本发明属于酶工程技术领域,涉及一种青霉素G酰化酶突变体及其应用。所述的青霉素G酰化酶突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中突变多个氨基酸位点。利用本发明的青霉素G酰化酶突变体,催化水解7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)制备7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA),与突变之前的酶相比,具有更高比活力,更高的转化效率,更低的底物残留和更好的有机溶剂耐受性,更适用于工业规模化生产应用。