本发明公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用,所述的基因编辑系统包括特异性靶向Myo6～(C442Y)突变基因的gRNA以及SaCas9-KKH,并通过AAV-PHP.eB病毒载体递送,形成了有效的针对Myo6～(C442Y)的敲除系统。本发明通过Myo6～(WT/C442Y)小鼠模型实验,评价其对小鼠听力损失的影响,结果发现AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统能特异性地敲除Myo6～(WT/C442Y)小鼠中的Myo6～(C442Y)突变等位基因,且Myo6～(WT/C442Y)小鼠中注射AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2后可在长达5个月的时间内,观察到听觉功能的恢复,同时,还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则,直观地验证了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统对Myo6～(C442Y)突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用,可用于制备治疗半显性遗传感音神经性聋的药物。

本发明公开了一种CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法,包括pML-Cas9质粒以及pJM-sgRNA质粒；pML-Cas9质粒包括一个pMV261表达载体、一个TaU3p启动子、一个靶基因序列、一个sgRNA4TmC+5结构、一个Cas9基因和一个NHEJ修复基因,pMV261表达载体、TaU3p启动子、靶基因序列、sgRNA4TmC+5结构、Cas9基因和NHEJ修复基因按照上述顺序依次连接,pMV261表达载体上的Hsp60启动子被替换为了TaU3p启动子；NHEJ修复基因包含编码DNA末端结合蛋白mku的基因以及编码DNA连接酶LigD的基因；Cas9基因位于pMV261表达载体的TaU3p启动子的下游以及pMV261表达载体的rrnB终止子上游,本发明涉及基因工程技术领域。该CRISPR-Cas9基因编辑工具及其编辑方法,可实现小麦等作物CRISPR-Cas9载体转化后突变率低、获得CRISPR-Cas9转基因突变株系难的问题,节约了转化时间,减少了转化成本。

本发明公开了一种CRISPR/Cpf1基因编辑系统及其构建方法和在赤霉菌中的应用,该系统为骨架质粒pCpf1Ff-DR,包括Fncpf1基因、功能性crRNA基因、启动子pGPD、启动子pTRPC、强RNA聚合酶III型启动子5srRNA、潮霉素筛选标记hph。本发明系统效率高、通用性强、易于操作而被迅速应用于丝状真菌赤霉菌中,通过该基因编辑系统可用于赤霉菌中实现长达17kb的比卡菌素基因簇的敲除。本发明首次在赤霉菌中实现大片段基因敲除,且首次发现比卡菌素基因簇敲除有利于提高赤霉素产量,该方法有望进一步用于改造赤霉素工业菌,缩短菌株升级的时间,为提高赤霉素产量、增加经济效益提供了强有力保障。

本发明公开了基于Cre-FloxP系统的CNN3基因敲除小鼠模型的构建方法,方法包括：在CNN3基因的第二外显子的两边分别插入FloxP基因片段,构建Cas9/gRNA靶点并构建同源重组模板,将同源重组模板与所述供体DNA一起显微注射到小鼠的受精卵中得到创始Cnn3-FloxP小鼠,并与雌鼠进行交配后自交,得到稳定遗传的纯合子CNN3～(fl/fl)小鼠；将所述纯合子CNN3～(fl/fl)小鼠与组织特异性表达的Cre小鼠交配后进行自交,经基因鉴定筛选出基因型为Cre～(+/-)/CNN3～(fl/fl)小鼠。本发明设计基因技术领域,可高效构建得到特异性组织或特异性细胞CNN3基因敲除的小鼠,大幅提高了选择性敲除CNN3小鼠模型的构建效率及构建成功率。

本发明属于生物技术领域,公开了一种Piezo1基因敲除的肾小球旁细胞系及其构建方法。其中,采用靶序列为小鼠第8号染色体第122502249～122502271个碱基的sgRNA；该sgRNA可用于特异性识别Piezo1基因、敲除Piezo1基因、构建Piezo1基因敲除的细胞系、制备用于构建Piezo1基因敲除的细胞系的产品、构建Piezo1基因敲除的动物模型、制备用于构建Piezo1基因敲除的动物模型的产品,尤其在构建Piezo1基因敲除的细胞系时,相对传统文献报道的shRNA干扰方法,该sgRNA可以从基因组层面对靶基因Piezo1表达进行调控,显著提高Piezo1基因的抑制效率。

本发明的发明名称为合成子的形成。除了其它,本公开提供一种组合物,其包括：5’-3’核酸外切酶；链置换聚合酶；和任选地,单链DNA结合蛋白质和/或连接酶。另外还描述形成合成子的多核苷酸组装方法以及用于进行该方法的试剂盒。

本发明属于基因编辑技术领域,具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统以及其应用。本发明基因编辑系统为特定Cas9蛋白与sgRNA形成的复合体,能精确定位靶向DNA序列并产生切割,使所述靶序列发生双链断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑。所述各Cas9蛋白均具有数量相对少的氨基酸,可与相同的sgRNA形成复合体进行基因编辑。进一步地,所述Sa-SchCas9蛋白和SchCas9蛋白识别的PAM序列非常简单,所述Sha2Cas9-HF1蛋白、Sha2Cas9-HF2蛋白、SpeCas9-HF1蛋白、SpeCas9-HF2蛋白和SpeCas9-HF3蛋白特异性非常高且编辑效率很高。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。

本发明提供了一种确定长链非编码核糖核酸相互作用蛋白的新方法。本发明提供了由BASU和dCasRx形成的融合蛋白、用于表达所述融合蛋白的哺乳动物表达载体。本发明确定lncRNA相互作用蛋白的方法包括：通过将表达所述融合蛋白的哺乳动物表达载体和特异的靶向目标lncRNA的gRNA共转染到靶细胞中,使BASU对附近的效应蛋白进行特异的生物素化标记；使用链霉素亲和偶联的磁珠分离生物素化的蛋白质,然后进行洗脱,胰蛋白酶消化和质谱的无标记定量分析。本发明可以高度可信地确定与lncRNA相互作用的蛋白质。

一种基因敲入方法,是向基因组DNA的靶部位敲入外源性DNA的方法,包括向细胞导入包含所述外源性DNA的供体DNA以及以Cas9蛋白质和其向导RNA作为构成要素的CRISPR－Cas9系统的工序,所述供体DNA从5’侧依次包含由可通过微同源介导的连接与所述基因组DNA的所述靶部位的5’侧的第1核苷酸序列连接的第1’核苷酸序列构成的5’－微同源区域、所述外源性DNA、由可通过微同源介导的连接与所述基因组DNA的所述靶部位的3’侧的第2核苷酸序列连接的第2’核苷酸序列构成的3’－微同源区域,所述CRISPR－Cas9系统是如下系统：将所述基因组DNA中的所述靶部位与第1核苷酸序列之间的第1被切断区域以及所述靶部位与第2核苷酸序列之间的第2被切断区域切断,并且将所述供体DNA中的所述5’－微同源区域的5’侧的第3被切断区域、所述外源性DNA与所述5’－微同源区域之间的第4被切断区域、所述外源性DNA与所述3’－微同源区域之间的第5被切断区域以及所述3’－微同源区域的3’侧的第6被切断区域切断；在所述基因组DNA的第1核苷酸序列与第2核苷酸序列之间插入所述外源性DNA。

本发明提供了一种近乎完整染色体倒置的平衡染色体以及具有平衡染色体动物模型的构建方法,使用位点特异性重组酶系统介导的重组技术,在染色体着丝粒侧插入片段1,包括位点特异性重组酶系统一侧识别位点,该位点的上游具有正选择标记基因表达元件片段A；在端粒侧插入片段2,包括位点特异性重组酶系统另侧识别位点,该位点的上游具有反向的正选择标记基因表达元件片段B,经相应的位点特异性重组酶诱导实现两个位点特异性重组酶系统识别位点之间的序列倒置,正选择标记基因表达元件片段A和B组合实现正选择标记基因的表达,利用正负筛选法筛选得到平衡染色体。本发明所述方法可用于建立所有染色体近乎全部倒置的平衡染色体动物品系。