阅读说明：本技术 一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法 (Enzyme-linked immunosorbent assay method for indirectly detecting pirimiphos-methyl ) 是由 肖治理 李莉萍 田巍 孙远明 徐振林 沈玉栋 罗林 柳心梅 谢波 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法,以牛血清白蛋白偶联2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的人工抗原为免疫原,以鸡卵清白蛋白偶联2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的人工抗原为包被原。以人工免疫原免疫试验动物,使其机体产生特异性针对甲基嘧啶磷水解产物的抗体,所述抗体可以特异性识别甲基嘧啶磷水解产物--2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇,用于农药原药水解后间接检测食品中甲基嘧啶磷的含量。该方法检测限为3.2ng/mL,半抑制浓度(IC<Sub>50</Sub>)为23.42ng/mL,线性检测范围为6.09～90.07ng/mL,曲线相关系数为0.9996。本发明方法特异性强,灵敏度高,简便快捷,在食品中甲基嘧啶磷残留检测方面具有广泛的应用前景。(The invention discloses an enzyme-linked immunosorbent assay method for indirectly detecting pirimiphos-methyl, which takes an artificial antigen of bovine serum albumin coupled with 2-diethylamino-6-methyl-4-pyrimidineol as an immunogen and an artificial antigen of chicken ovalbumin coupled with 2-diethylamino-6-methyl-4-pyrimidineol as an envelope antigen. Immunizing test animal with artificial immunogen to make its body produce antibody specifically directed against methyl pyrimidine phosphorus hydrolysateThe product 2-diethylamino-6-methyl-4-pyrimidineol is recognized by opposite sex, and is used for indirectly detecting the content of the pirimiphos-methyl in food after the pesticide raw material is hydrolyzed. The detection limit of the method is 3.2ng/mL, and the half Inhibitory Concentration (IC) 50 ) The detection range is 23.42ng/mL, the linear detection range is 6.09-90.07 ng/mL, and the curve correlation coefficient is 0.9996. The method has the advantages of strong specificity, high sensitivity, simplicity, convenience and rapidness, and wide application prospect in the aspect of detection of the residue of the pirimiphos-methyl in the food.)

一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法。

背景技术

甲基嘧啶磷(pirimipho-methyl)，又称O-(2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶基)-O,O-二甲基硫代磷酸酯，商品名又称为安得利。分子量为305，黄色液体，可被强酸强碱水解，遇光不稳定，能溶于大多数有机溶剂，在水中溶解度约为5mg/L。甲基嘧啶磷是一种速效低毒杀虫剂和杀螨剂，并有触杀和熏蒸作用，对于储粮甲虫、象鼻虫、蛾类和螨类均有良好的药效，不但可以用于大田作物及经济作物的害虫防治，还可以用于防治果蔬及家庭害虫，值得指出的是，它对仓储害虫的防治效果特别好，在国内外被广泛应用。

甲基嘧啶磷作为一种广谱型新型有机磷杀虫剂，且具有低毒、高效的特点，是替代高毒品种的理想型农药。目前广泛应用在农业以及储粮生产上，但其过多的残留量在一定程度上对人们的健康构成了潜在的威胁。甲基嘧啶磷进入人体后，可与体内胆碱酯酶结合，阻止胆碱酯酶催化水解乙酰胆碱，导致大量的乙酰胆碱在体内蓄积，使胆碱能神经受到持续冲动，引起先兴奋后衰竭的中毒症状，严重的会出现昏迷甚至死亡。

目前，对于甲基嘧啶磷的检测，主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等仪器法进行定量检测。这些方法虽然存在检测结果准确可信的优势但也存在样品前处理繁琐、耗时、昂贵、不适合现场检测等缺点。相比较而言，以抗原抗体特异性识别为基础发展起来的免疫检测方法具有检测方便、快捷、适合大批量样品快速检测的优点，在快速检测领域发挥着越来越重要的作用。而免疫学检测方法建立的基础是要有质量高、特异性强的抗体，所以半抗原的设计及完全抗原的合成显得尤为重要。

小分子化合物(MW≤1000dolton)具有反应原性，可以与抗体发生反应，但一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体，如果将小分子连接到具有免疫原性的大分子(通常为蛋白质)上，做成人工抗原，就可能使机体产生免疫应答，产生针对小分子结构的抗体。对于半抗原结构的选择，如果小分子待测物本身含有-NH2，-COOH，-OH，-SH等功能基团，可直接活化后偶联载体蛋白，便可合成人工完全抗原。虽然甲基嘧啶磷没有相应的活性基团，但其水解后可以暴露羟基，可直接偶联载体蛋白。CN201910890291.9公开了一种甲基嘧啶磷单克隆抗体的制备方法，但是其制备的半抗原结构复杂，制备步骤繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫吸附分析方法。

本发明的第一个目的在于提供一种甲基嘧啶磷的人工半抗原。

本发明的第二个目的在于提供一种用于检测甲基嘧啶磷的抗体。

本发明的第三个目的在于提供一种用于检测甲基嘧啶磷的抗体的制备方。

本发明的第四个目的在于提供一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫分析方法。

本发明的第五个目的在于提供所述的人工半抗原和/或所述的抗体在检测甲基嘧啶磷中的应用。

本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：

本发明首先选择了甲基嘧啶磷水解产物(2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇，Pr-OH，式I)，作为半抗原与载体蛋白偶联制备人工抗原(式II)，制备了免疫原(Pr-OH-BSA)和包被原(Pr-OH-OVA)。用上述人工免疫原免疫试验动物，使其机体产生特异性针对甲基嘧啶磷水解产物的抗体，所述抗体可以特异性识别甲基嘧啶磷水解产物--2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇，用于农药原药水解后间接检测食品中甲基嘧啶磷的含量。该方法检测限为3.2ng/mL，半抑制浓度(IC50)为23.42ng/mL，线性检测范围为6.09～90.07ng/mL，曲线相关系数为0.9996。本发明方法特异性强，灵敏度高，简便快捷，在食品中甲基嘧啶磷残留检测方面具有广泛的应用前景。

因此本发明首先要求保护一种甲基嘧啶磷的人工半抗原，以2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇(式I)偶联载体蛋白制备得到，结构如式II所示：

优选地，采用N,N’-羰基二咪唑法偶联载体蛋白制备得到。

优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)、血蓝蛋白(KLH)、多聚赖氨酸(PLL)、人血清白蛋白(HSA)中的一种。

一种用于检测甲基嘧啶磷的抗体，用所述的人工半抗原免疫动物得到。

优选地，所述抗体为多克隆抗体。

一种用于检测甲基嘧啶磷的抗体的制备方法，将所述的人工半抗原免疫动物，得到所述抗体。

免疫动物后，动物体内产生特异性针对甲基嘧啶磷水解产物的抗体。

一种间接检测甲基嘧啶磷的酶联免疫分析方法，以牛血清白蛋白(BSA)偶联2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的人工抗原为免疫原，以鸡卵清白蛋白(OVA)偶联2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的人工抗原为包被原。

优选地，包括如下步骤：

S1.将包被原用包被缓冲液稀释，包被在酶标板的不同微孔内，孵育、洗板、封闭；

S2.分别将2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的标准溶液或经水解处理的待测样品液加入酶标板相应微孔内；

S3.将抗体溶液稀释一定倍数后加入酶标板微孔内，孵育、洗板；

S4.将酶标二抗溶液加入酶标板所有微孔内，孵育、洗板；

S5.将显色液加入酶标板，显色；

S6.将终止液加入酶标板，终止反应，并用酶标仪读取每孔吸光度值；

S7.用Origin8.5的四参数拟合模块绘制标准曲线，计算抑制曲线相应检测参数；

S8.换算为待测样品中甲基嘧啶磷的实际含量。

更优选地，步骤S5所述显色液为步骤S4所述酶标二抗中酶所对应的底物溶液。

更优选地，步骤S6所述终止液是浓硫酸溶液。

更优选地，步骤S6所述终止液是浓硫酸溶液为2mol/L。

所述的人工半抗原和/或所述的抗体在检测甲基嘧啶磷中的应用，也属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提出的半抗原结构简单易得，可以直接购买直接偶联载体蛋白，避免了繁琐的半抗原设计合成及鉴定步骤，同时最大程度保留了甲基嘧啶磷的嘧啶环特征结构，有利于刺激实验动物产生免疫应答；(2)用该人工抗原免疫实验动物所制备的多克隆抗体灵敏度高、特异性强、足以满足检测的需求，因此该人工抗原可进一步用于制备更高质量的单克隆抗体或基因工程抗体；(3)基于本发明所提及的抗原及抗体建立的免疫分析检测方法具有使用方便、成本低廉、特异性强、灵敏度高的特点，可同时检测大批量样本，适用于间接检测各类食品中甲基嘧啶磷的残留量。

附图说明

图1为半抗原I及其免疫原、包被原紫外扫描图。

图2为半抗原I所制备的抗体对2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的抑制标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1免疫原与包被原的制备及鉴定

免疫原与包被原的制备，使用不同载体蛋白来实现。所述免疫原载体蛋白采用牛血清蛋白(BSA)，所述包被原载体蛋白采用鸡卵清白蛋白(OVA)，所采用的偶联方式为N,N-羰基二咪唑法。具体实施方案如下所述：

半抗原式I(2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇)0.03mmol溶于250μL DMF中，加入8.11mg N,N-羰基二咪唑，37℃，搅拌反应2h，此为A液。称取10mg载体蛋白(BSA或OVA)，溶于2mL包被液中此为B液。将A液缓慢滴加至B液，4℃，搅拌反应72h。反应完后，装入预先煮过10min的透析袋中，用PBS透析3d，每天更换3次透析液。得到的完全抗原式II(免疫原Pr-OH-BSA和包被原Pr-OH-OVA)分别稀释成1mg/mL，分装，于-20℃冷冻保存。

对人工免疫原和包被原的鉴定采用紫外扫描法。将载体蛋白、半抗原及其人工抗原用pH7.4的PBS配成1mg/mL的溶液，以0.01mol/LpH7.4 PBS调零，进行紫外扫描测定(200～400nm)，得到载体蛋白、半抗原及其人工抗原的吸收曲线。

结果如图1所示，三者的紫外扫描曲线互不重叠且特征吸收峰有相应的偏移，说明人工免疫原和包被原制备成功。

实施例2抗体的制备及鉴定

1，多克隆抗血清的制备

将实施例1制备的免疫原Pr-OH-BSA与等剂量的弗氏佐剂混合(首次免疫用完全弗氏佐剂，之后均用不完全弗氏佐剂)，充分乳化后，采用背部、腹部、皮下、脚垫等多点注射的方式免疫小鼠。第一次免疫后隔三周后每两周加强免疫一次。第三次加强免疫后隔一周进行尾部采血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用腹腔注射加强免疫一次，一周后摘眼球取血。室温静置0.5～1h，于4℃，12000r/min下离心10min，取上清分装于离心管中，于-20℃下保存备用。

2，多克隆抗血清效价测定

间接竞争ELISA测定抗体效价以吸光度值在1.0～1.5之间为准。使用磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1mol/L，pH7.4)作为所有样品的稀释液和反应缓冲液；使用Pr-OH-OVA作为包被原；将50μLPBS缓冲溶液或1mg/mL的2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇标准品溶液，50μL适当稀释倍数的多克隆抗体加入96孔酶标板中，竞争反应完加入酶标二抗，进而经过显色反应后通过酶标仪测定吸光度值。

结果表明实施例1制备的免疫原的免疫多克隆抗血清效价为1:32000，抑制率为90％。

实施例3间接测定甲基嘧啶磷的酶联免疫方法的建立

使用实施例2制备的抗血清绘制间接竞争ELISA标准曲线。使用磷酸盐缓冲溶液(PBS，0.1mol/L，pH7.4)作为所有样品的稀释液和反应缓冲液；使用Pr-OH-OVA作为包被原，具体实施例如下：

(1)将1ng/mL包被原Pr-OH-OVA包被在ELISA酶标板上，37℃包被过夜后，加入5％脱脂奶粉溶液每孔120μL，于37℃封闭3h后甩干，37℃烘箱内烘干备用。

(2)向样品处理液中加入氢氧化钠溶液，调节溶液pH为11，50℃下振荡2h，得到经水解的样品液；

(3)将50μL一系列浓度(0.128、0.64、3.2、16、80、400、2000ng/mL)2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇标准溶液或经水解的样品液加入准备好的包被板内；

(4)各孔加入50μL 1:4000倍稀释的抗体，37℃孵育30min，洗涤液洗涤5次，在吸水纸上拍干；

(5)各孔加入100μL 1:5000倍稀释的酶标二抗溶液，37℃孵育30min，洗涤液洗涤5次，在吸水纸上拍干；

(6)各孔加入100μLH₂O₂-TMB底物显色液，37℃孵育10min

(7)各孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液终止反应，450nm波长下酶标仪读取各孔吸光度值。

(8)以B/B₀值为纵坐标，相应标准品浓度对数值为横坐标，使用Origin 8.5软件四参数对数函数进行曲线拟合，以曲线计算的IC₅₀为半数抑制浓度，以IC₁₀为检测限，以IC₂₀～IC₈₀为检测范围。

(9)将2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的几种类似结构与所述抗体进行ELISA反应，绘制标准曲线，计算各类似物的IC₅₀，并计算交叉反应率。

结果如图2及表1所示，以2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇建立的标准曲线具备典型的S型曲线，相关系数为0.9996，灵敏度好，检测限为3.2ng/mL，特异性高，与其他类似结构无交叉现象。由于样品中的甲基嘧啶磷可以快速高效的水解为2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇，因此该方法可以用于间接检测食品中甲基嘧啶磷的含量。

表1抗血清对2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇的检测参数

表2抗血清对2-二乙基氨基-6-甲基-4-嘧啶醇及其相似结构的交叉反应率

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。