性疾病进展的分子标志物的水平)，监测患有神经退行性疾病的患者对于用治疗有效量的分离的B细胞进行治疗的反应性的方法。可以根据本领域技术人员已知的方法确定分子标志物的水平。
在一些实施例中，可以从来自治疗的对象的样品，例如，来自治疗的对象的血浆或脑脊液(CSF)的样品中确定分子标志物的水平。本文所述的神经退行性疾病的进展的示例性分子标志物是本领域已知的。示例性标志物包括T-τ(总τ)、P-τ(超磷酸化τ)、Aβ42(淀粉样蛋白β42)、Aβ42/Aβ40的比率、YKL-40(几丁质酶-3样蛋白1)、VLP-1(视锥蛋白样蛋白1)、NFL(神经丝蛋白L)、pNFH(磷酸化神经丝重亚基)、Ng(神经颗粒蛋白)和UCH-L1(泛素C-末端水解酶)、TDP-43(TAR DNA结合蛋白43)、降低的α-突触核蛋白和/或降低水平的3,4-二羟基苯基乙酸酯(参见，例如Robey和Panegyres,Cerebrospinal fluid biomarkers inneurodegenerative disorders[神经退行性障碍中的脑脊液生物标志物]，FutureNeurol.[未来的神经学]14(1).(2019)，将其通过引用以其全文并入)。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的对象中的炎性疾病或免疫疾病的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
在一些实施例中，炎性疾病或免疫疾病选自囊性纤维化、心血管疾病(例如冠状动脉疾病或主动脉狭窄)、圆锥角膜、球形角膜、骨关节炎、骨质疏松症、肺动脉高压、色素性视网膜炎、和类风湿性关节炎。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有中枢神经系统(CNS)损伤的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的分离的B细胞。在一些实施例中，CNS损伤是创伤性脑损伤(TBI)或脊髓损伤(SCI)。在一些实施例中，CNS损伤包括TBI和SCI二者。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有创伤性脑损伤(TBI)的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗患有脊髓损伤(SCI)的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
在一些实施例中，TBI是由外部机械力引起的对脑的损伤。在一些实施例中，SCI涉及由外部机械力引起的对脊髓的损伤。在一些实施例中，TBI和/或SCI是由头部损伤或脑挫伤引起(例如，由跌倒、火器伤口、运动事故、建筑事故、车辆事故、或穿透对象的颅骨或脑的损伤引起)。在一些实施例中，患有TBI和/或SCI的对象患有多种身体、认知、社交、情绪和/或行为障碍中的一种或多种。TBI和SCI可能同时发生，并且可能由相同的损伤引起。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗表现出TBI的一个或多个症状的患有TBI的对象的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的B细胞，其中所述治疗有效量是导致减轻或改善TBI的一个或多个症状的量；监测对象中的一个或多个症状；并且当一个或多个症状开始恶化时，施用第二剂量的B细胞。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗(表现出SCI的一个或多个症状的)患有SCI的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的B细胞，其中所述治疗有效量是导致减轻或改善SCI的一个或多个症状的量；监测对象中的一个或多个症状；并且当一个或多个症状开始恶化时，施用第二剂量的B细胞。
在一些实施例中，TBI和/或SCI的一个或多个症状包括无法回忆创伤性事件、意识模糊、学习和记忆新信息困难、情感和执行功能障碍、说话连贯困难、不稳定、缺乏协调、和视觉或听觉的问题；认知问题(例如，健忘症、无法说话或理解语言、精神错乱、难以集中注意力、思考和理解困难、无法创造新记忆、或无法识别常见事物)；行为问题(例如，异常的笑和哭、攻击性、冲动、易怒、缺乏克制(冲动)、或持续重复的言语或行为)；情绪问题(例如，愤怒、焦虑、冷漠、或孤独)；全身问题(例如，黑蒙(blackout)、头晕、昏厥、或疲劳)；眼部问题(例如，瞳孔放大、浣熊眼、或瞳孔不等)；肌肉问题(例如，不稳定或肌肉僵硬)；胃肠道问题(例如，恶心或呕吐)；言语问题(例如，说话困难或言语不清)；视觉问题(例如，视力模糊或对光敏感)；瘀伤、抑郁、嗅觉丧失、神经损伤、创伤后癫痫发作、耳鸣、对声音敏感、眩晕。
在一些实施例中，所述方法包括在施用后1至7天、施用后7至28天、施用后1至28周、施用后1至2个月、施用后2至6个月、施用后2至9个月、或施用后6个月至一年或更长时间监测TBI和/或SCI的一个或多个症状。
在一些实施例中，本发明的特征在于一种通过确定疾病进展的分子标志物的水平(例如，确定用治疗有效量的B细胞治疗前后神经退行性疾病进展的分子标志物的水平)，监测患有TBI和/或SCI的患者对于用治疗有效量的分离的B细胞进行治疗的反应性的方法。可以根据本领域技术人员已知的方法确定分子标志物的水平。
在一些实施例中，可以从治疗的对象的样品，例如，来自治疗的对象的血浆或脑脊液(CSF)的样品中确定TBI和/或SCI的分子标志物的水平。本文所述的TBI进展的示例性分子标志物包括但不限于以下项的蛋白生物标志物：神经元细胞体损伤(UCH-L1，NSE)、星形胶质细胞损伤(GFAP，S100B)、神经元细胞死亡(αII-血影蛋白分解产物)、轴突损伤(NF蛋白)、白质损伤(MBP)、损伤后神经变性(总τ和磷酸-τ)、损伤后自身免疫性应答(脑抗原靶向自身抗体)(参见，例如，Wang等人，An update on diagnostic and prognosticbiomarkers for traumatic brain injury[创伤性脑损伤的诊断和预后生物标志物的研究进展]，Expert Rev Mol Diagn.[分子诊断学专家评论]18(2):165-180(2018)，将其通过引用以其全文并入)。
在一些实施例中，施用同种异体B细胞。在一些实施例中，同种异体B细胞是单倍体同种异体B细胞、HLA匹配的同种异体B细胞、或遗传修饰的B细胞(例如，已经遗传修饰的B细胞，例如通过CRISPR，以降低B细胞的免疫原性)。
在一些实施例中，施用自体B细胞。
在一些实施例中，施用异种B细胞。
在一些实施例中，所述方法包括施用第二治疗组合物。
在一些实施例中，其中所述疾病或障碍是ALS，第二治疗组合物是依达拉奉、利鲁唑、或免疫调节组合物(例如，抗CD14抗体、抗CDL40抗体、或包括Treg细胞的组合物)。
在一些实施例中，其中疾病或障碍是TBI和/或SCI，第二治疗组合物是抗生素或皮质类固醇(例如，泼尼松)。
在一些实施例中，B细胞是成熟的初始B细胞。
在一些实施例中，离体刺激B细胞。
在一些实施例中，用Toll样受体(TLR)激动剂离体刺激B细胞。
在一些实施例中，TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白(alpha A-crystallin)、和CpG染色质-IgG复合物。
在一些实施例中，TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉(例如咪喹莫特、瑞喹莫德、洛索立宾、溴匹立明)、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
在一些实施例中，用免疫调节细胞因子(例如促炎细胞因子，例如选自以下项的促炎细胞因子：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、或IFNγ)离体刺激B细胞。
在一些实施例中，B细胞是Breg细胞。在一些实施例中，Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。在一些实施例中，Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。在一些实施例中，Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。在一些实施例中，Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。在一些实施例中，Breg细胞表达CD25和CD71。在一些实施例中，Breg细胞并不表达CD73。在一些实施例中，Breg细胞包括至少80％(例如，至少85％、90％、95％、或98％)CD19+B细胞。在一些实施例中，Breg细胞包括小于10％(例如小于5％)CD138+血浆B细胞。
在一些实施例中，B细胞具有神经保护作用、抗炎作用、和/或免疫调节作用。
在一些实施例中，将B细胞配制成局部或全身施用。在一些实施例中，将B细胞配制成静脉内、动脉内、皮下、鞘内、或脑实质内施用。在一些实施例中，将B细胞配制成通过静脉内输注或静脉内推注施用。在一些实施例中，将B细胞配制成通过颅内颅压(ICP)监测导管进行施用。
在一些实施例中，每天一次、每周一次、每周两次、每14天一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、或每年一次施用B细胞。
在一些实施例中，B细胞被施用至少两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、或十次。
在一些实施例中，治疗有效量的B细胞包括每次施用至少0.5X 106个B细胞、每次施用0.5X 107个B细胞、每次施用1x 108个B细胞、每次施用至少2x 108个B细胞、或每次施用至少1x 109个B细胞。在一些实施例中，治疗有效量的B细胞包括每次施用1x 108个B细胞至1x 109个B细胞、每次施用1x 108个B细胞至5x 108个B细胞、或每次施用2x 108个B细胞至4x108个B细胞。
在另一方面，本发明的特征在于包含修饰的B细胞和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中修饰的B细胞已经用Toll样受体(TLR)激动剂和/或免疫调节细胞因子离体刺激。
在一些实施例中，修饰的B细胞是原代细胞。
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是水溶液(例如盐水溶液)。
在另一方面，本发明的特征在于一种治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用包含修饰的B细胞和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中修饰的B细胞已经用Toll样受体(TLR)激动剂和/或免疫调节细胞因子离体刺激。
在一些实施例中，疾病或病症选自异常伤口愈合(例如，糖尿病伤口愈合)、神经退行性疾病、TBI、或SCI。或者是免疫疾病或炎性疾病。
在一些实施例中，神经退行性疾病选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。
在一些实施例中，免疫疾病或炎性疾病选自囊性纤维化、心血管疾病(例如冠状动脉疾病或主动脉狭窄)、圆锥角膜、球形角膜、骨关节炎、骨质疏松症、肺动脉高压、色素性视网膜炎、和类风湿性关节炎。
在一些实施例中，修饰的B细胞是同种异体B细胞。在一些实施例中，同种异体B细胞是单倍体同种异体B细胞、HLA匹配的同种异体B细胞、或遗传修饰的B细胞(例如，已经遗传修饰的B细胞，例如通过CRISPR，以降低B细胞的免疫原性)。
在一些实施例中，修饰的B细胞是自体B细胞。
在一些实施例中，修饰的B细胞是异种B细胞。
在另一方面，本发明的特征在于一种产生修饰的B细胞的方法，所述方法包括：
i)从对象中分离成熟的初始B细胞，和
ii)用Toll样受体(TLR)激动剂和/或免疫调节细胞因子离体刺激B细胞，
由此产生修饰的B细胞。
在一些实施例中，步骤i)进一步包括分离CD19+成熟的初始B细胞。在一些实施例中，通过用CD19抗体或其抗原结合片段进行免疫沉淀来分离CD19+成熟的初始B细胞。在一些实施例中，CD19抗体或其抗原结合片段保持与修饰的B细胞结合。
在一些实施例中，TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。
在一些实施例中，TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉(例如咪喹莫特、瑞喹莫德、洛索立宾、溴匹立明)、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
在一些实施例中，免疫调节细胞因子是促炎细胞因子(例如选自以下项的促炎细胞因子：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、或IFNγ)。
在一些实施例中，修饰的B细胞是Breg细胞。在一些实施例中，Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。在一些实施例中，Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。在一些实施例中，Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。在一些实施例中，Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。在一些实施例中，Breg细胞表达CD25和CD71。在一些实施例中，Breg细胞并不表达CD73。
在一些实施例中，修饰的B细胞具有神经保护作用、抗炎作用、和/或免疫调节作用。
仍在其他实施例中，本发明的特征在于可以在多种疾病背景下(包括皮肤伤口和溃疡、肌肉和心脏损伤、脑和脊髓损伤、和各种内脏器官的病变)直接用作抗炎和促再生的基于细胞的治疗剂的B细胞。基因修饰的自体、同种异体或异种细胞或用来自损伤的微环境的因子引发的细胞是有用的，因其具有提高的促再生效率。在这些独特条件下源自B细胞的因子，包括抗体、细胞因子和生长因子，以及microRNA和其他小分子，也可以被纯化并直接应用于损伤的组织以加速愈合。
因此，B细胞可用作患有神经退行性疾病、TBI或SCI(例如，由脑挫伤引起)、炎性障碍、或多种免疫疾病的患者的治疗策略。与任何其他现有的基于细胞的疗法不同，B细胞可以很容易地从外周血或其他血库产品中获得，这是开发快速现成治疗剂的重要优势。事实上，快速、最少操作的B细胞疗法(同种异体或自体或异种)高度可转化到临床环境中。这不仅在治疗神经退行性疾病(例如ALS和PD)中尤其如此，而且在严重的脑部病变中也是，其中通常进行手术以去除血肿或穿透性骨碎片，并且放置脑实质内或脑室内导管以监测颅内压，从而为B细胞进入损伤的脑提供了一种方便的施用途径。
与用于治疗的其他细胞类型(例如干细胞)不同，B淋巴细胞是成熟的终末分化细胞，在体内的自然寿命有限，为5-6周。它们在神经退行性背景以及脑挫伤的被破坏微环境中的应用有望在甚至更短的时间内消除移植的细胞。这是有利的，因为移植细胞的更长存活可能代表一个重要的安全问题，特别是考虑到中枢神经系统的微环境包含多种B细胞营养因子。
我们的结果说明了第一个原理验证观察结果，即成熟的外周分离的B细胞代表了一种针对本文披露的若干种疾病(包括ALS、PD、TBI、和SCI)的安全、快速、和有效的基于细胞的治疗策略，对于这些疾病，目前不存在改善神经系统结果的治疗选择。
本发明的其他目的、特征与优点从以下详细的说明中将会变得清楚。然而，应当理解，这种详细说明和这些具体实例虽然指示了本发明的优选的实施例，但它们仅仅是通过说明的方式给出的，因为从这种详细说明在本发明的范围和精神内的不同变化和修改对于本领域的那些普通技术人员而言将变得很清楚。
本文所述的技术和方法的一些实施例根据以下编号段落中的任一项进行定义。
1.一种治疗有需要的对象中的神经退行性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
2.如段落1所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。
3.如段落1所述的方法，其中施用同种异体B细胞。
4.如段落1所述的方法，其中施用自体B细胞。
5.如段落1所述的方法，进一步包括施用第二治疗组合物。
6.如段落5所述的方法，其中所述第二治疗组合物是依达拉奉或利鲁唑。
7.如段落6所述的方法，其中所述第二治疗组合物是免疫调节组合物。
8.如段落1-7中任一项所述的方法，其中所述B细胞是成熟的初始B细胞。
9.如段落1-8中任一项所述的方法，其中离体刺激B细胞。
10.如段落1-9中任一项所述的方法，其中用Toll样受体(TLR)激动剂刺激所述B细胞。
11.如段落10所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。
12.如段落10所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
13.如段落1-12中任一项所述的方法，其中所述B细胞是Breg细胞。
14.如段落13所述的方法，其中所述Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。
15.如段落14所述的方法，其中所述Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。
16.如段落13-15中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。
17.如段落16所述的方法，其中所述Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。
18.如段落16所述的方法，其中所述Breg细胞表达CD25和CD71。
19.如段落13-18中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞并不表达CD73。
20.如段落13-15中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞包含至少80％CD19+B细胞。
21.如段落13-15或20中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞包含小于10％CD138+血浆B细胞。
22.如段落1-21中任一项所述的方法，其中所述B细胞是神经保护性的。
23.如段落1-22中任一项所述的方法，其中所述B细胞是抗炎的。
24.如段落1-23中任一项所述的方法，其中所述B细胞是免疫调节的。
25.如段落1-24中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成局部施用。
26.如段落1-24中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成全身施用。
27.如段落1-24中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成静脉内、动脉内、皮下、鞘内、或脑实质内施用。
28.如段落27所述的方法，其中将B细胞配制成通过静脉内输注或静脉内推注施用。
29.如段落1-28中任一项所述的方法，其中每天一次、每周一次、每周两次、每14天一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、或每年一次施用所述B细胞。
30.如段落1-29中任一项所述的方法，其中所述B细胞被施用至少两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、或十次。
31.如段落1-30中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少1x108个B细胞。
32.如段落1-30中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少2x108个B细胞。
33.如段落1-30中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少1x109个B细胞。
34.一种治疗患有创伤性脑损伤(TBI)的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的分离的B细胞。
35.如段落34所述的方法，其中TBI是由头部损伤、或脑挫伤引起。
36.如段落34所述的方法，其中所述对象患有多种身体、认知、社交、情绪和/或行为障碍中的一种或多种。
37.如段落34所述的方法，其中施用同种异体B细胞。
38.如段落34所述的方法，其中施用自体B细胞。
39.如段落34所述的方法，进一步包括施用第二治疗组合物。
40.如段落39所述的方法，其中所述第二治疗组合物是抗生素或皮质类固醇。
41.如段落34-40中任一项所述的方法，其中所述B细胞是成熟的初始B细胞。
42.如段落34-41中任一项所述的方法，其中离体刺激B细胞。
43.如段落34-42中任一项所述的方法，其中用Toll样受体(TLR)激动剂刺激所述B细胞。
44.如段落43所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。
45.如段落43所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
46.如段落34-45中任一项所述的方法，其中所述B细胞是Breg细胞。
47.如段落46所述的方法，其中所述Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。
48.如段落47所述的方法，其中所述Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。
49.如段落46-48中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。
50.如段落49所述的方法，其中所述Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。
51.如段落49所述的方法，其中所述Breg细胞表达CD25和CD71。
52.如段落46-51中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞并不表达CD73。
53.如段落46-48中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞包含至少80％CD19+B细胞。
54.如段落46-48或53中任一项所述的方法，其中所述B细胞包含小于10％CD138+血浆B细胞。
55.如段落34-54中任一项所述的方法，其中所述B细胞是神经保护性的。
56.如段落34-55中任一项所述的方法，其中所述B细胞是抗炎的。
57.如段落34-56中任一项所述的方法，其中所述B细胞是免疫调节的。
58.如段落34-57中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成局部施用。
59.如段落34-57中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成全身施用。
60.如段落34-57中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成静脉内、动脉内、皮下、鞘内、或脑实质内施用。
61.如段落60所述的方法，其中将B细胞配制成通过静脉内输注或静脉内推注施用。
62.如段落34-57中任一项所述的方法，其中将所述B细胞配制成通过颅内颅压(ICP)监测导管进行施用。
63.如段落34-62中任一项所述的方法，其中每天一次、每周一次、每周两次、每14天一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、或每年一次施用所述B细胞。
64.如段落34-63中任一项所述的方法，其中所述B细胞被施用至少两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、或十次。
65.如段落34-63中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少1x108个B细胞。
66.如段落34-63中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少2x108个B细胞。
67.如段落34-63中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括每次施用至少1x109个B细胞。
68.一种包含修饰的B细胞和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中修饰的B细胞已经用Toll样受体(TLR)激动剂和/或免疫调节细胞因子离体刺激。
69.如段落68所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。
70.如段落68所述的药物组合物，其中所述TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
71.如段落68所述的药物组合物，其中所述免疫调节细胞因子是促炎细胞因子。
72.如段落71所述的药物组合物，其中所述促炎细胞因子选自：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、或IFNγ。
73.如段落68-72中任一项所述的药物组合物，其中修饰的B细胞是原代细胞。
74.如段落68-73中任一项所述的药物组合物，其中修饰的B细胞是Breg细胞。
75.如段落74所述的药物组合物，其中所述Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。
76.如段落75所述的药物组合物，其中所述Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。
77.如段落74-76中任一项所述的药物组合物，其中所述Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。
78.如段落77所述的药物组合物，其中所述Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。
79.如段落77所述的药物组合物，其中所述Breg细胞表达CD25和CD71。
80.如段落74-79中任一项所述药物组合物，其中所述Breg细胞并不表达CD73。
81.如段落68-80中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的B细胞是神经保护性的。
82.如段落68-81中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的B细胞是抗炎的。
83.如段落68-82中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的B细胞是免疫调节的。
84.如段落68-83中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是水溶液。
85.一种治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，所述方法包括向对象施用如段落68-84中任一项所述的药物组合物。
86.如段落85所述的方法，其中所述疾病或病症是异常伤口愈合。
87.如段落85所述的方法，其中所述疾病或病症是神经退行性疾病。
88.如段落87所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。
89.如段落85所述的方法，其中所述疾病或病症是创伤性脑损伤(TBI)。
90.如段落85所述的方法，其中所述疾病或病症选自囊性纤维化、心血管疾病、圆锥角膜、球形角膜、骨关节炎、骨质疏松症、肺动脉高压、色素性视网膜炎、和类风湿性关节炎。
91.如段落85-90中任一项所述的方法，其中所述修饰的B细胞是同种异体B细胞。
92.如段落85-91中任一项所述的方法，其中所述修饰的B细胞是自体B细胞。
93.一种产生修饰的B细胞的方法，所述方法包括：
i)从对象中分离成熟的初始B细胞，和
ii)用Toll样受体(TLR)激动剂和/或免疫调节细胞因子离体刺激B细胞，
由此产生修饰的B细胞。
94.如段落93所述的方法，其中步骤i)进一步包括分离CD19+成熟的初始B细胞。
95.如段落94所述的方法，通过用CD19抗体或其抗原结合片段进行免疫沉淀来分离CD19+成熟的初始B细胞。
96.如段落95所述的方法，其中所述CD19抗体或其抗原结合片段保持与修饰的B细胞结合。
97.如段落93所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的内源性配体：热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。
98.如段落93所述的方法，其中所述TLR激动剂是选自以下项的外源性配体：Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
99.如段落93所述的方法，其中所述免疫调节细胞因子是促炎细胞因子。
100.如段落99所述的方法，其中所述促炎细胞因子选自：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TNFα、或IFNγ。
101.如段落93-100中任一项所述的方法，其中修饰的B细胞是Breg细胞。
102.如段落101所述的方法，其中所述Breg细胞表达免疫调节细胞因子IL-10。
103.如段落102所述的方法，其中所述Breg细胞进一步表达选自以下项的一种或多种另外的免疫调节细胞因子：IL-2、IL-4、IL-6、IL-35、TNF-α、TGFβ、PD-L1 FasL、和TIM1。
104.如段落101-103中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞表达选自以下项的一种或多种细胞表面标志物：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。
105.如段落105所述的方法，其中所述Breg细胞表达B220、CD19、CD20、CD24、CD138、IgM、和IgD。
106.如段落105所述的方法，其中所述Breg细胞表达CD25和CD71。
107.如段落101-106中任一项所述的方法，其中所述Breg细胞并不表达CD73。
108.如段落93-107中任一项所述的方法，其中修饰的B细胞是神经保护性的。
109.如段落93-108中任一项所述的方法，其中修饰的B细胞是抗炎的。
110.如段落93-109中任一项所述的方法，其中修饰的B细胞是免疫调节的。
附图说明
图1A-图1B显示了B细胞应用诱导伤口的分子微环境的复杂变化。图1A是野生型鼠伤口模型中，伤口愈合的主要阶段的平均持续时间的示意图。图1B显示了热图，总结了响应于B细胞应用而显著改变表达的蛋白随时间的表达动态。总共213种蛋白，其代表与B细胞治疗相关的显著改变蛋白的聚集体(n＝111；p<0.05，未配对t检验)，以及那些在每个时间点具有高倍数变化的蛋白(前20个上调或下调的蛋白)，无论显著性水平如何(n＝112)，都根据与伤口愈合相关的过程进行分类。热图显示了在损伤后第0、1、4、10天，B细胞治疗后倍数变化表达。红色＝上调；绿色＝下调。特别值得注意的是，在损伤后第4天，与炎症和炎性细胞相关的多种蛋白的下调，以及在损伤后第4-10天，与细胞增殖、防止细胞凋亡(细胞死亡)和氧化应激、以及组织重塑(毛囊和肌肉的形成)相关的蛋白的大量上调。
图2A-图2H显示了在用盐水(对照，常规伤口愈合)或B细胞治疗后的伤口中，功能家族随时间变化的蛋白的平均表达。此分析说明了B细胞作为体内平衡剂的整体效果，而不是蛋白表达的诱导剂或抑制剂。B细胞应用与维持稳定的蛋白(这些蛋白在损伤和愈合过程期间通常会下降或增加)表达水平相关，这显著降低在正常愈合过程中观察到的炎性峰值，防止抗凋亡因子(箭头)和氧化应激保护剂的减少，并且增加增殖(图2A-图2B)，减少抗氧化应激保护剂和细胞增殖的下降，并且维持细胞迁移保持在更低水平(图2C-图2D)，维持与重塑和二级皮肤结构相关的蛋白的稳定水平(图2E-图2F)，降低在对照中损伤早期阶段观察到的蛋白降解和自噬的水平，以及增加与在愈合的后期阶段的血管生成和神经再生相关的蛋白的水平(图2G-图2H)。
图3显示了B细胞应用在急性伤口愈合中的体内评估的实验范例。在野生型C57Bl6小鼠的背部皮肤中总共产生4个全层病变，并且将从同基因动物中纯化的成熟的初始B细胞直接施加在伤口床上。对照动物接受盐水施加。作为内部对照，还在完整皮肤下，皮下注射B细胞或盐水对照，以提供类似的微环境而不会造成损伤。在限定的存活时间后，收集、解离、并且处理伤口或皮肤未损伤组织以进行流式细胞术分析。右侧的散点图显示了每个治疗类别的细胞悬液的典型分布。伤口样品显示了特征性的白细胞流入(白色空心箭头)，这在未损伤的组织中基本不存在。尽管在任一位置都很少典型地存在B细胞，但是在实验应用后很容易大量检测到它们(红色箭头)。
图4显示了经由流式细胞术对B细胞处理的和对照的伤口细胞悬液进行的门控策略和分析。活细胞分为3个主要类别：B细胞(CD19+/B220+淋巴细胞)；非B细胞白细胞(CD140a-/B220-白细胞)，其包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞、树突细胞和T细胞的混合物；以及成纤维细胞(CD140a+/B220-)。评估这些细胞类别的激活和细胞因子产生的标志物。
图5显示了在定义的暴露于伤口微环境的间隔后，从伤口床上回收的B细胞中激活标志物和关键细胞因子的动态。B细胞在体内暴露于伤口微环境，或被注射在未损伤的皮肤下(对照等效位置)。为了比较，显示了在分离后立即在冰上维持相同持续时间的对照B细胞。在包括18小时、2天、4天和10天的时间间隔后，用布雷菲德菌素A处理伤口4小时以诱导细胞内细胞因子的保留。然后通过切除和解离组织回收B细胞，并且通过流式细胞术进一步表征表面标志物和细胞内细胞因子。暴露于伤口微环境的B细胞瞬时上调多种免疫调节细胞因子，在施加后2天达到峰值。一些免疫调节细胞因子，包括TGFβ和IL-6，在第4天时保持升高，并且IL-10则保持升高长达10天。N＝3-6个动物/组。
图6是暴露于伤口微环境、皮下对照、或维持在冰上(未暴露)的B细胞中每种标志物的平均值的热图总结。
图7显示了伤口中聚集的浸润性非B细胞白细胞中激活标志物和关键细胞因子的动态。总之，当伤口中存在B细胞时，浸润性白细胞产生更多的抗炎细胞因子IL-10、TGFβ和IL-35，以及更少的促炎TNFα和IL-2。这种影响在损伤和B细胞应用后第4天最为明显，并且持续长达10天。N＝3-6个动物/组。
图8是伤口微环境中浸润性非B细胞白细胞中每种标志物的平均值的热图总结，说明了在B细胞存在下，抗炎细胞因子(IL-10和TGFβ)产生增加的模式。
图9显示了伤口和皮下组织的CD140a+成纤维细胞群中激活标志物和关键细胞因子的动态。当伤口暴露于B细胞时，伤口中的成纤维细胞在损伤后第10天产生显著更多的IL-10和TGFβ。此外，在损伤后第4天和10天，当施加B细胞时，伤口成纤维细胞产生更少的促炎细胞因子TNFα。
图10是用B细胞或盐水溶液处理的伤口和皮下组织中，成纤维细胞中每种标志物的平均值的热图总结。成纤维细胞是伤口愈合中抗炎和促再生因子的最重要来源之一，并且无论治疗如何，都会产生高水平的IL-10和TGFβ。然而，在损伤后第4天和第10天，来自用B细胞处理的伤口的成纤维细胞继续产生更高水平的IL-10和TGFβ，而在盐水处理的伤口中，这些抗炎细胞因子的水平下降。有趣的是，在伤口成纤维细胞中，促炎细胞因子(包括IL-6和TNFα)的减少中观察到B细胞施加的显著效果。
图11显示了功能性TLR信号传导以及IL-10产生是伤口愈合中外源性B细胞的再生功能的必要组分。在第0天用缺乏常见TLR信号传导衔接子髓样分化因子88(MyD88)、IL-10或WT B细胞的B细胞处理全层切除伤口(此处在愈合的第6天进行说明)作为对照。在每个测试动物中也包括盐水作为内部对照。尽管WT B细胞在WT动物中持续加速伤口闭合2-3天，但是MyD88-/-或IL-10-/-B细胞对伤口闭合没有益处，类似于盐水施加。
图12显示了皮肤伤口样品中表达的鉴定的蛋白的无监督分级聚类分析。分析中仅包括在所有样品中始终存在的鉴定的蛋白。(A)使用所有B细胞和盐水处理的动物的伤口中一致表达的完全连锁的3809种蛋白(行)，在损伤后4个不同时间点(列)分级聚类。伪色标度描绘了每种蛋白的归一化、对数转换倍数变化表达值。树状图显示了源自此分析的15个蛋白聚类，其中(A)中每个细胞的颜色映射到相应时间点处的聚类的平均表达值。蛋白按其随时间变化的表达模式聚类。(B)来自(A)的分级聚类的热图，显示了所有3809种蛋白。(C)15个分级聚类的基因本体分析。来自QuickGO公司的小鼠GOslim基因列表(可从https://www.ebi.ac.uk/QuickGO访问)用于探测15个分级聚类。条形图显示了每个聚类的顶级生物功能类别。
图13显示了在伤口愈合期间，每个评估时间点，响应于B细胞处理的显著改变的蛋白的分布。
图14显示了用于评估B细胞施加对挫伤TBI后功能(行为)和组织学恢复的影响的实验范例。成年雄性C57BL/6J小鼠被麻醉，并且在左侧顶颞叶皮层上方进行5-mm圆形开颅手术，并且移除骨瓣。就在受到损伤之前，将2×106个B细胞的单次输注通过脑实质内递送到同侧半球中。然后对小鼠进行CCI或假损伤处理。恢复后，使用多种测定评估运动功能、运动和空间学习和记忆表现、焦虑、和抑郁样行为。在行为测试结束时(第35天)，将动物安乐死，并且收集脑用于评估总病变体积。
图15显示了急性B细胞处理对前庭运动功能和纹状体学习的影响。(A)转棒仪评估显示了在CCI时施用的B细胞的显著保护作用。值得注意地，在B细胞处理的小鼠以及假病变动物中，重复试验的跌倒的延迟增加，表明有运动学习的成分。在用T细胞或盐水处理的对照中，没有观察到这种改善。第二次试验后，在接受B细胞处理的CCI损伤小鼠和假病变的B细胞处理的动物之间没有观察到显著差异。(B)使用拉线器测定对损伤后的前庭运动恢复进行评估，显示与假病变对照相比，损伤具有显著影响，然而，在损伤小鼠的处理条件之间没有观察到统计学上的显著差异。数据是平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。CCI+B细胞，n＝12个小鼠；CCI+T细胞，n＝12个小鼠；CCI+盐水，n＝12个小鼠；假处理的+B细胞，n＝10个小鼠；假处理的+盐水，n＝10个小鼠。
图16显示了单一急性B细胞施加对学习和记忆的影响。(A-D)莫里斯水迷宫评估。学习曲线显示了用B细胞处理的CCI小鼠比盐水处理的CCI动物有显著改善(p<0.05)。在第三次试验后，在B细胞处理的受伤动物和任一假病变情况之间没有观察到显著差异(p>0.98)(A)。可见平台试验显示了有或无损伤的处理条件之间没有差异(B)。(C)探测试验显示，B细胞处理的CCI损伤动物在目标象限中花费了高于机会的时间，与假病变小鼠没有显著差异。相比之下，用T细胞或盐水处理的对照CCI损伤小鼠仅花费机会水平时间探索目标象限，并且与假病变动物差异显著(p<0.05)。虚线表示机会水平。(D)探测试验期间的代表性游泳路径追踪表明CCI-B细胞小鼠以及两个假手术组中的空间搜索模式，而CCI小鼠在T细胞和盐水组中采用了非空间策略。(E)Y迷宫评估短期学习和记忆。B细胞处理的CCI小鼠的交替评分显著高于损伤的T细胞或盐水处理组，表现与假手术组类似。所有数据都显示为平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。CCI+B细胞，n＝12个小鼠；CCI+T细胞，n＝12个小鼠；CCI+盐水，n＝12个小鼠；假处理的+B细胞，n＝10个小鼠；假处理的+盐水，n＝10个小鼠。
图17显示了B细胞处理对CCI后焦虑和抑郁样行为的影响。(A)焦虑样行为的高架十字迷宫测定。除了在损伤时接受B细胞的CCI损伤小鼠与接受相同数量的T细胞的动物之间，在闭合臂上花费的时间略有不同外，在处理组之间没有观察到总体显著差异(*p<0.05)。(B)抑郁样行为的强迫游泳测定。在此测定中没有观察到病变或处理的影响。所有数据都显示为平均值±SEM。*p<0.05。CCI+B细胞，n＝12个小鼠；CCI+T细胞，n＝12个小鼠；CCI+盐水，n＝12个小鼠；假处理的+B细胞，n＝10个小鼠；假处理的+盐水，n＝10个小鼠。
图18显示了B细胞处理对CCI后组织学结果的影响。(A)在损伤后第35天穿过病变部位的代表性冠状切片。在B细胞处理的动物中，一部分海马体通常在病变的半球中幸免(箭头)。显示的切片位于距前囟点大约2.2mm处。(B)与盐水和T细胞对照相比，在TBI后第35天，用B细胞处理的小鼠中脑病变的总体积显著减少了40％-60％。(C)沿着脑的头尾之间轴线的横向脑切片中的病变区域。结果表明，在接受B细胞处理的病变脑中，病变大小持续减小。(D)与任一CCI对照相比，在B细胞处理的动物中，损伤半球中幸免的海马体的总体积显著更高。所有数据都显示为平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。CCI+B细胞，n＝12个小鼠；CCI+T细胞，n＝12个小鼠；CCI+盐水，n＝12个小鼠；假处理的+B细胞，n＝10个小鼠；假处理的+盐水，n＝10个小鼠。
图19显示了B细胞处理对神经胶质过多症和小胶质细胞激活的影响。(A-D)共聚焦图像显示，在CCI后并且用盐水(A)、B细胞(B)、T细胞(C)中的任一项处理，或在盐水处理的假损伤对照(D)中，第35天时损伤的内侧方面的概述中，GFAP和CD68的免疫标记。(E)GFAP免疫染色覆盖的区域的定量分析显示，与盐水或T细胞处理的CCI对照相比，用B细胞处理的损伤动物的反应性星形胶质细胞增生显著减少。(F)CD68免疫染色的定量分析显示，与盐水处理的CCI对照相比，在CCI后用T细胞或B细胞处理的动物中，CD68的存在显著减少。n＝每个动物4个成像视野。所有数据都显示为平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
图20显示了脑中的B细胞存活和持久性。(A)WT C57Bl6/J小鼠在CCI和脑实质内施加5x 106个Bluc细胞后的多个时间点的活体成像的代表性实例。(B)来自头部CCI损伤部位(n＝6个小鼠)处的发光表明，在施加后，细胞原位存活长达大约14天，其中在第7天后活细胞的数量显著减少。[p/s]＝每秒的光子。
图21显示了CCI后损伤部位的B细胞定位。(A)在脑实质内注射和CCI后，在损伤部位，可以立即将预先标记的B细胞可视化。黑色方块表明B中成像的区域。(B)通过病变部位的冠状切片的共聚焦显微镜图像，显示B220+B细胞聚类在注射部位(箭头)。Ki67免疫标记表明，在损伤后没有立即观察到细胞增殖。(C)在B细胞注射和CCI后四天，仍然可以在损伤部位观察到标记的B细胞，尽管与注射后立即看到的相比，这个时间点的活体染色着色强度已经减弱。黑色方块表明D中成像的区域。(D)在损伤和B细胞施用后四天，穿过注射部位的冠状切片的共聚焦图像。仍然可以发现大量聚类在损伤部位处的B220+B细胞。在整个区域可以观察到大量的细胞增殖，然而没有观察到B220和Ki67的共染色。(E)D中框出的区域的放大视图。(F)在假病变动物中，通过星形胶质瘢痕概括，处理后第35天，仍然可以找到穿过皮层的针迹。此时在原始注射部位没有观察到B220+B细胞。(G)F中框出的区域的高倍率共聚焦图像。在所有共聚焦图像中，细胞核都用DAPI复染。n＝每个时间点4个动物。
图22显示了实验设计的概述。体重和神经评分评估每周进行两次，在一天的同一时间，由一个对处理条件不知情(盲)的实验者进行。
图23显示了每周两次测量的B细胞和盐水处理组中，随时间的归一化体重(每个动物个体在第76天的值的百分比)。所述图显示了归一化体重和存活的综合度量，其中死亡个体接受的体重值为0。我们观察到每个处理组中，非携带者对照动物和SOD1转基因动物之间的体重预期差异。在非携带者对照动物中，不论处理如何，在研究过程中均观察到体重逐渐增加。结果还表明，接受B细胞的转基因SOD1动物的下降延迟(箭头)。N＝32/处理条件。
图24A和图24B显示了在SOD1-G93A动物中，峰值体重的分析。A.生存图表明，动物达到其峰值体重的时间点。B.达到峰值体重的时间表明，用B细胞处理显著延迟了麻痹症状的发作。统计：A：Gehan-Breslow-Wilcoxon检验；B：未配对t检验。N＝32个动物/组。
图25显示了随时间变化的神经评分值。神经系统评分和存活的综合图，其中死亡的个体在达到4的神经评分后，在研究的剩余持续时间内进一步分配的值为4。在用B细胞处理的动物中，典型地在转基因SOD1动物中观察到的神经评分值的增加减缓，特别是在疾病进展的早期阶段中(橙色方块)。统计：使用Tukey事后校正进行多重比较的双向ANOVA。
图26显示转基因SOD1-G93A动物的存活分析。神经评分达到4(完全麻痹)的动物被认为是死于ALS。与盐水对照处理(N＝32个动物/组)相比，用初始B细胞处理显著延长了存活。统计：(左)：Gehan-Breslow-Wilcoxon检验；(右)：单向ANOVA。N＝32个动物/组。
图27显示了腰脊髓中的终点运动神经元评估。A，B：腰脊髓切片用H&E染色，并且所有运动神经元(大细胞体，至少一个核仁)以及显示损伤/变性的形态特征的受损异常神经元(箭头)由对治疗不知情(盲)的实验者计数。C：转基因动物中的运动神经元的总数显著减少，但是与此组内的处理没有差异。D：当专门分析变性、固缩运动神经元的百分比时，B细胞处理的显著益处变得明显。统计：(左)：双向ANOVA；(右)：未配对t检验。N＝19-24个动物/组。请注意，不可能在所有测试动物中收集组织样品。
具体实施方式
现在将仅使用以下定义和实例通过参考的方式详细描述本发明。本文引用的所有专利和出版物均通过引用明确并入。除非本文另外定义，否则在此所使用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是描述了优选的方法和材料。数字范围包括限定范围的数字。
本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施例的限制，本发明的各个方面或实施例可以通过参考说明书(作为整体)而获得。因此，通过参考说明书(作为整体)来更完整地定义以下即将定义的术语。
定义
如本文所使用的，术语“神经退行性疾病”是指特征在于神经元的结构或功能的进行性丧失(包括例如中枢神经系统(CNS)中的神经元的死亡)的神经疾病、障碍、或病症。出现了许多相似之处，将这些疾病在亚细胞水平上相互关联起来。此外，不同的神经退行性障碍之间存在许多相似之处，包括非典型蛋白组装以及诱导的细胞死亡。神经变性可以在范围从分子到系统的许多不同水平的神经元回路中找到。神经变性可以通过疾病进展的以下分子标志物来表征：例如：T-τ(总τ)、P-τ(超磷酸化τ)、Aβ42(淀粉样蛋白β42)、Aβ42/Aβ40的比率、YKL-40(几丁质酶-3样蛋白1)、VLP-1(视锥蛋白样蛋白1)、NFL(神经丝蛋白L)、pNFH(磷酸化神经丝重亚基)、Ng(神经颗粒蛋白)和UCH-L1(泛素C-末端水解酶)、TDP-43(TARDNA结合蛋白43)、降低的α-突触核蛋白和/或降低水平的3,4-二羟基苯基乙酸酯(参见，例如Robey和Panegyres,Cerebrospinal fluid biomarkers in neurodegenerativedisorders[神经退行性障碍中的脑脊液生物标志物]，Future Neurol.[未来神经学]14(1).(2019)，将其通过引用以其全文并入)。示例性神经退行性障碍包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。
如本文所使用的，术语“中枢神经系统(CNS)损伤”是指破坏脑和/或脊髓的正常功能的损伤。如本文所述的，CNS损伤可能由外部机械力引起。CNS损伤包括创伤性脑损伤(TBI)和/或脊髓损伤(SCI)。
如本文所使用的，术语“创伤性脑损伤(TBI)”是指由于外部机械力导致的脑的正常功能的破坏。例如，TBI可以由头部损伤或脑挫伤引起(例如，由跌倒、火器伤口、运动事故、建筑事故、车辆事故、或穿透对象的颅骨或脑的损伤引起)。根据本领域技术人员已知的临床指南来诊断TBI。TBI可以进一步通过疾病进展的分子标志物来表征，例如以下项的蛋白生物标志物：神经元细胞体损伤(UCH-L1，NSE)、星形胶质细胞损伤(GFAP，S100B)、神经元细胞死亡(αII-血影蛋白分解产物)、轴突损伤(NF蛋白)、白质损伤(MBP)、损伤后神经变性(总τ和磷酸-τ)、损伤后自身免疫性应答(脑抗原靶向自身抗体)(参见，例如，Wang等人，Anupdate on diagnostic and prognostic biomarkers for traumatic brain injury[创伤性脑损伤的诊断和预后生物标志物的研究进展]，Expert Rev Mol Diagn.[分子诊断学专家评论]18(2):165-180(2018)，将其通过引用以其全文并入)。TBI可能与SCI并发，并且可能由相同的伤害或事故引起。
如本文所使用的，术语“脊髓损伤(SCI)”是指由于外部机械力导致的脊髓的损伤。例如，SCI可以由脊髓损伤或脊髓挫伤引起(例如，由跌倒、火器伤口、运动事故、建筑事故、车辆事故、或穿透对象的脊髓的损伤引起)。根据本领域技术人员已知的临床指南来诊断SCI。SCI可能与TBI并发，并且可能由相同的伤害或事故引起。
如本文所使用的，术语“炎性疾病”或“免疫疾病”是指疾病的病因、发病机制、进展、或症状学具有炎性或免疫方面因素的疾病、障碍、或病症。例如，炎性障碍或免疫障碍可以包括炎性或免疫途径的失调和/或对刺激的异常炎性或免疫应答。示例性炎性障碍或免疫障碍包括囊性纤维化、心血管疾病、圆锥角膜、球形角膜、骨关节炎、骨质疏松症、肺动脉高压、色素性视网膜炎、和类风湿性关节炎。
如本文所使用的，术语“神经保护性的”是指防止、抑制、或减少神经元细胞死亡的特性。例如，神经保护性组合物或方法可以通过与神经退行性障碍、TBI、或SCI相关的症状的改变(例如，减少)表征。可替代地，神经保护性组合物或方法可以通过其对疾病的分子标志物(例如本文针对神经退行性障碍、TBI、或SCI描述的那些)的影响来表征。
如本文所使用的，术语“抗炎的”是指防止、抑制、或减轻炎症的特性。例如，抗炎的组合物或方法可以通过与炎性障碍相关的症状的改变(例如，减少)表征。可替代地，抗炎的组合物或方法可以通过炎性标志物的减少(例如促炎细胞因子的减少)或抗炎标志物的增加(例如抗炎细胞因子的增加)表征。
如本文所使用的，术语“免疫调节”是指启动或改变(例如，增加或降低)参与免疫应答的细胞的活性的特性。免疫调节组合物或方法可以增加参与免疫应答的细胞的活性，例如通过增加促炎标志物，例如细胞因子，和/或可以降低参与免疫应答的细胞的活性，例如通过减少促炎标志物，例如细胞因子。
如本文所使用的，术语“B细胞”或“B淋巴细胞”，如本文可互换使用的，是指小淋巴细胞亚型的一类白细胞。与其他两类淋巴细胞、T细胞和自然杀伤细胞不同，B细胞在其细胞膜上表达B细胞受体(BCR)。BCR允许B细胞结合特定抗原，针对所述抗原启动抗体应答。B细胞通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫组分中发挥作用。另外，B细胞呈递抗原(它们也被归类为专职抗原呈递细胞(APC))并且分泌细胞因子。在哺乳动物中，B细胞在骨髓中成熟。
如本文所使用的，术语“成熟B细胞”是指例如，在哺乳动物的骨髓中，已完成B细胞成熟过程的B细胞。成熟的B细胞离开骨髓并且迁移到二级淋巴组织，在那里它们可能与外源性抗原和/或辅助T细胞相互作用。B细胞成熟的阶段已经在科学文献中充分表征并且是本领域技术人员已知的。
如本文所使用的，术语“初始B细胞”是指未暴露于抗原的B细胞。
如本文所使用的，术语“Breg细胞”或“B调节细胞”是指参与免疫调节和免疫应答抑制的一类B细胞。本披露的Breg细胞是成熟的初始B细胞，表达特征性细胞表面标志物。Breg细胞可以表达以下项中的一个或多个：B220、CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD38、CD44、CD48、CD71、CD73、CD138、CD148、CD274、IgM、IgG、IgA、和IgD。特别地，Breg细胞可以表达细胞表面标志物，包括但不限于B220、CD19、CD20、CD24、IgM、IgD和CD138。在引入损伤环境后，Breg细胞可以产生免疫调节细胞因子，包括但不限于IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-35、TNF-α、TGF-β、干扰素-γ。特别地，Breg细胞的特征在于产生IL-10。
如本文所使用的，术语“细胞因子”是指参与细胞信号传导的小蛋白。细胞因子可以由以下免疫细胞产生和分泌，例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、和肥大细胞，并且包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子、和肿瘤坏死因子。
如本文所使用的，术语“促炎细胞因子”是指从促进炎症的免疫细胞分泌的细胞因子。产生和分泌促炎细胞因子的免疫细胞包括T细胞(例如Th细胞)、巨噬细胞、B细胞、和肥大细胞。促炎细胞因子包括白介素-1(IL-1，例如IL-1β)、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)。
如本文所使用的，术语“Toll样受体(TLR)激动剂”是指结合并激活Toll样受体(TLR)，导致下游TLR细胞信号传导的配体。TLR激动剂是本领域技术人员已知的，并且包括内源性和外源性配体。是TLR激动剂的示例性内源性配体包括热休克蛋白、坏死细胞或其片段、氧自由基、尿酸盐结晶、mRNA、β-防御素、纤维蛋白、纤维蛋白原、Gp96、Hsp22、Hsp60、Hsp70、HMGB1、肺表面活性蛋白A、低密度脂蛋白(LDL)、胰弹性蛋白酶、硫酸乙酰肝素的多糖片段、可溶性透明质酸、αA-晶体蛋白、和CpG染色质-IgG复合物。是TLR激动剂的示例性外源性配体包括Pam3CSK4、三酰化脂肽、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、外表面脂蛋白、脂多糖、巨细胞病毒包膜蛋白、糖肌醇磷脂、糖脂、GPI锚定物、单纯疱疹病毒1或其片段、脂磷壁酸、甘露糖醛酸聚合物、细菌外膜孔蛋白、酵母聚糖、双链RNA、单链RNA、Poly(I).Poly(C)、紫杉醇、鞭毛蛋白、调控蛋白、咪唑喹啉、抗病毒化合物、未甲基化的CpG寡脱氧核苷酸、和抑制蛋白。
如本文所使用的，术语“治疗”(及其变体，例如“治疗(treat或treating)”是指试图改变被治疗个体的自然过程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程期间进行。治疗的希望的效果包括但不限于预防疾病或障碍(例如本文所述的那些)的发生或复发、减轻此类疾病的症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、以及改变免疫应答。另外，治疗是指与本文所述的任何疾病或病症相关的临床干预。
如本文所使用的，术语“施用”是指向对象给予剂量的方法。用于本文所述的方法的组合物可以例如按以下方式施用：玻璃体内(例如、通过玻璃体内注射)、通过滴眼剂、肌肉内、静脉内、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、脑实质内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、瘤内、腹膜、皮下、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过局部灌注、直接浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在乳膏中、或在脂质组合物中。用于本文所述的方法中的组合物也可以全身或局部施用。对于局部施用，以洗剂、乳膏、软膏或凝胶剂的形式施用。施用的方法可以根据各种因素(例如，所施用的组合物，以及所治疗的免疫失调的病症、疾病、或障碍的严重性)而变化。
根据本发明治疗的对象是哺乳动物。哺乳动物可以是例如灵长类(例如人)、啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、或另一物种的哺乳动物(例如农场或其他驯养动物)。在上述方法的每一个中，哺乳动物可以是患有本文披露的任何疾病或障碍的哺乳动物。在优选的实施例中，对象是人。
“需要”治疗的哺乳动物可以包括但不限于患有神经退行性障碍、TBI、SCI、免疫障碍的哺乳动物，患有免疫障碍的哺乳动物，或具有免疫障碍的症状的哺乳动物或患有炎性障碍或疾病的哺乳动物。示例性障碍在本文中披露。
药剂(例如药物配制品)的“有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗或预防结果或特定声明的目的的量。“有效量”可以凭经验和通过与所声明的目的相关的已知方法确定。
术语“分离(isolating或isolation)”是指从细胞培养物或生物样品中物理鉴定和分离细胞或细胞群。通过施加适当的细胞生物学技术来进行分离，这些技术基于对细胞培养物的检查并且基于对应于标准的细胞的表征(以及在可能和需要时进行物理分离)，或者可以根据以下特征，例如抗原的存在/不存在和/或细胞大小(例如通过FACS)，基于细胞的自动分选。在一些实施例中，术语“分离(isolating或isolation)”可以包括对细胞的物理分离和/或定量的进一步步骤，尤其是通过进行流式细胞术。物理分离还包括富集细胞或细胞群的特定特征。“分离的”细胞或细胞的群是已经如上所述鉴定和/或分离的细胞或细胞的群。
术语“细胞群”或“细胞的群”通常是指一组细胞。除非另有说明，所述术语是指基本上由如本文所定义的细胞组成或包含如本文所定义的细胞的细胞组。细胞群可基本上由具有共同表型的细胞组成或可以包含至少一部分具有共同表型的细胞。当细胞在一个或多个可证明的特征(包括但不限于形态学外观、特定细胞组分或产物(例如RNA或蛋白)的表达水平、某些生化途径的活性、增殖能力和/或动力学、在体外培养期间的分化潜能和/或对分化信号或行为的应答)方面基本上相似或相同时，则细胞被认为具有共同表型。因此，此类可证明的特征可以定义细胞群或其一部分。如果绝大多数细胞具有共同表型，则细胞群可能是“基本同质的”。“基本同质的”细胞群可以包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至至少99％的具有共同表型(例如B细胞(例如Breg细胞)的特异性表型)的细胞。此外，如果群体中存在的任何其他细胞不改变细胞群的总体特性或不具有对细胞群的总体特性的实质性影响，则细胞群可以基本上由具有共同表型(例如B细胞(例如，Breg细胞)的表型)的细胞组成，并且因此它们可以被定义为一个细胞系。因此，分离的细胞群(或例如分离的B细胞)典型地包含至少60％、或60％至99％、或70％至90％的B细胞(或B细胞的亚群，例如Breg细胞)。
B细胞的收集和分离
任何来源的B细胞，也称为B淋巴细胞，可以用于收集目的。如本领域普通技术人员已知的，此类B细胞可以源自作为B细胞来源的骨髓、脾脏、淋巴结、血液或其他同种异体组织。B细胞的优选来源是骨髓和血液。优选地，收集自体或同种异体或异种B细胞。
使用无菌技术，在一个实施例中，骨髓优选地从后上髂骨获得。获得的B细胞可以在分离和相对纯化后立即使用，也可以储存备用，或可以在使用前培养一段时间。骨髓中的B细胞群含有前原B细胞、原B细胞、前B细胞、未成熟的B细胞和一些成熟的B细胞。
在本申请中，术语B细胞群涵盖前原B细胞、原B细胞、前B细胞、未成熟的B细胞和成熟的B细胞。可以使用本领域普通技术人员已知的标准技术从血液或其他组织中分离B细胞。
用来从异质细胞群获得B细胞或例如前体B细胞的方法是已知的。这些技术中的许多采用一抗(其识别所需B细胞或B细胞前体表面上的分子)，并且使用这些抗体来积极选择这些细胞并将它们与不需要的细胞分离。这种技术被称为正选择。
其他常用的技术使用一抗，所述一抗识别细胞表面上的分子，以将所述细胞从所需的B细胞或B细胞前体中分离出来。以此方式，这些不需要的细胞上的分子与这些抗血清结合，并且将这些细胞从异质细胞群中去除。这种技术被称为负选择。
可以采用正选择和负选择技术的组合来获得相对纯的B细胞或前体B细胞的群体。此类群体被称为分离的B细胞。如本文所使用的，相对纯度是指至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、88％、或更高程度的纯度，例如至少90％、至少95％、至少97％、或至少98％至99％纯度。
技术人员可以使用多种技术来分离与细胞结合的抗体。抗体可以与提供标记或标签的各种分子连接，以促进分离。在一个实施例中，一抗可以连接到允许在磁场中分离的磁珠。在另一个实施例中，一抗可以连接到允许在荧光激活细胞分选仪中进行分离的荧光分子。荧光和磁性标记通常用于一抗和/或二抗以实现分离。与一抗结合的二抗可以用允许在荧光激活细胞分选仪中分离细胞的荧光分子进行标记。可替代地，金属微珠可以连接到一抗或二抗。以此方式，可以使用磁体来分离这些抗体和与其结合的细胞。
为了实现正选择或负选择，将异质细胞群与一抗孵育足够的时间，以实现抗体与细胞表面上的抗原的结合。如果一抗被标记，则在这一步可能会发生分离。如果采用二抗，则二抗(抗一抗)抗体与结合一抗的细胞一起孵育足够的时间，以实现二抗与一抗的结合。如果二抗具有荧光标记，则细胞将被发送通过荧光激活细胞分选仪，从而分离与所需细胞结合的标记抗血清。如果二抗具有磁性标记，则所选细胞与一抗和二抗标记的微珠形成复合物，当通过磁体时，所述复合物留在后面，而其他未标记的细胞与细胞培养基一起被去除。然后洗脱阳性标记的细胞并且准备进一步处理。负选择是已经通过磁场的未标记细胞的集合。
美天旎公司(Miltenyi Biotec)开发了多种产品，用于直接磁分离B细胞和不同的B细胞亚组。B细胞可以直接从全血或血沉棕黄层中分离，无需密度梯度离心或红细胞裂解，或者在密度梯度离心后从外周血单核细胞(PBMC)中分离。根据标准方法，可以采用正选择和耗尽策略直接分离和分离B细胞。
因此，在一个工作实施例中，例如由美国红十字会测试患者和潜在供体的HLA(A、B和DR-B1)。发现与受体单倍体匹配的潜在供体被视为有用的同种异体供体。然后对供体进行单采以分离和收集B细胞。然后制备用于输注的B细胞产品。
在收到供体同种异体单核细胞-MNC(A)后，使用美天旎公司CD19选择富集单采产品的B细胞。血小板洗涤后，使用LS柱上分离的CD19微珠对产品(每小瓶的CD19 CliniMACS试剂多达4x 1010个总细胞和多达5x 109个CD19+细胞)进行CD19+细胞富集处理。洗涤目标级分，并且然后输注介质为Plasma-Lyte A，其中补充有25％HSA(1％最终浓度)。
这些方法通常包括：
第1天
a.接收并且取样供体单采产品以进行无菌性评估、细胞计数、活力评估和流式细胞术。
b.将产品冷藏过夜。
第2天
a.从冰箱中取出产品，充分混合，并且使其平衡至环境温度，持续30分钟。取出样品以进行无菌性评估、细胞计数、活力评估和流式细胞术(具有CD20的DuraClone小组)。
b.按照标准CliniMacs程序进行血小板洗涤。
c.按照标准CliniMacs程序(除了在4℃下进行孵育)添加珠并且在摇床上孵育30分钟。
d.珠孵育后，使用冷却的(4℃)培养基进行1次抗体洗涤，并且按照标准CliniMacs程序将产品加载到CliniMacs LS柱上：
e.使用CliniMacs Enrichment 1.1程序进行分离运行。
f.为细胞计数、流式细胞术、稳定性和无菌性评估采样的CD19富集的目标级分
g.CD19耗尽(非目标级分)采样用于细胞计数和流式细胞术
从异质细胞群和干细胞群中分离B细胞也可能涉及负选择过程，其中骨髓首先通过将骨髓置于低渗缓冲液中并将红细胞从缓冲液中离心出来，进行红细胞裂解。红细胞碎片保留在从试管中取出的上清液中。然后将骨髓来源的细胞重新悬浮在具有结合抗体的适当条件的缓冲液中。可替代地，可以对骨髓进行密度梯度离心。离心后，从梯度中去除含有骨髓衍生细胞的血沉棕黄层。洗涤细胞并且重新悬浮在抗体结合缓冲液中，并且然后与针对干细胞、T细胞、粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的一抗一起孵育(称为谱系耗尽)，然后使用针对B细胞的抗体进行正选择。
可以基于各种表面标志物的差异表达区分不同的B细胞亚群，并且相应地进行收集。
B细胞的离体刺激
一旦分离，B细胞可以通过将它们暴露于一种或多种TLR激动剂或免疫调节细胞因子来处理或刺激，如本文所述。使用此类离体刺激来产生生产IL-10的Breg细胞，在本文所述的方法和治疗策略中被认为是有用的。
施用
待施用的细胞的数量将与待治疗的受影响区域的面积或体积以及递送方法相关。
一种用于施用的B细胞数量的非限制性范围是104至1014个B细胞，取决于待治疗的组织或器官的体积。其他范围包括105至1012个B细胞和106至1010个B细胞。包含B细胞(例如，Breg细胞)的药物组合物可以在单剂量中包含104至1014个B细胞、105至1012个B细胞、或106至1010个B细胞。
单个注射体积可以包括从1μl至1000μl、1μl至500μl、10μl至250μl、或20μl至150μl的非限制性范围。每个动物的总注射体积范围为从10μl至10ml，这取决于物种、递送方法和待治疗的组织或器官的体积。
药物组合物
可以将本文所述的B细胞掺入用于施用至患者(例如患有本文所述的疾病或病症的人类患者)的运载体中。可以使用本领域已知的方法制备含有B细胞的药物组合物。例如，可以使用例如生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂来制备此类组合物(Remington:TheScience and Practice of Pharmacology[雷明顿：药理学的科学与实践]，第22版,Allen,L.编辑(2013)；通过引用并入本文)，并且按所需的形式，例如水溶液的形式。
本文所述的B细胞可以在任何生理相容的载体(例如缓冲盐水溶液或含有一种或多种电解质(例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、葡萄糖酸钠或三水合乙酸钠中的一种或多种)的溶液)中施用。例如，可以在勃脉力(PlasmaLyte)输注缓冲液中施用B细胞。勃脉力是平衡的晶体溶液家族，其中根据区域临床实践和偏好，在全球范围内提供多种不同的配方。它在电解质含量、渗透压和pH方面与人类血浆非常相似。勃脉力溶液还具有另外的缓冲能力，并且含有可转化为碳酸氢盐、CO2和水的阴离子，例如乙酸根、葡萄糖酸根、甚至乳酸根。勃脉力的优势包括在解决酸中毒的同时，校正体积和电解质不足。在优选的实施例中，输注缓冲液是勃脉力A。勃脉力A是用于注射(例如静脉内)施用的无菌、无热原等渗溶液。每100mL的勃脉力A含有526mg的氯化钠(NaCl)；502mg的葡萄糖酸钠(C6H11NaO7)；368mg的三水合乙酸钠，(C2H3NaO2·3H2O)；37mg的氯化钾(KCl)；和30mg的氯化镁(MgCl2·6H2O)。它不含抗微生物剂。用氢氧化钠调节pH。pH约为7.4(例如，6.5至8.0)。
其他药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域熟知的。其他实例包括液体培养基，例如达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、无菌盐水、无菌磷酸盐缓冲盐水、Leibovitz培养基(L15，英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、无菌水中的右旋糖和任何其他生理学上可接受的液体。
还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物，以及油中制备分散体。载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)，其适合的混合物，和/或植物油。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，将优选地包括等渗剂，例如糖或氯化钠。所述溶液优选地是无菌的并且是具有易注射性的程度的流体。优选地，所述溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。如本文所述，本发明的溶液可以通过使用药学上可接受的载体或稀释剂，以及根据需要使用上面列举的其他成分，然后过滤灭菌，并且然后掺入B细胞来制备。
例如，如有必要，可以适合地缓冲本文所述的含有药物组合物的溶液，并且首先使液体稀释剂与足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液尤其适合静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本披露，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。在任何情况下，负责施用的人将确定个体对象的适当剂量。此外，对于人类施用，制剂要符合FDA生物制剂标准办公室(FDA Office of Biologics standards)要求的无菌、热原性、一般安全性、和纯度标准。
药物组合物还可包含赋形剂以促进细胞膜稳定性。输注介质可以补充有例如高可溶性渗透蛋白，例如具有高分子量的高可溶性渗透蛋白。血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)，可以包含在本文所述的药物组合物中，作为用于维持细胞膜稳定性的介质补充剂。HSA包括重组白蛋白。可替代地，人血清可以用于稳定包含细胞的药物组合物。
实例
在以下实例中进一步详细地描述了本发明，这些实例绝不旨在限制所要求保护的本发明的范围。附图意在被认为是本发明的说明书和描述的组成部分。针对本文中描述的所有内容将所引用的所有参考文献都通过引用特别地并入。提供了以下实例以说明而非限制要求保护的发明。
实例1：外源性B细胞调节免疫浸润和应答
此实例使用等压标记多重蛋白质组学，说明了对B细胞在伤口愈合中的分子影响的大规模分析。
我们的数据显示，B细胞施加对伤口微环境具有显著的稳态影响，与炎性应答相关的蛋白显著减少，以及与组织生长和重塑相关的蛋白增加。通过在施加后的不同时间点从伤口微环境回收施加的外源性B细胞，并且通过多色流式细胞术检查细胞群，我们确定施加到伤口的成熟的初始B细胞转变为特征在于表达CD138和免疫调节细胞因子IL-10、IL-35和TGF-β的调节表型。这种Breg样表型是瞬时的，其中在施加后第2天时达到峰值。此外，伤口环境中单核细胞和巨噬细胞的表型由于B细胞施加而显著改变，其中包括IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ在内的促炎细胞因子的表达减少。因此，放置在损伤部位的初始B细胞经由TLR和B细胞受体(BCR)依赖性途径检测局部炎性信号和损伤相关分子模式(DAMP)，并且采用与抗炎细胞因子(优选地IL-10，还有IL-4、IL-35、和TGF-β)产生相关的调节表型，所述细胞因子作用于相邻的免疫细胞和成纤维细胞，并且使它们的表型偏向于抗炎性、促再生的表型。实际上，伤口愈合研究显示，缺乏常见TLR信号传导衔接子髓样分化因子88(MyD88)或缺乏IL-10的B细胞会失去其促再生能力。
材料与方法
将以下材料和方法用于此研究。
动物
在7-9周龄雄性野生型C57Bl6/J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))中进行伤口愈合研究。雄性WT C57Bl6/J被用作B细胞分离的同基因供体。将动物维持在标准实验室护理条件下，温度范围为20℃-23℃，在12h:12h光照:黑暗周期下，可以随意获取食物和酸化水。所有动物程序均按照关于实验动物人道护理的公共卫生服务政策(PublicHealth Service Policy on Humane Care of Laboratory Animals)进行，并且经马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee of Massachusetts General Hospital)批准。尽所有努力减少使用的动物数量并尽量减少动物的痛苦。
细胞分离
在冰冷的EasySepTM缓冲液(干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))中收集小鼠脾脏，所述缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2％胎牛血清(FBS)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)。通过40μm细胞过滤器机械分离脾脏，并且根据制造商的说明使用市售细胞分离试剂盒(干细胞技术公司)处理脾细胞悬液，通过免疫磁性分离进行阴性B或T细胞选择。
伤口模型和组织取样
如前所述(Wang等人，(2013)Nat Protoc.[自然—实验技术]8(2):302-9.)诱导穿过背部皮肤的全层切除伤口。简而言之，用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合物麻醉小鼠，并且将背部皮肤剃毛和脱毛。术前通过皮下注射0.08mg/kg丁丙诺啡进行镇痛。将背部皮肤撑开，将5-mm活检穿孔器穿过皮肤皱襞，在背部两侧形成两个对称的伤口。每个伤口具有大约20mm2的初始面积。使用Vetbond组织粘合剂(3M)将内径为7mm的硅酮夹板(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))贴附在伤口周围。然后用TegadermTM透明敷料(3M)覆盖有夹板的伤口。使用手动移液器将PBS中的细胞悬液或等体积的PBS溶液(盐水对照)直接施加到伤口床上。每个小鼠还在背部皮肤下接受了两次具有相等剂量的B细胞或盐水溶液的局部皮下注射。每个处理过的伤口或皮下部位接受20μl PBS中的15-20×106个B细胞。
在限定的时间间隔(18小时、2天或4天)后，使用O2中的3％异氟醚轻度麻醉小鼠，并且将10-20μl的布雷菲德菌素A(GolgiPlugTM，BD Pharmingen公司)在PBS中的工作溶液施加到每个处理过的伤口和皮下部位，以促进细胞内细胞因子的积累。孵育4小时后，将小鼠安乐死，并且收集包括伤口和皮下注射部位在内的组织活检。在含有5％FBS、0.5％L-谷氨酰胺、0.5％青霉素-链霉素、1.5mg/ml的0.25U/mg胶原酶D(罗氏公司(Roche))、1.5mg/ml的>400U/mg来自牛睾丸的透明质酸酶(密理博西格玛公司(Millipore Sigma))、0.4mg/ml的400U/mg DNA酶I(罗氏公司)、0.025mg/ml的>10U/mg分散酶I(密理博西格玛公司)的RPMI培养基中，同时轻轻摇动，在37℃下酶解组织活检30分钟。然后将组织机械切碎成更小的碎片，然后在相同的溶液中在37℃下伴随轻轻摇动进一步酶解30分钟。然后针对每个小鼠，汇集来自个体伤口和皮下样品的消化组织，并且通过100μm细胞过滤器，然后通过40μm细胞过滤器，产生单细胞悬液。
蛋白质组学
组织取样。如上所述，在小鼠的背部皮肤中产生全层切除伤口。用纯化的B细胞的溶液(悬浮在20μl盐水中的2×106个细胞)，或用盐水对照处理伤口。在限定的时间间隔(0天(大约10分钟)、1天、4天和10天)后，对小鼠(n＝3-5/条件)实施安乐死，并且切除伤口区域(包括伤口边缘和皮下层)并且在液氮中速冻，然后在-80℃下储存直至裂解。
蛋白消化和串联质量标签(TMT)标记。样品处理如先前所述进行(Lapek等人(2017)Nat Biotechnol.[自然生物技术]35(10):983-989)。用BCA测定(赛默科技公司(Thermo Scientific))确定细胞裂解物的蛋白浓度。然后用DTT还原蛋白，并且如前所述用碘乙酰胺烷基化。经由甲醇-氯仿沉淀，沉淀还原和烷基化的蛋白。沉淀的蛋白在50mMHEPES(pH 8.5)中的300μL的1M脲中重构。使用涡旋、超声处理和手动研磨来帮助溶解。以两步法消化溶解的蛋白，其中首先在室温下用3μg的Lys-C(日本和光纯药株式会社(Wako))消化过夜，然后用3μg的胰蛋白酶(测序级，普洛麦格公司(Promega))在37℃下消化6h。用三氟乙酸(TFA)酸化消化液。用C18固相萃取(SPE)(Sep-Pak，沃特斯公司(Waters))将消化的肽脱盐。用BCA测定测量脱盐肽溶液的浓度，并且肽在真空下干燥成50-μg等分试样，储存在-80℃下，直到用TMT试剂标记它们。TMT试剂(赛默科技公司(Thermo Scientific))以20μg/μL的浓度悬浮在无水乙腈(ACN)中。将干燥的肽(50μg)重新悬浮在200mM HEPES(pH 8.5)中的30％ACN中，并且向样品中添加5μL的适当TMT试剂。肽与试剂在室温下孵育1h。通过添加6μL的5％羟胺淬灭标记反应。然后通过添加50μL的1％TFA将标记的样品酸化，并且将肽混合物合并进TMT10plex样品。如上所述，合并的样品在Sep-Pak柱上经由C18 SPE脱盐。
碱性pH反相液相色谱(bRPLC)样品分级。通过bRPLC39进行样品分级，并且将级分合并用于质谱分析。简而言之，将样品重新悬浮在具有5％甲酸和5％ACN的溶液中，并且在装备有级分收集器、脱气器和可变波长检测器的安捷伦(Agilent)1260 HPLC系统上，经4.6-mm×250-mm ZORBAX Extend C18柱(5μm，安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))进行分离。通过在60min内，以0.5mL/min的流速施加在10mM碳酸氢铵中的从22％至35％ACN的梯度进行分离。如前所述(Edwards等人，(2016)Methods Mol Biol.[分子生物学方法]1394:1-13)，总共合并了96个级分。合并的级分在真空下干燥，用5％甲酸和5％ACN的溶液重构，并且然后通过LC-MS2/MS3进行分析以进行鉴定和定量。
液相色谱与质谱联用。所有LC-MS2/MS3实验均在Orbitrap Fusion(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))上进行，所述仪器与Easy-nLC 1000(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))和冷却的自动进样器联用。肽在实验室内拉出、实验室内填充的微毛细管柱(内径，100μm；外径，360μm)上进行分离。柱首先填充约0.5cm的Magic C4树脂(5μm，Michrom Bioresources公司)，然后填充约0.5cm的Maccel C18AQ树脂(3μm，Nest Group公司)，并且然后用GP-C18(1.8μm，赛分科技有限公司(Sepax Technologies))填充到30cm的最终长度。在将色谱柱加热至60℃的同时，以300nL/min的流速，经165min用0.125％甲酸中的11％到30％ACN的线性梯度洗脱肽。通过施加1,800V通过微毛细管柱入口处的PEEK T形接头来实现电喷雾电离。
Orbitrap Fusion在数据依赖性模式下运行，在Orbitrap中以6×104的分辨率在500-1,200的m/z范围内进行全谱扫描。对于MS1全谱扫描，自动增益控制(AGC)设置为5×105，最大注射时间设置为100ms，S-lens的射频(RF)设置为60。在全谱扫描中检测到的最大量的离子经历使用“最高速度”设置进行的MS2和MS3实验，所述设置使得能够在5-s实验周期内获得最大数量的谱图，然后下一个周期开始，伴随另一个全谱全MS扫描。对于MS2分析，启用了决策树选项，基于电荷状态和m/z范围选择前体。双电荷离子选自600-1,200的m/z范围，因为必须在500-1,200的m/z范围内检测三电荷和四电荷离子。离子强度阈值设置为5×105。在获取MS2谱图时，通过使用四极杆施加0.5-m/z窗口来分离离子，并且使用碰撞诱导解离(CID)以30％的归一化碰撞能量进行碎裂。在离子阱中以快速扫描速率检测到碎片离子。AGC目标设置为1×104，并且最大离子注射时间为35ms。
使用同步前体选择(MultiNotch MS3)进行MS3分析，所述选择能够最大限度地提高TMT报告离子定量的灵敏度。多达10种MS2前体同时被分离和碎裂用于MS3分析。将分离窗口设置为2.5m/z，并且通过HCD以50％的归一化碰撞能量进行碎裂。在Orbitrap中检测到MS3谱图中的碎片离子，分辨率为60,000，m/z≥110。AGC目标设置5×104个离子并且最大离子注射时间达到250ms。MS2谱图中m/z低于40m/z和高于前体m/z的15m/z的碎片离子被排除在用于MS3分析的选择之外。
数据处理和分析。使用实验室内开发的软件套件(Huttlin等人，(2010)Cell[细胞]，143(7):1174-89)处理数据。使用ReAdW.exe的修改版本(http://www.ionsource.com/functional_reviews/readw/t2x_update_readw.htm)将RAW文件转化为mzXML格式。MS2数据的谱图分配是使用Sequest算法进行的，以检索Uniprot小鼠蛋白序列数据库，包括已知的污染物，例如胰蛋白酶。
所述数据库被附加以包括一个由所有蛋白序列以相反顺序组成的诱饵数据库。检索是在50-p.p.m.的前体质量公差下进行的。静态修饰包括赖氨酸残基和肽N-末端的TMT10plex标签(+229.162932Da)、和半胱氨酸的氨基甲酰甲基化(+57.02146Da)。蛋氨酸的氧化(+15.99492Da)作为可变修饰包括在内。使用目标诱饵检索策略(Elias等人，(2010)Methods Mol Biol[分子生物学方法]，604:55-71)将数据过滤至<1％的肽和蛋白错误发现率(FDR)。这是通过首先使用来自以下肽和谱图特性(XCorr、ΔCn、错过的胰蛋白酶裂解、肽质量准确度和肽长度)的组合分数，施加线性鉴别器分析来过滤肽注释(肽-谱图匹配)来实现。使用后验误差直方图计算肽谱图匹配正确的概率，通过乘法组合分配至一种特定蛋白的所有肽的概率，并且将数据集重新过滤为蛋白分配FDR，在所有分析的样品中鉴定的所有蛋白的整个数据集为FDR<1％。按照朴素原则(law of parsimony)，与多于一种蛋白匹配的肽被分配至含有最多匹配的冗余肽序列的蛋白。
对于定量分析，通过选择以每个报告离子的预测m/z值为中心的0.003-m/z窗口内最强的离子，从MS3谱图中提取TMT报告离子强度，并且信噪比(S/N)值是从RAW文件中提取的。如果所有报告离子的S/N值总和≥386，并且前体离子的分离特异性≥0.75，则使用谱图进行定量。通过对分配至蛋白的所有肽的TMT报告离子求和来计算蛋白强度。
流式细胞术
为了评估从组织消化中回收后的细胞活力，将细胞悬液洗涤并且重新悬浮在PBS中，并且使用Zombie UV可固定活力试剂盒(博奇公司)在黑暗中，在4℃下伴随轻轻摇动染色30分钟。然后洗涤染色的细胞，并且重新悬浮在含有1％FBS、0.01％叠氮化钠(瑞卡化学公司(RICCA Chemical)，阿灵顿，得克萨斯州)和5％FcR封闭剂(美天旎公司(MiltenyiBiotec,Inc))的PBS中，在4℃下，在黑暗中持续10分钟。然后将封闭的细胞与以下荧光团缀合的一级表面抗体一起在4℃下，在黑暗中孵育30分钟：Brilliant Violet 785缀合的大鼠抗小鼠CD19(克隆6D5)、Alexa700缀合的大鼠抗小鼠/人CD45R/B220(克隆RA3-6B2)、APC/Cy7缀合的大鼠抗小鼠CD138(克隆281-2)(均来自博奇公司)；BrilliantUltraviolet 395缀合的仓鼠抗小鼠CD69(克隆H1.2F3)、PE-CF594缀合的大鼠抗小鼠CD140a(克隆APA5)(均来自BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)。洗涤表面染色的细胞，并且在4℃下重新悬浮在固定缓冲液(博奇公司(Biolegend,Inc.))中持续30分钟，然后是在透化洗涤缓冲液(1X)(博奇公司(Biolegend,Inc.))中。然后将透化的细胞与以下荧光团缀合的一级细胞内抗体一起在4℃下，在黑暗中孵育30分钟：Brilliant Violet 421缀合的小鼠抗小鼠TGF-β1(克隆TW7-16B4)、Brilliant Violet 510缀合的大鼠抗小鼠IFN-γ(克隆XMG1.2)、Brilliant Violet 605缀合的大鼠抗小IL-4(克隆11B11)、Brilliant Violet 711缀合的大鼠抗小鼠TNF-α(克隆MP6-XT22)、PerCP/Cy5.5缀合的大鼠抗小鼠IL-2(克隆JES6-5H4)、PE/Cy7缀合的大鼠抗小鼠IL-10(克隆JES5-16E3)、APC缀合的大鼠抗小鼠IL-6(克隆MP5-20F3)(均来自博奇公司)；荧光素缀合的大鼠抗小鼠IFN-β(克隆RMMB-1)、PE缀合的大鼠抗小鼠IL-27/IL-35 EBI3亚基(克隆355022)(均来自R&D Systems公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)。在配备有BD FACSDIVATM软件和355nm、405nm、488nm、561nm和640nm激光器的LSRFortessa X-20流式细胞仪(BD生物科学公司(BDBiosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)上分析细胞。从每个样品中收集了至少100,000个事件进行分析。使用FlowJo软件10.3版(TreeStar公司，亚什兰，俄勒冈州)分析数据。
免疫组织化学
在损伤后第0天(完整)、第1天、第4天、第10天和第16天收集的伤口活检在4℃下，在4％缓冲多聚甲醛中固定24-48小时，然后在4℃下，在1M蔗糖溶液中再冷冻保护24-48小时，并包埋在组织冷冻培养基(电子显微镜科学公司(Electron Microscopy Sciences))中。使用低温恒温器(徕卡生物系统有限公司(Leica Biosystems))将穿过伤口床的横断面切成10μm的厚度，并且解冻安装到SuperFrost Plus Gold玻片(飞世尔科技公司(FisherScientific))上。对于抗原的免疫组织化学检测，切片通过三份Tris缓冲盐水(TBS)pH 7.4进行洗涤，然后通过在室温下与含有5％牛血清白蛋白、5％FBS和0.3％Triton X-100的TBS一起孵育1小时进行透化和封闭。然后将切片在4℃下与以下稀释在封闭溶液中的一抗一起孵育过夜：APC缀合的大鼠抗小鼠CD45R/B220(克隆RA3-6B2；博奇公司(BioLegend,Inc.))、PE缀合的大鼠抗小鼠CD31(克隆MEC 13.3；BD生物科学公司(BD Biosciences))、Alexa488缀合的小鼠抗微管蛋白β3(克隆TUJ1；博奇公司)、Alexa488缀合的大鼠抗小鼠F4/80(克隆BM8；博奇公司)、PE缀合的大鼠抗小鼠CD11b(克隆M1/70；博奇公司)、兔多克隆抗Ki67(艾博抗公司(Abcam))、和兔单克隆抗激活的半胱天冬酶3(克隆C92-605；BDPharmigen公司)。通过在TBS中冲洗3次，每次5min去除未结合的一抗。如果使用未缀合的一抗，则通过将切片与Alexa Fluor缀合的F(ab')2-山羊抗兔IgG(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))(1:200在封闭溶液中稀释)一起在室温下孵育2小时来将抗原位点可视化。通过与PBS中的2μg/ml的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI；西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))一起在室温下孵育3min，对切片进行复染色。切片在TBS中洗涤3次，持续7min，并且使用Fluoromount(Novus Biologicals公司)包埋。抗体对照包括用同种型抗体孵育组织切片，并且在使用二抗进行可视化时省略一抗。在对照样品中未检测到非特异性信号。
使用配备有20×、40×和63×物镜的Zeiss LSM 710激光扫描显微镜(卡尔蔡司股份公司(Carl Zeiss))对染色的组织切片进行成像。使用Zen软件(卡尔蔡司股份公司(CarlZeiss))以0.1-0.7μm/像素的分辨率和0.5-2.2μm的光学厚度拍摄共聚焦图像。
组织学
使用10-mm活检穿孔器收集伤口愈合时间过程终点时的伤口活检，并且在4℃下将其在PBS中的4％多聚甲醛中固定24-48小时，然后将样品通过分级乙醇和二甲苯洗液脱水，并且包埋在石蜡中。穿过伤口床的横断面被切成5μm的厚度，并且安装在显微镜载玻片上。连续切片用苏木精和伊红染色，并且用梅森氏三色染色剂染色来将胶原纤维可视化。使用Aperio CS2扫描仪(徕卡生物系统有限公司(Leica Biosystems))以0.25μm/像素的分辨率将染色的玻片数字化。由不知道处理条件(盲)的实验者使用数字化的玻片对组织再生进行评分。
统计
分别针对每个检查的细胞群，使用SPSS 23(IBM公司(IBM Corporation))中的线性混合效应建模评估B细胞应用对目标细胞标志物表达的时间依赖性影响。为了方差稳定化，在分析之前对每个样品和检查标志物的门控细胞的比例进行了对数(概率的对数)转化。存活时间(18、45或93小时)、环境(伤口、皮下或仅对于B细胞，冰)、标志物和条件(B细胞处理或盐水)(如果适用)被包括作为固定因素，使用三向(或四向，如适用)全因子设计。技术(运行日期)和生物学重复(小鼠/样品ID)作为随机效应包括在内。使用Dunn-Sidak方法针对多重比较调整固定因素水平之间的事后对比。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。
结果
B细胞应用诱导伤口的分子微环境的复杂变化
整个伤口裂解物的蛋白质组学分析在所有样品和处理中鉴定了多达9125种蛋白。对于处理条件和跨时间点之间的分析，仅考虑了存在于所有样品(n＝30个动物)中的蛋白。这导致总共3809种蛋白(图12)。
野生型鼠伤口模型中，伤口愈合的主要阶段的平均持续时间的示意图显示在图1A中。总结了响应于B细胞应用而显著改变表达的蛋白随时间的表达动态的热图显示在图1B中。总共213种蛋白，其代表与B细胞治疗相关的显著改变蛋白的聚集体(n＝111；p<0.05，未配对t检验)，以及那些在每个时间点具有高倍数变化的蛋白(前20个上调或下调的蛋白)，无论显著性水平如何(n＝112)，都根据与伤口愈合相关的过程进行分类。热图显示了在损伤后第0、1、4、10天，B细胞治疗后倍数变化表达。红色＝上调；绿色＝下调。特别值得注意的是，在损伤后第4天，与炎症和炎性细胞相关的多种蛋白的下调，以及在损伤后第4-10天，与细胞增殖、防止细胞凋亡(细胞死亡)和氧化应激、以及组织重塑(毛囊和肌肉的形成)相关的蛋白的大量上调。
通过功能家族表达蛋白
在用盐水(对照，常规伤口愈合)或B细胞治疗后的伤口中，功能家族随时间变化的蛋白的平均表达显示在图2A至2H中。此分析说明了B细胞作为体内平衡剂的整体效果，而不是蛋白表达的诱导剂或抑制剂。B细胞应用与维持稳定的蛋白(这些蛋白在损伤和愈合过程期间通常会下降或增加)表达水平相关，这显著降低在正常愈合过程中观察到的炎性峰值，防止抗凋亡因子(箭头)和氧化应激保护剂的减少，并且增加增殖(图2A-图2B)，减少抗氧化应激保护剂和细胞增殖的下降，并且维持细胞迁移保持在更低水平(图2C-图2D)，维持与重塑和二级皮肤结构相关的蛋白的稳定水平(图2E-图2F)，降低在对照中损伤早期阶段观察到的蛋白降解和自噬的水平，以及增加与在愈合的后期阶段的血管生成和神经再生相关的蛋白的水平(图2G-图2H)。
皮肤伤口样品中表达的鉴定的蛋白的无监督分级聚类分析描绘在图12中。分析中仅包括在所有样品中始终存在的鉴定的蛋白。使用所有B细胞和盐水处理的动物的伤口中一致表达的完全连锁的3809种蛋白(行)，在损伤后4个不同时间点(列)的分级聚类显示在图12A中。伪色标度描绘了每种蛋白的归一化、对数转换倍数变化表达值。树状图显示了源自此分析的15个蛋白聚类，其中(图12A)中每个细胞的颜色映射到相应时间点处的聚类的平均表达值。蛋白按其随时间变化的表达模式聚类。在图12B中，描绘了来自(图12A)的显示所有3809种蛋白的分级聚类的热图。15个分级聚类的基因本体分析显示在图12C中。来自QuickGO公司的小鼠GOslim基因列表(可从https://www.ebi.ac.uk/QuickGO访问)用于探测15个分级聚类。条形图显示了每个聚类的顶级生物功能类别。
确定了在伤口愈合期间每个评估时间点响应B细胞处理的显著改变蛋白的分布，并且显示在图13中。
B细胞应用在急性伤口愈合中的体内评估
B细胞应用在急性伤口愈合中的体内评估的实验范例描绘在图3中。在野生型C57Bl6小鼠的背部皮肤中总共产生4个全层病变，并且将从同基因动物中纯化的成熟的初始B细胞直接施加在伤口床上。对照动物接受盐水施加。作为内部对照，还在完整皮肤下，皮下注射B细胞或盐水对照，以提供类似的微环境而不会造成损伤。在限定的存活时间后，收集、解离、并且处理伤口或皮肤未损伤组织以进行流式细胞术分析。右侧的散点图显示了每个治疗类别的细胞悬液的典型分布。伤口样品显示了特征性的白细胞流入(白色空心箭头)，这在未损伤的组织中基本不存在。尽管在任一位置典型地都很少存在B细胞，但是在实验应用后很容易大量检测到它们(实心红色箭头)。
经由流式细胞术对B细胞处理的和对照的伤口细胞悬液进行的分析
为了评估不同条件和时间点之间，B细胞和伤口环境的细胞的变化，使用流式细胞术分析样品。我们经由流式细胞术对B细胞处理的和对照的伤口细胞悬液进行的门控策略和分析描绘在图4中。活细胞分为3个主要类别：B细胞(CD19+/B220+淋巴细胞)；非B细胞白细胞(CD140a-/B220-白细胞)，其包括中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞、树突细胞和T细胞的混合物；以及成纤维细胞(CD140a+/B220-)。评估这些细胞类别的激活标志物和细胞因子的产生。
从伤口床中回收的B细胞中激活标志物和关键细胞因子的动态
在定义的暴露于伤口微环境的间隔后，从伤口床上回收的B细胞中激活标志物和关键细胞因子的动态显示在图5中。B细胞在体内暴露于伤口微环境，或被注射在未损伤的皮肤下(对照等效位置)。为了比较，显示了在分离后立即在冰上维持相同持续时间的对照B细胞。在包括18小时、2天、4天和10天的时间间隔后，用布雷菲德菌素A处理伤口4小时以诱导细胞内细胞因子的保留。然后通过切除和解离组织回收B细胞，并且通过流式细胞术进一步表征表面标志物和细胞内细胞因子。暴露于伤口微环境的B细胞瞬时上调多种免疫调节细胞因子，在施加后2天达到峰值。一些免疫调节细胞因子，包括TGFβ和IL-6，在第4天时保持升高，并且IL-10则保持升高长达10天。N＝3-6个动物/组。
热图分析
暴露于伤口微环境、皮下对照、或维持在冰上(未暴露)的B细胞中每种标志物的平均值的热图总结见于图6中。伤口中聚集的浸润性非B细胞白细胞中激活标志物和关键细胞因子的动态显示在图7中。总之，当伤口中存在B细胞时，浸润性白细胞产生更多的抗炎细胞因子IL-10、TGFβ和IL-35，以及更少的促炎TNFα和IL-2。这种影响在损伤和B细胞应用后第4天最为明显，并且持续长达10天。N＝3-6个动物/组。
伤口微环境中浸润性非B细胞白细胞中每种标志物的平均值的热图总结(说明了在B细胞存在下，抗炎细胞因子(IL-10和TGFb)产生增加的模式)显示在图8中。
伤口和皮下组织的CD140a+成纤维细胞群中激活标志物和关键细胞因子的动态显示在图9中。当伤口暴露于B细胞时，伤口中的成纤维细胞在损伤后第10天产生显著更多的IL-10和TGFβ。此外，在损伤后第4天和10天，当施加B细胞时，伤口成纤维细胞产生更少的促炎细胞因子TNFα。
用B细胞或盐水溶液处理的伤口和皮下组织中，成纤维细胞中每种标志物的平均值的另外的热图总结显示在图10中。成纤维细胞是伤口愈合中抗炎和促再生因子的最重要来源之一，并且无论治疗如何，都会产生高水平的IL-10和TGFβ。然而，在损伤后第4天和第10天，来自用B细胞处理的伤口的成纤维细胞继续产生更高水平的IL-10和TGFβ，而在盐水处理的伤口中，这些抗炎细胞因子的水平下降。有趣的是，在伤口成纤维细胞中，促炎细胞因子(包括IL-6和TNFα)的减少中观察到B细胞施加的显著效果。
TLR信号传导以及IL-10产生是伤口愈合中外源性B细胞的再生功能的必要组分
功能性TLR信号传导以及IL-10产生是伤口愈合中外源性B细胞的再生功能的必要组分如图11中所示。在第0天用缺乏常见TLR信号传导衔接子髓样分化因子88(MyD88)、IL-10或WT B细胞的B细胞处理全层切除伤口(此处在愈合的第6天进行说明)作为对照。在每个测试动物中也包括盐水作为内部对照。尽管WT B细胞在WT动物中持续加速伤口闭合2-3天，但是MyD88-/-或IL-10-/-B细胞对伤口闭合没有益处，类似于盐水施加。
实例2：B细胞处理改善TBI后的结果
此实例说明了外源性施加的B细胞显著改善了小鼠TBI模型中的损伤后表现。
脑挫伤导致神经功能障碍，部分由对损伤的炎性应答介导。B淋巴细胞是免疫系统的动态调节剂，尚未在TBI中进行系统研究。使用小鼠控制性皮层撞击(CCI)模型，我们评估了外源性施加的B细胞对TBI后组织病理学和功能结果的可能有益作用。在病变部位向小鼠脑实质内注射2×106个成熟的初始同基因脾脏B细胞，然后进行CCI。对照CCI小鼠接受等量的T细胞或盐水，并且向假损伤小鼠(仅开颅手术)给予B细胞或盐水。假损伤组在运动和学习测试中的表现相似。与盐水或T细胞处理的CCI组相比，施用B细胞的损伤小鼠显示出显著改善的损伤后转棒仪、Y迷宫和莫里斯水迷宫(MWM)表现。此外，与盐水和T细胞对照相比，在TBI后第35天，用B细胞处理的小鼠中的病变体积显著减小了40％，并且星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活减少。外源性B细胞的体内追踪显示，它们在原位的寿命有限，大约为14天，并且似乎不会增殖。数据表明，局部施用B淋巴细胞代表了治疗脑挫伤的一种治疗选择，尤其是当临床管理涉及允许进入损伤部位的程序时。
因此，下文描述的研究调查了成熟的初始B细胞在小鼠CCI TBI模型中防止认知和组织病理学缺陷的潜力。与施用脾脏T细胞或盐水相比，在损伤时通过脑实质内注射递送的单剂量B细胞与海马体和纹状体依赖性行为任务的显著改善相关。观察到的行为改善与用B细胞处理的动物的病变体积显著减小相关，同时保留了海马结构。对脑实质内注射后外源性施加的B细胞的体内跟踪显示，这些细胞的原位存活时间有限，大约为2周，表明它们将代表治疗急性和亚急性挫伤TBI的安全、可行的选择。
材料与方法
将以下材料和方法用于此研究。
动物：所有动物程序均按照NIH实验室动物护理和使用指南和实验室动物人道护理的公共卫生服务政策进行。所有方案均经马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts GeneralHospital)批准。研究是在成年12-14周龄雄性C57Bl6/J小鼠中进行的，体重为25-32g(杰克逊实验室(Jackson Laboratories)，巴尔港，缅因州)。雄性C57Bl6/J和FVB-Tg(CAG-luc-GFP)L2G85Chco/J(均来自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)，巴尔港，缅因州)用作B和T细胞分离的同基因供体。将动物和睦地圈养(每笼4-5只个体)，并且维持在标准实验室护理条件下，温度范围为20℃-23℃，在12h光照:黑暗周期下，可以随意获取食物和酸化水。动物按年龄匹配并且随机分配到实验条件。为了避免偏见，来自不同处理臂的动物被共同圈养。
淋巴细胞分离：如前所述，使用负免疫磁性选择进行细胞分离16。简而言之，在冰冷的缓冲液中收集小鼠脾脏，所述缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2％胎牛血清(FBS)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)。通过40μm细胞过滤器机械解离脾脏，并且根据制造商的说明使用市售细胞分离试剂盒(干细胞技术公司，温哥华，加拿大)处理脾细胞悬液，通过免疫磁性分离和非靶细胞的保留进行阴性B或T细胞选择。通过流式细胞术分析验证B细胞分离程序，并且典型地会产生>98％纯度的成熟的初始CD45R+/CD19+B淋巴细胞群，其中其他白细胞的污染低于1％，尽管可能存在一些残留的红细胞。16纯化的淋巴细胞以4×105个细胞/μl的浓度重新悬浮在无菌PBS中。
控制性皮层撞击(CCI)：所有外科手术，包括损伤和细胞或盐水的施加，均由不知道处理条件(盲)的实验者进行，所述实验者未参与注射用处理剂量的制备。使用Fluotec3蒸发器(Colonial Medical公司，温德姆，新罕布什尔州)在70％N2O和30％O2的混合物中用4.5％异氟醚(Baxter公司，迪尔菲尔德，伊利诺伊州)麻醉小鼠90s，并且放置在立体定位架中。用4.5％异氟醚维持麻醉。在头皮内侧切开后，使用便携式钻头和5-mm环钻在左侧顶颞叶皮层上进行开颅手术，并且丢弃骨瓣。在前/后轴线上距前囟点大约-1mm处、内侧/外侧+2mm处、通过左侧顶叶皮层3mm的深度处进行同侧脑实质内注射。使用带有26s号钝头针头的10-μl汉密尔顿氏注射器(汉密尔顿公司(Hamilton Company)，富兰克林，马塞诸塞州)注射总共5μl含有200万个B细胞、200万个T细胞、或不含细胞的盐水溶液。选择的细胞剂量先前已在皮肤损伤模型中进行了优化，所述模型具有相似的病变体积16。就在CCI之前进行细胞施加，以确保在脑结构完整的同时正确和一致地注射细胞。此后立即使用带有3-mm平头冲击器(impounder)的气压缸对小鼠进行CCI，速度为6m/s，深度为0.6mm，并且冲击持续时间为100-ms。假损伤小鼠接受麻醉、开颅手术和脑实质内注射等量的B细胞或盐水，但是没有CCI损伤。开颅手术保持打开状态，并且使用6-0尼龙缝线(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)将皮肤在头骨上缝合。
行为测试方案：行为测试是在昼夜节律周期的光照阶段由不知道处理条件(盲)的实验者进行。在每次测试之前，小鼠要适应房间至少30min。根据图14中描述的方案，在一连串测定中测试小鼠。在损伤后第1、3和7天通过拉线器测定评估前庭运动能力。在损伤后第7、9、10、13和14天进行转棒仪测试。在损伤后第17天使用高架十字迷宫测定对动物进行焦虑评估。在损伤后第20、21、22、23和24天进行莫里斯水迷宫(MWM)测试，其中在第27天进行探测试验。在损伤后第29天，小鼠接受强迫游泳测试以测定抑郁样行为，并且在第30天进行Y迷宫，这是一种海马体依赖性工作记忆测定。
拉线器测试：使用拉线器测试评估前庭运动功能(Bermpohl等人，(2007)，J CerebBlood Flow Metab[脑血流与代谢杂志]27,1806-1818)。小鼠被放置在一个45-cm长的金属线上，所述金属线悬挂在地面45cm高的地方，并且允许橫过金属线60s。测量在60s间隔内跌倒的延迟，并且使用5分定量化拉线器得分。测试一式三份进行，并且在每个测试日计算每个小鼠的平均值。
转棒仪：将小鼠放置在自动转棒仪装置(哈佛仪器(Harvard Apparatus)，霍利斯顿，马塞诸塞州)上，所述装置经60s从4r/min加速至40r/min。最长试验持续时间为300s，或直到小鼠从转棒仪上掉下来。每个小鼠每天评估五次，其中休息间隔为5min。在测试的每一天记录平均下降延迟和在五次试验中达到的平均r/min速度。
MWM：MWM如前所述进行，其中稍作修改(Mannix等人，(2013)Ann Neurol[神经学年鉴]74,65-75)。每天大致在同一时间评估空间学习。每个小鼠在四个象限中的任何一个使用一组随机的起始位置进行七次隐藏平台试验(每天一到两次试验)。一次试验由以下组成：来自四个起始位置中每一个的平均延迟。如果小鼠在90s内未能找到平台，则将其放置在平台上约10s。在最后一次隐藏平台试验后24h进行探测试验，允许小鼠在没有平台的情况下在水箱中游泳30s，并且记录在目标象限中花费的时间。
波索尔特强迫游泳测试：将小鼠放置在装满水(25℃)至高度20cm的30cm(高)×20cm(直径)的圆柱形透明玻璃罐中。一个白色的泡沫塑料盒在三个侧面提供了视觉屏蔽。将小鼠放置在水中6min，并且记录游泳运动。在测试的最后四分钟量化总活动时间(游泳、爪挠/攀爬烧杯壁)对比非活动时间(被动漂浮)。
Y迷宫自发交替测试：Y迷宫测试在由白色不透明丙烯酸构成的装置中进行，所述装置由三个40-cm长的臂以120°角连接，其中壁高为15cm。每个臂都标有不同的对比视觉提示(黑白方块、圆形、星形)。小鼠被放置在装置的中心，并且允许探索迷宫10min。它们的运动是使用直接位于头顶的网络摄像头和Photo Booth软件(ANY-迷宫)记录的。啮齿动物的正常探索行为包括进入最近访问更少的迷宫臂的偏好(自发交替)。通过将包括每个臂的一个实例的三个连续选择的数量除以臂入口的总数(即交替机会)来计算交替评分。在试验之间用70％乙醇清洁装置。
高架十字迷宫：所述装置由两个130×8cm的平台组成，它们的交叉点有一个8×8cm的方形区域，高出地面60cm。平台的闭合臂具有10cm的壁，而张开的臂没有壁。每个小鼠被放置在迷宫的中心区域并且进行视频记录5min。在试验之间用70％乙醇清洁装置。通过ANY迷宫(Stoelting公司，伍德代尔，伊利诺伊州)软件分析视频记录的闭合和张开的臂的平均速度和时间百分比。
IVIS成像：从CAG-luc-eGFP L2G85转基因纯合小鼠中分离出脾脏B细胞，其显示萤火虫荧光素酶的广泛表达和在CAG启动子下增强的绿色荧光蛋白(杰克逊实验室(JacksonLaboratories)，巴尔港，缅因州)。如上所述，将在5μl PBS中的大约500万个表达荧光素酶的B细胞注射到受体WT C57Bl6/J小鼠的左半球。使用IVIS Lumina II系统(Caliper LifeSciences公司，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)在手术当天和之后定期对小鼠进行成像，持续总共4周。对于每个成像阶段，使用在氧气中的3％异氟醚诱导麻醉，并且在整个成像阶段中使用1l/min的2％-3％异氟醚维持麻醉。为了使荧光素酶活性可视化，在成像前至少6分钟，将100μl的30mg/ml D-荧光素水溶液(Regis科技公司，莫顿格罗夫，伊利诺伊州)皮下注射到损伤部位近端。将小鼠成像10min，并且每次重复成像维持相同的参数。
组织取样：在CCI和处理后第35天，用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)深度麻醉小鼠，用10-15ml肝素化PBS经心脏灌注以去除血液，并且去除头部。将脑在冰上快速提取，在液氮蒸气中冷冻，并且储存在-80℃下。对于冷冻切片，脑被包埋到M-1包埋基质(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)中，并使用低温恒温器以16μm的厚度进行冠状切片。沿着头尾之间轴线以500μm的间隔收集切片，并且解冻安装到SuperFrost Plus Gold玻片(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)上。
免疫组织化学：用于免疫组织化学分析的组织处理如前所述进行(等人，(2017)Wound Repair Regen[伤口修复与再生]，25,774-791)。简而言之，将切片用PBS洗涤，然后通过在室温下与含有5％牛血清白蛋白、5％胎牛血清、和0.3％Triton X-100的PBS一起孵育1小时进行透化和封闭。然后将切片在4℃下与以下稀释在封闭溶液中的一抗一起孵育过夜：Alexa594缀合的大鼠抗小鼠CD45R/B220(克隆RA3-6B2；博奇公司，圣迭哥，加利福尼亚州)、Alexa488缀合的小鼠抗小鼠CD45.1(克隆A20；博奇公司，圣迭哥，加利福尼亚州)、Alexa488缀合的小鼠抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(克隆2E1.E9；博奇公司，圣迭哥，加利福尼亚州)、Alexa647缀合的大鼠抗小鼠CD68(克隆FA-11；博奇公司，圣迭哥，加利福尼亚州)和兔多克隆抗Ki67(艾博抗公司，剑桥，马萨诸塞州)。通过在PBS中冲洗3次，去除未结合的一抗。如果使用未缀合的一抗，则通过将切片与Alexa Fluor缀合的F(ab')2-山羊抗兔IgG(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)(1:200在封闭溶液中稀释)一起在室温下孵育2小时来将抗原位点可视化。通过与2μg/ml的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI；西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))一起孵育，对切片进行复染色。抗体对照包括用同种型抗体孵育组织切片，并且在使用二抗进行可视化时省略一抗。在对照样品中未检测到非特异性信号。使用Zeiss LSM 710激光扫描显微镜(卡尔蔡司股份公司(Carl Zeiss))对染色的组织切片进行成像，并且使用Zen软件(卡尔蔡司股份公司(Carl Zeiss))收集共聚焦图像。
病变体积测量：将切片用苏木精染色，并且收集玻片的高分辨率概览照片。ImageJ(NIH，贝塞斯达，马里兰州)中的形态测量图像分析用于确定每个半球的面积。对于每个切片，从未损伤半球的面积中减去损伤半球(左)的面积，并且将差值乘以0.5以获得脑组织损失的体积，以mm3表示。
图像分析：为了对GFAP和CD68免疫标记进行无偏量化，使用MATLAB(迈斯沃克公司(The MathWorks,Inc.)，纳蒂克，马萨诸塞州)中的标准函数分析了在病变部位周围收集的共聚焦图像，包括病变区域的内侧和外侧方面(n＝4个1400×1400μm的视野/动物)。对于每个图像，通过形态学闭合、形态学打开、和交互式填充二进制掩码半自动定义分析的目标区域，二进制掩码是通过将10的最小强度阈值应用于所有成像通道的最大强度投影而生成的。背景水平是通过使用3x 3像素移动平均值的图像平滑确定的，然后使用10像素半径结构元素对每个通道分别进行形态学开放。前景对象被鉴定为强度超过相应背景水平的像素集，其中GFAP超过25，CD68免疫标记分别超过50。对于每个分析的标志物，将标记的相对面积计算为标记为前景的目标区域内的像素分数，而平均标记强度计算为目标区域内发现的所有前景像素的平均强度。所有图像分析均由不知道处理条件(盲)的实验者进行。
统计分析：在统计测试之前，使用达戈斯蒂诺皮尔森(D'Agostino&Pearson)正态性检验评估所有数据集的正态分布，并且发现通过(p>0.2)。使用双向(处理×时间)重复测量ANOVA(其中试验/时间点作为重复测量因素)与匹配的对象，然后使用图基或西达克方法进行事后多重比较，评估了重复行为测试的实验组之间差异的统计显著性，包括拉线器测定、转棒仪、MWM隐藏和可见平台、和高架十字迷宫。使用单向ANOVA，然后是图基多重比较检验评估了单时间点测量，包括MWM探测、Y迷宫、强迫游泳、以及组织学比较。所有报告的描述性统计数据都是估计的边际平均值±平均标准误差(SEM)。所有统计分析均使用GraphPadPrism 7(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，拉荷亚，加利福尼亚州)进行。P<0.05被认为是统计学上显著的。
结果
损伤时B淋巴细胞应用改善CCI后的认知功能恢复
总共63个小鼠完成了研究，其中1个死亡。在转棒仪测定中，用B淋巴细胞进行脑实质内处理具有显著的保护作用(图15A)。尽管所有损伤组的表现都比假病变动物更差，但是用B细胞处理的损伤小鼠表现出比损伤的T细胞或盐水处理组更好的表现(该组p<0.01)，并且它们的表现与B细胞处理的假手术没有差异。有趣的是，连续试验显示，CCI+B细胞组、以及两个假病变对照组的表现持续改善，表明这些组中发生了程序性学习。B细胞处理的CCI组和假损伤小鼠之间没有显著差异，除了试验3，其中B细胞处理的假病变小鼠表现更好(p<0.01)。相比之下，与B细胞处理的CCI损伤或假损伤动物相比，在损伤时用盐水或200万个T细胞进行脑实质内处理的CCI小鼠表现出最小的日常改善，并且跌倒的延迟显著降低(p<0.0001)。接受T细胞或盐水的CCI损伤组之间没有统计学上的显著差异。
在拉线器测试中，所有损伤组的表现都比假手术更差，但是在B细胞、盐水、或T细胞处理的CCI组之间没有观察到组别差异(图15B)。
在MWM(图16A-16D)中，在隐藏平台试验中，假损伤小鼠的表现显著优于所有CCI组，表明CCI的强大影响(该组p<0.001)，其中假损伤组之间没有注意到差异。在损伤组中，在试验7中，B细胞处理的小鼠对比盐水处理的小鼠，处理效果非常显著(p<0.0001)，具有显著的处理×试验相互作用(p＝0.02)(p＝0.016，图16A)。如通过试验1和试验7之间平均到达平台时间的差异估计，在7次隐藏平台试验过程中的表现改进率在接受B细胞的损伤动物中显著更高(相比于盐水对照组)(p<0.01)。在可见平台试验中没有观察到任何组之间的显著差异(图16B)。在探测试验中，损伤的B细胞处理小鼠的表现与假手术组相似(图16C)。相比之下，接受T细胞或盐水的CCI损伤小鼠的表现比假手术更差(p<0.05)。损伤的B细胞处理小鼠的游泳模式证明了空间搜索策略与假损伤组的那些小鼠相似的证据，而在损伤的T细胞和盐水处理组中搜索策略是非空间的(图16D)。
在Y迷宫测试中(图16E)，脑实质内接受B细胞的CCI损伤小鼠的交替评分为76.65±2.46，显著高于用T细胞(46.86±2.41)或盐水(38.92±2.56；p<0.0001)处理损伤动物，并且与假损伤的B细胞处理小鼠相似。就迷宫臂进入的总数(p>0.13)或覆盖的总距离(p>0.07)而言，任何损伤或处理组之间都没有显著差异。
在高架十字迷宫中(图17A)，任何处理组之间在张的开臂(p>0.84)或中心起始区域(p>0.94)中花费的时间没有显著差异。存在显著的处理×位置相互作用(p<0.05)。在损伤组中，与接受相同数量T细胞的动物相比，接受B细胞的小鼠在迷宫的闭合臂上花费的时间显著更多(p<0.05)。
假损伤组和损伤组在强迫游泳测试中彼此之间没有差异，表明此处采用的病变范例不影响如通过此测定测量的抑郁样行为(图17B)。
损伤时B淋巴细胞应用与CCI后第35天的病变体积减小和神经胶质瘢痕相关
为了评估观察到的与B细胞处理相关的行为改善是否与神经病理学相关，在损伤后第35天收集接受行为评估的所有动物的脑用于组织学检查(图18)。CCI组中脑组织损伤的分析显示，在所有接受CCI的小鼠中，病变区域均出现空化，而假病变组则显示没有脑组织损失(图18A)。对所有组病变体积的定量分析(图18B)显示了如预期的CCI的显著影响(p<0.0001)。与用盐水(p<0.001)或T细胞(p<0.0001)处理的损伤组相比，B细胞处理的CCI小鼠的脑组织损失显著更少。接受T细胞或盐水的CCI损伤组之间在病变体积方面没有显著差异。对整个脑中连续切片的病变区域分布的分析(图18C)显示，在病变的后2/3处观察到处理条件之间最显著的差异，在所述水平处涉及最多的是海马体。实际上，靶向体积测量显示与盐水或T细胞处理的CCI对照相比，B细胞处理的CCI小鼠在损伤半球中具有显著更大比例的幸免海马组织(p<0.0001；图18D)。
为了评估B细胞处理对损伤脑长期反应性应答(包括星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活)的影响，在损伤后第35天收集的组织切片分别针对GFAP和激活相关标志物CD68进行免疫标记。从初始CCI损伤部位形成的空化病变相邻的位置收集的共聚焦图像进行的无偏分析显示，与盐水和T细胞处理的对照相比，在损伤时进行的B细胞处理具有显著效果(图19)。在B细胞处理的动物中，如强烈的GFAP免疫标记和广泛的星形胶质细胞肥大所表明的，神经胶质瘢痕显著减少，针对小胶质细胞激活标志物CD68的免疫标记也显著减少(图19E、19F)。
B淋巴细胞不会原位增殖，并且在施加后的寿命有限，大约为2周
为了确定在脑实质内注射后外源递送的B细胞是否在体内持续存在，我们使用了在CAG启动子下组成性表达萤火虫荧光素酶的纯化B细胞。由于荧光素酶的生物半衰期很短，因此必须连续产生以进行检测。当表达荧光素酶的细胞死亡时，信号会迅速消失，因此，此测定可用于确定实验引入的B细胞的长期存活(Zinn等人，(2008)ILAR J 49,103-115)。由于只有外源性的活B细胞将会产生光信号，因此，此方法允许无创追踪细胞随时间的活力和持续性，直至数百个细胞。结果显示，注射的B细胞在施加后立即在所有检查的动物中清楚地可检测到(图20A)。头部区域总光子通量的定量分析表明，施加的细胞内的活性酶活性最初显示出适度增加，在第3-7天达到峰值，并且然后在第7天后快速下降，在注射后第17天达到不能检测到的水平(图20B)。这些结果支持外源性B细胞在原位具有大约2周的有限寿命的观点。
为了研究引入的B细胞是否可以原位增殖，从而可能在脑实质内建立更长寿的群体，收集穿过注射部位的冠状脑切片，并且对B细胞和增殖标志物进行免疫标记。在注射前使用甲苯胺蓝离体标记B细胞显示，递送后细胞仅分布在注射部位周围大约1mm的半径内(图21A)。共聚焦成像证实，注射的B细胞在递送后长达4天良好地保持定位在施加部位，其中在整个损伤中有一些分散(图21D)。增殖标志物Ki67的免疫标记显示，B细胞在第0天或第4天的时间点不表达此标志物，而邻近的非B细胞在所有检查的动物中，在损伤后第4天显示出高水平的Ki67免疫阳性(n＝每个时间点4个动物；图21D、21E)。此发现与以下事实一致，即在损伤或假病变动物的CD45R(B220)和CD45.1免疫标记的组织切片中，在施加后第35天未能观察到B细胞(数据未显示)。尽管在第35天时CCI损伤的动物中，原始注射部位被空化破坏，但是在假病变的对照中，由于针头引起的损伤周围的神经胶质过多症，可以很容易地检测到它(图21F)。到第35天时，在B细胞处理的假手术中的注射部位没有发现B220阳性B细胞(图21F、21G)。
结论
据我们所知，这项研究首次描述了在临床前TBI模型中直接施加B淋巴细胞来调节损伤后的结构和功能结果。我们发现，在CCI时单次在脑实质内递送纯化的(>95％)成熟的初始B细胞可以显著减少损伤后的学习和记忆缺陷，并且减少脑组织损失。结果表明，内源性B细胞在脑挫伤模型中具有迄今为止未知的保护作用。
CCI损伤模型产生高度可重复的病变以及非常低的死亡率(Xiong等人,(2013)NatRev Neurosci[神经系统科学自然评论]14,128-142)。尽管冲击传递到皮质表面，硬脑膜完好无损，但是损伤的神经病理学后果典型地是广泛的，并且包括皮质、海马和丘脑变性(同上)。这些病理与长期的认知缺陷和情绪行为的改变相关(同上)。在目前的CCI损伤范例中，由于冲击力直接施加到皮层，无论处理条件如何，此区域在所有动物中都确实且不变地变性，而在保留皮层下结构，特别是海马体方面观察到治疗条件之间的差异。观察到的B细胞处理的行为益处也与这些结构支持的功能密切相关，表明引入的淋巴细胞的定位、注射部位周围组织的保留、和功能性神经保护之间存在联系。支持这一假设，在本模型中，B淋巴细胞被注射到前囟点后大约1mm处，并且主要位于尾壳核和海马体之间(Lein等人(2007)Nature[自然],445,168-17)。
在本研究中，从CCI部位收集的组织切片的共聚焦成像显示，B细胞聚类在初始注射部位周围，其中在损伤和施加后第4天在整个受伤组织中适度分布。这些结果说明，脑实质内注射的B细胞可能会在它们的整个寿命期间原位保留在病变部位。尽管所观察到的B细胞神经保护性的潜在分子机制尚不完全清楚，但是很可能涉及源自细胞的扩散因子，到达施加的细胞严格定位之外的远端区域。这一假设得到了观察结果的支持，即在CCI时用B细胞处理的动物中，与对照相比，病变体积显著减小，并且损伤部位的潜在有害反应现象，包括星形胶质细胞增生和小胶质细胞激活显著减少。
因此，B细胞可以用作脑挫伤患者的治疗策略。与任何其他现有的基于细胞的疗法不同，B细胞可以很容易地从外周血或其他血库产品中获得，这是开发快速现成治疗剂的重要优势。实际上，快速、最少操作的自体B细胞疗法将高度可转化到临床环境中。在严重的脑部病变中尤其如此，其中通常进行手术以去除血肿或穿透性骨碎片，并且放置脑实质内或脑室内导管以监测颅内压(Stocchetti等人，(2017)Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]，16,452-464；Galgano等人，(2017)Cell Transplant[细胞移植],26,1118-1130)从而为B细胞进入损伤的脑提供了一种方便的施用途径。
与用于治疗的其他细胞类型(例如干细胞)不同，B淋巴细胞是成熟的终末分化细胞，在体内的自然寿命有限，为5-6周。它们脑挫伤的被破坏微环境中的应用有望在甚至更短的时间内消除移植的细胞。这是有利的，因为移植细胞的更长存活可能代表一个重要的安全问题，特别是考虑到中枢神经系统的微环境包含多种B细胞营养因子。我们使用表达荧光素酶的B细胞的体内可视化来监测代谢活性移植细胞随时间的存在和持久性。我们观察到细胞信号在第7天后快速下降，到第17天达到不能检测到的水平。在CCI的背景下，在脑实质内注射后3到7天，荧光素酶信号强度最初适度增加，可能表明移植的细胞在CCI损伤的局部微环境中经历了一段时间的适应和/或刺激。信号强度的增加不太可能是由于原位细胞增殖造成的，因为注射部位的免疫组织化学检查(在B细胞施用和CCI后立即或最多4天进行)显示，引入的B细胞不表达细胞增殖的标志物。实际上，尽管B细胞确实增强了邻近细胞的增殖，但是在施加至伤口后并未观察到它们的增殖。
此研究描述了第一个原理验证观察结果，即成熟的外周分离的B细胞可能代表了一种急性和亚急性用于治疗挫伤TBI的安全、快速、和有效的基于细胞的治疗策略，对于挫伤TBI，目前不存在改善神经系统结果的治疗选择。
实例3：在ALS的SOD1-G93A小鼠模型中评估B细胞免疫疗法
此实例说明了在ALS标准鼠模型(SOD1G93A小鼠)中B细胞在静脉内(i.v.)施用的安全性和有效性。
雄性和雌性转基因SOD1G93A小鼠以及相同数量的性别匹配的非携带者对照(n＝32个/条件)，在生命第10周(第72天)开始，按每周一次的方案，用盐水中的5×106个B细胞(或盐水对照)处理，持续总共10周。我们发现，B细胞处理延迟了SOD1G93A小鼠中的症状发作(p<0.0001)，如达到峰值体重所示，并且显著延长了存活期(p<0.05)。用B细胞处理与终点时腰脊髓中损伤/变性运动神经元的相对数量显著减少(p<0.05)相关，即使运动神经元的总数没有随着处理而改变。在相同处理的非转基因对照野生型同窝仔鼠中，B细胞处理与任何可观察到的(行为和表型)不利影响无关，它们在重复治疗期间体重继续增加。总之，这些发现证明了B细胞疗法可能为减轻ALS中的神经炎症提供一种可行的方法。
ALS是一种致命疾病，其特征在于脑运动皮层中的上运动神经元、以及脑干和脊髓腹角中的下运动神经元的进行性变性。迄今为止，还没有治愈ALS的方法，这突显了所述领域迫切并且未满足的需求。
研究设计
为了评估B细胞免疫疗法在ALS中的疗效，我们根据已公布的结果的设计和解释指南(Galgano(2017)Cell Transplant[细胞移植]26,1118-1130；Nordstrom等人，(2014)AnnNeuroll[神经学年鉴]75,374-381)，使用了ALS的已确立的B6.SOD1G93A转基因小鼠模型。转基因表达G93A突变形式的人SOD1的小鼠表现出类似于人类ALS的表型。它们的一个或多个肢体逐渐麻痹，并且由于脊髓运动神经元的丧失而麻痹。转基因小鼠的寿命也更短。神经退行性症状典型地在12-14周龄左右开始出现，并且小鼠在大约20-24周龄时死亡。因此，此模型显示了疾病的快速、侵袭性进展。此模型非常稳定且可重复，允许评估这种神经退行性障碍的治疗选择。
在整个研究过程中，每个实验条件(处理)使用总共15-17个雌性和雄性(根据所述领域的推荐指南(同上))，以及相同数量的性别匹配的非同窝非携带者对照(表格1)。从生命第10周(第72天)开始，所有动物每周接受总共10次B细胞(或盐水对照)静脉内输注，经由眼球后注射递送(图22)。出于可行性考虑，所述研究在2个重叠的组群中进行，如表1(每个组群的基因型、性别和处理所使用的动物概述)。
表1
材料与方法
将以下材料和方法用于此研究。
动物：B6SJL-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J(SOD1-G93A)转基因小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(巴尔港，缅因州；库存编号：002726)。杰克逊实验室(JacksonLaboratories)报告称，此奠基品系(founder line)(通常称为G1H)具有高SOD1转基因拷贝数。所有动物在运输前都由杰克逊实验室(Jackson Laboratories)单独进行基因分型，并且只有具有高SOD1转基因拷贝数(分布的上三分之一)的杂合动物才能商业化。对照动物是没有SOD1转基因(非携带者)的同窝仔鼠。
用于B细胞分离的供体动物是C57BL/6J小鼠，也从杰克逊实验室(JacksonLaboratories)购买(库存编号：000664)。
所有动物程序均按照NIH实验室动物护理和使用指南和实验室动物人道护理的公共卫生服务政策进行。所有方案均经马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee of Massachusetts GeneralHospital)批准，方案号：2019N000004。
B细胞分离：所有细胞分离程序均在无菌条件下，在干净的生物安全柜中进行，所得细胞悬液递送到无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。从C57BL6野生型供体动物的脾脏中分离和纯化细胞，共享受体一半的遗传背景(类似于兄弟姐妹)。脾脏被分离成脾细胞悬液，并且使用市售试剂盒(美天旎(Miltenyi)B细胞分离试剂盒，小鼠；130-095-873，美天旎公司(Miltenyi Biotec))，通过负免疫磁性选择分离所有B细胞，如我们之前公布的方案(DeKosky等人(2013)Nat Rev Neurosci[神经系统科学自然评论]9，192-200；Stocchetti等人，(2017)Lancet Neurol[柳叶刀神经病学]，16,452-464)。产生的细胞是>98％CD19+B细胞，典型地超过85％-90％CD19+/B220+/IgM+/IgD+，包括大约5％CD138+浆细胞、和<1％其他细胞群，如通过流式细胞术分析分离后证实(DeKosky等人，(2013)Nat Rev Neurol[神经系统科学自然评论]9,192-200)。这代表了初始B细胞部分(处理)，并且在分离后的同一天将其注入动物。
处理：从生命第10周(第72天)开始，所有动物每周接受总共10次B细胞(或盐水对照)静脉内输注，经由眼球后注射递送。动物用在氧气中的3％异氟醚麻醉，并且将含有500万个初始B细胞(处理)或不含细胞(盐水对照)的100μl盐水团注射到眼球后静脉窦。然后将眼膏施加在处理的眼睛上。之所以选择这种施用方法，是因为与用于细胞移植的尾静脉注射相比，它的失败风险要低得多，特别是在重复施用的情况下。
安全性评估：按照IACUC指南(体重减轻、冷漠、身体状况不佳、毛皮竖起、驼背姿势)，每周三次评估所有动物的健康状况以评估治疗的潜在不利影响。
功效评估：体重和神经系统评分(神经评分(NeuroScore))由不知道处理条件(盲)的实验者每周评估两次，并且将其用于评估疾病进展，如以下文献所述，例如：Hatzipetros，T.等人(2015).J.Vis.Exp.[可视化实验杂志](104),e53257,doi:10.3791/53257；Mashkouri等人，(2016)Neural Regen Res[神经再生研究]11,1379-1384：
神经评分0(症状前)：当小鼠被尾巴悬挂时，后肢呈现正常张开，即它完全伸展远离侧中线，并且在这个位置停留2秒或更长时间。当小鼠被允许行走时，观察到正常的步态。
神经评分1(首发症状)：当小鼠被尾巴悬挂时，后肢呈现异常张开，即它向外侧中线塌陷或部分塌陷，或它在尾巴悬挂期间颤抖或缩回/扣紧。当小鼠被允许行走时，观察到正常或略微缓慢的步态。
神经评分2(局部麻痹发作)：当小鼠被尾巴悬挂时，后肢部分或完全塌陷，不会伸展太多。(可能还有关节运动)。当小鼠被允许行走时，后肢用于向前运动，然而脚趾在90cm的行走过程中至少向下卷曲两次，或者脚的任何部分都在拖拽。当让小鼠重心转移左侧和右侧时，它能在10秒内从两侧自行调整。
神经评分3(麻痹)：当小鼠被尾巴悬挂时，会出现后肢的僵硬麻痹或最小的关节运动。当小鼠被允许行走时，存在向前运动，然而后肢不用于向前运动。当让小鼠重心转移左侧和右侧时，它能在10秒内从两侧自行调整。
神经评分4(人道终点)：当小鼠被尾巴悬挂时，会出现后肢的僵硬麻痹。当小鼠被允许行走时，不存在向前运动。当让小鼠重心转移左侧和右侧时，它不能在10秒内从任一侧自行调整，即没有正位反射。
体重被用作对疾病进展的可靠并且无偏的评估。如前所述(Turner等人(2014)Neurobiol Aging[神经生物学衰老],35,906-915)，使用最大体重的年龄回顾性确定疾病发作的出现，所述体重是肌肉去神经支配发作的可靠且客观的衡量标准。组织学：在安乐死时，从所有动物身上收集腰脊髓，保存在固定液中，并且进行组织学处理。脊髓在水平面上纵向切片，厚度为10μm，并且用苏木精和伊红(H&E)染色，从而使腹角中的运动神经元可视化。将基于大尺寸和独特形态很容易识别的运动神经元，在至少500x 500μm的3-6个目标区域中计数，从每个动物的2-3个纵向切片中随机收集。我们还分别量化了健康运动神经元(大而圆形的细胞体；具有单个突出核仁的细胞核；存在尼斯尔物质；参见图27A)和损伤/变性的运动神经元(细胞体萎缩、高嗜碱粒细胞血症、核染色质的强聚集、固缩核；参见图27B)。所有计数均由不知道处理条件(盲)的实验者进行。
结果
以下结果总结了从完整的动物研究中收集的数据。所述研究在出生后第150天结束，此时最后一个转基因SOD1动物被安乐死。
安全性
在接受初始B细胞(剂量大约为2亿个细胞/kg)的对照非携带者动物中未发现可观察到的(行为和表型)有害影响(体重减轻、冷漠、身体状况不佳、毛皮竖起、驼背姿势)。对照动物在整个研究过程中体重持续增加，与B细胞处理无关(图23)。此外，在转基因SOD1-G93A动物中，在症状出现前的时期(治疗的第72-90天)没有观察到此类可归因于细胞输注处理的有害影响。
处理对ALS进展症状的疗效
a.峰值体重(显示在图24中)。峰值体重定义为个体动物的测量体重显示持续下降后的时间点。此信息用于进行存活分析，其中峰值体重时间代表“存活”。此分析仅使用转基因SOD1-G93A动物，由于对照非携带者小鼠没有显示体重减轻。
与用盐水处理的对照相比，在初始B细胞处理条件下，峰值体重(即症状出现，与体重下降相关)平均延迟了大约28天(p<0.0001，单向ANOVA与西达克事后校正)用于多重比较(参见Turner等人，Neurobiol.Aging[神经生物学衰老]，35,906-915(2014))。
b.神经系统评分评估(显示在图25中)。对于本分析，将疾病发作定义为动物连续3次评估的神经评分为1且并随后神经评分没有降低的时间点。在所有动物中观察到神经系统评分随时间逐渐增加，然而B细胞处理与更慢的进展速度相关(图25)。
c.存活分析(显示在图26中)。如上所述，处于完全麻痹状态的动物重心转移任一侧后10秒内不能自行调整，被归类为具有4的神经评分，并且被人道地安乐死。这些动物被记为死于ALS。作为疾病进展结果的死亡分析证明了与静脉内施用初始B细胞相关的显著总体存活益处(p＝0.0286，单向ANOVA与西达克事后校正用于多重比较；图26)。
d.脊髓运动神经元的组织学分析(显示在图27中)。所有组织学样品的处理和检查由不知道处理条件(盲)的实验者进行。正如预期的那样，与WT对照相比，在转基因SOD1动物中观察到腰脊髓的腹角中运动神经元总数非常显著的减少。尽管在B细胞处理的转基因SOD1动物和对照转基因SOD1动物之间在脊髓中发现的神经元总数方面没有观察到显著差异，但是与盐水对照相比，在B细胞处理的动物中发现这些运动神经元死亡或正在死亡的百分比显著更低。
结论
在这项针对ALS转基因SOD1-G93A小鼠模型的研究中，每周连续10周向小鼠静脉注射纯化的同种异体成熟的初始B细胞与以下相关：(i)症状发作的统计学上的显著延迟28天，(ii)存活期的显著延长，和(iii)与盐水处理的对照相比，在处理的动物的腰脊髓中存在的受损、死亡或正在死亡的神经元显著减少。在接受B细胞注射剂量为200,000个细胞/克(或2亿个B细胞/Kg)的野生型或转基因动物中，注意到没有与处理相关的可观察到的有害副作用。
实例4.施用B细胞治疗帕金森病
包括治疗有效量的B细胞的组合物，例如本文所述的任何组合物，可以施用于患有帕金森病的对象。可以使用本文所述的方法，通过将治疗性B细胞(例如Breg细胞)施用于帕金森病的适当动物模型来评估帕金森病的治疗(参见，例如，Bobela W.等人，Overview ofmouse models of Parkinson's disease.[帕金森病的小鼠模型的综述]，Curr ProtocMouse Biol.[小鼠生物学的当前方案](2014))，并且根据本领域技术人员已知的方法监测治疗效果。用于监测应答的方法包括对运动功能、疼痛、神经炎症、和黑质神经元死亡的评估(参见例如，Peng Q.等人，The Rodent Models of Dyskinesia and their BehavioralAssessment.[运动障碍及其行为评估的啮齿动物模型]，Front Neurol.[神经学前沿](2019))。
可以通过疾病进展速度的降低(例如，通过与帕金森病相关的症状的严重程度测量的进展速度的降低)来监测对治疗的反应性。可替代地，可以通过确定与神经退行性疾病相关的疾病进展的以下分子标志物的水平，监测对治疗的反应性，这些分子标志物例如是：T-τ(总τ)、P-τ(超磷酸化τ)、Aβ42(淀粉样蛋白β42)、Aβ42/Aβ40的比率、YKL-40(几丁质酶-3样蛋白1)、VLP-1(视锥蛋白样蛋白1)、NFL(神经丝蛋白L)、pNFH(磷酸化神经丝重亚基)、Ng(神经颗粒蛋白)和UCH-L1(泛素C-末端水解酶)、TDP-43(TAR DNA结合蛋白43)、降低的α-突触核蛋白和/或降低水平的3,4-二羟基苯基乙酸酯(参见，例如Robey和Panegyres,Cerebrospinal fluid biomarkers in neurodegenerative disorders[神经退行性障碍中的脑脊液生物标志物]，Future Neurol.[未来神经学]14(1).(2019))。
实例5.施用B细胞来治疗另外的神经退行性疾病
可以使用本文所述的方法，通过将B细胞(例如，Breg细胞)施用于适当的动物模型来评估其他神经退行性疾病。另外的神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞叶痴呆、亨廷顿病、婴儿神经轴索营养不良、进行性核上性麻痹、路易体痴呆、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩症、和运动神经元疾病。
用于研究此类神经退行性疾病的示例性动物模型已经在本领域中描述，例如在以下文献中：
阿尔茨海默病(参见，例如，Esquerda-Canals G.等人，Mouse Models ofAlzheimer's Disease.[阿尔茨海默病的小鼠模型]，J Alzheimers Dis.[阿尔茨海默病杂志](2017))；
慢性创伤性脑病(CTE)(参见，例如，Dapul HR等人,Concussive injury beforeor after controlled cortical impact exacerbates histopathology and functionaloutcome in a mixed traumatic brain injury model in mice[在小鼠混合创伤性脑损伤模型中，控制性皮层撞击之前或之后的震荡损伤加剧了组织病理学和功能结果]，JNeurotrauma.[神经创伤杂志],30(5):382-91(2013))；和
亨廷顿病(参见例如Farshim PP,等人,Mouse Models of Huntington'sDisease.[亨廷顿病的小鼠模型]，Methods Mol Biol.[分子生物学方法](2018))。
可以通过疾病进展速度的降低(例如，通过与神经退行性疾病相关的症状的严重程度测量的进展速度的降低)来监测对治疗的反应性。可替代地，可以通过确定与神经退行性疾病相关的疾病进展的分子标志物，例如实例4中提供的疾病进展的分子标志物的水平来监测对治疗的反应性。
实例6.施用B细胞来治疗炎性疾病或免疫疾病
可以施用本文所述的B细胞来治疗炎性障碍或免疫障碍，例如囊性纤维化、心血管疾病(例如冠状动脉疾病或主动脉狭窄)、圆锥角膜、球形角膜、骨关节炎、骨质疏松症、肺动脉高压、色素性视网膜炎、或类风湿性关节炎。可以使用本文所述的方法通过将治疗性B细胞(例如Breg细胞)施用于适当的动物模型，并且根据本领域技术人员已知的方法监测治疗效果，来评估这些治疗炎性障碍或免疫障碍的治疗。
用于研究此类炎性疾病或免疫疾病的示例性动物模型已经在本领域中描述，例如在以下文献中：
囊性纤维化(参见例如，Dreano,E.等人，Characterization of two rat modelsof cystic fibrosis-KO and F508del CFTR-Generated by Crispr-Cas9[Crispr-Cas9产生的两种大鼠囊性纤维化模型KO和F508del CFTR的表征]，Animal Model Exp Med.[动物模型与实验医学]2(4):297-311(2019))；
心血管疾病(Goodchild,T.T.等人，Bone marrow-derived B cells preserveventricular function after acute myocardial infarction[急性心肌梗塞后骨髓来源的B细胞保留心室功能]，JACC Cardiovasc Interv.[美国心脏病学会杂志·心血管介入]，2(10):1005-16(2009))；
圆锥角膜(参见，例如，Tachibana M.等人，Androgen-dependent hereditarymouse keratoconus:linkage to an MHC region[雄激素依赖性遗传性小鼠圆锥角膜：与MHC区域的连接]，Invest Ophthalmol Vis Sci.[研究性眼科学和视觉科学]，43(1):51-7(2002))；
骨关节炎(参见例如Kuyinu.E.L.等人，Animal models of osteoarthritis:classification,update,and measurement of outcomes[骨关节炎的动物模型：结果的分类、更新、和测量]，J Orthop Surg Res.[矫形外科与研究杂志]，11:19(2016))；
骨质疏松症(参见例如Komori T.，Animal models for osteoporosis.[骨质疏松症的动物模型]，Eur J Pharmacol.[欧洲药理学杂志]，759:287-94(2015))；
肺动脉高压(参见例如，Sztuka K.和Jasińska-Stroschein M.，Animal modelsof pulmonary arterial hypertension:A systematic review and meta-analysis ofdata from 6126 animals[肺动脉高压的动物模型：来自6126个动物的数据的系统评价和荟萃分析]，Pharmacol Res.[药理学研究]125(Pt B):201-214(2017))；
色素性视网膜炎(参见例如，Tsubura A.等人，Animal models for retinitispigmentosa induced by MNU:disease progression,mechanisms and therapeutictrials[MNU诱发的色素性视网膜炎的动物模型：疾病进展、机制、和治疗试验]，HistolHistopathol.[组织学和组织病理学]，25(7):933-44(2010))；和
类风湿性关节炎(参见例如，Asquith D.L.等人，Animal models of rheumatoidarthritis[类风湿性关节炎的动物模型]，Eur J Immunol.[欧洲免疫学杂志]，39(8):2040-4(2009))。
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其他实施例
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