阅读说明：本技术 粪便核酸保存液及其制备方法和应用 (Excrement nucleic acid preservation solution and preparation method and application thereof ) 是由 王婷婷 吴琼 李佩璐 秦楠 于 2019-04-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种粪便核酸保存液及其制备方法和用途。该粪便核酸保存液包括：浓度为0.01-1M的Tris-HCl缓冲液,浓度为0.01-1M的乙二胺四乙酸(EDTA)、浓度为0.01-0.5M的氯化钠,浓度为0.01-0.5M的柠檬酸钠和体积浓度为10-30％的无水乙醇；所述保存液pH值为7.0-10.0。利用本发明提供的粪便核酸保存液可以有效保持粪便中核酸的稳定性,方便使用者随时取样及常温运输。而且不影响下游对于肠道菌群的检测。(The invention relates to a fecal nucleic acid preserving fluid and a preparation method and application thereof. The fecal nucleic acid preserving fluid comprises: Tris-HCl buffer solution with the concentration of 0.01-1M, Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) with the concentration of 0.01-1M, sodium chloride with the concentration of 0.01-0.5M, sodium citrate with the concentration of 0.01-0.5M and absolute ethyl alcohol with the volume concentration of 10-30%; the pH value of the preservation solution is 7.0-10.0. The excrement nucleic acid preservation solution provided by the invention can effectively maintain the stability of nucleic acid in excrement, and is convenient for a user to sample at any time and transport at normal temperature. And does not affect the downstream detection of the intestinal flora.)

粪便核酸保存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种粪便核酸样本保存液及其制备方法和应用。

背景技术

肠道是人体最重要的器官之一。据报道，人类肠道中有多达39万亿个细菌细胞，是人类细胞数量的1.3倍，而且这些细菌编码的基因数量是人类基因的100多倍。人体肠道菌群作为一个微生态系统，各成员相互制约，相互依存，在质和量上形成一种生态平衡。成员稳定、功能合理的肠道菌群对人体的正常生理代谢、营养吸收、免疫维持、激素平衡、中枢神经系统成熟乃至行为特征等有着重要的正面影响。肠道菌群的失衡与多种疾病的发生发展相关，如肥胖及糖尿病等代谢综合征，类风湿性关节炎，炎症性肠病，流感病毒感染，动脉粥样硬化等等。因此，以肠道菌群作为靶点，以高通量测序、基因芯片等手段对其组成结构及变化规律进行检测，已经成为一种衡量人体健康状况、乃至用于特定疾病伴随诊断的新方法。

检测粪便微生物组成是研究肠道菌群结构及功能最方便、无侵入式的方法。粪便采集之后，经核酸提取、基因检测和生物信息学分析等方法，获得其中几乎全部微生物DNA信息，可以获得粪便中全部微生物种类的组成信息。

但是粪便样本的采集和运输受到了很大的制约，还有待改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种粪便核酸保存液及其制备方法和应用。

本发明的发明人在研究过程中发现：在采集和运输的过程中，粪便样本中的微生物及其核酸组成受到下列因素的影响：第一，粪便中大部分为厌氧细菌，由于环境中氧气含量的改变，这些细菌可能快速停止生长并死亡，导致其细胞壁破裂，核酸降解；第二，温度的改变也会造成不同细菌生长速率的改变，使得粪便菌群组成发生变化，某些对温度敏感的微生物种类死亡分解，核酸降解甚至消失。而常规的保存方式，即超低温(-80℃)保存并不适用于常规居家采样和运输，导致部分用户放弃检测或检测结果与实际不符。目前，急需发展稳定、有效的方法，在常温下对粪便样本里的微生物及其核酸进行保护，保证粪便菌群检测结果的可靠性。

为此，本发明的目的是提供一种可用于常温保存及运输的粪便核酸保存液，按照配方配制该保存液，将采集到的新鲜粪便样品直接保存于该保存液中，可以达到稳定、可靠保存样本中的微生物及其核酸的作用。使用本保存液保存的粪便样本，可以到达取样后立即超低温冻存的效果。本保存液无毒无害，可用于居家取样和常温长途运输。本保存液成分不影响下游核酸提取及检测。

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种粪便核酸保存液，包括：Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01～1M；EDTA，所述EDTA的浓度为0.01～1M；氯化钠，所述氯化钠的浓度为0.01～0.5M；柠檬酸钠，所述柠檬酸钠的浓度为0.01～0.5M；无水乙醇，所述无水乙醇的体积浓度为10～30％；所述保存液pH值为7.0-10.0。利用该粪便核酸保存液可以稳定保存样本中微生物及核酸。该粪便核酸保存液中Tris-HCl缓冲液可以为样本提供一个稳定的缓冲环境，EDTA可以抑制粪便样本中核酸酶或者蛋白酶的作用，从而降低核酸的降解；无水乙醇相当于菌种的保鲜剂，可以为粪便样本中菌种提供稳定的环境。这些成分配合氯化钠和柠檬酸钠可以稳定的保存粪便样本中的微生物以及核酸，与粪便样本混合后在40℃下保存7天，依然可以稳定粪便样本，达到取样后立即超低温冻存的效果。而且无毒无害，适于居家取样和常温长途运输，且不会对下游检测带来影响。

根据本发明的实施例，以上所述的粪便核酸保存液可以进一步包括如下技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.1～0.5M；所述EDTA的浓度为0.1～0.5M；所述氯化钠的浓度为0.05～0.5M；所述柠檬酸钠的浓度为0.05～0.3M；所述无水乙醇的体积浓度为15～30％，所述保存液的pH值为7.5-9.0。该粪便核酸保存液可以稳定核酸样本，与新鲜样本相比，不会对样本中微生物及核酸产生影响。

在本发明的一些实施例中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.5M；所述EDTA的浓度为0.15M；所述氯化钠的浓度为0.5M；所述柠檬酸钠的浓度为0.1M；所述无水乙醇的体积浓度为20％；所述保存液pH值为8.0。由此，与粪便样本混合，在保存过程中不会对样本中微生物或者核酸产生影响。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种粪便核酸保存液的制备方法，包括：(1)称取所需量的Tris，用盐酸调节pH至5.0-10.0，制得Tris-HCl缓冲液；(2)将所需量的EDTA溶于无菌去离子水，调节pH至5.0-10.0，制得EDTA溶液；(3)将所需量的氯化钠和柠檬酸钠溶于无菌去离子水，并与所述Tris-HCl缓冲液、EDTA溶液混合，调节pH值至7.0-10.0，进行高压灭菌，获得灭菌溶液；(4)将所需量的无水乙醇与所述灭菌溶液混合，微孔滤膜除菌，获得所述保存液。

根据本发明的实施例，以上所述制备方法中，所述高压灭菌为在121℃下高压灭菌30分钟。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种粪便样本保存方法，包括：将所述粪便样本和保存液等体积混合，密封遮光，在40℃以下温度保存，其中，所述保存液为本发明第一方面任一实施例所述的保存液。

在本发明的一些实施例中，将所述粪便样本和所述保存液等体积混合，密封遮光，在-80℃下温度保存。

根据本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面任一实施例所述的粪便核酸保存液。在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括取样管，所述取样管中所有所述粪便核酸保存液，所述取样管密封包装。

根据本发明的第五方面，本发明提供了一种试剂盒，包括：Tris-HCl缓冲液、EDTA、氯化钠、柠檬酸钠和无水乙醇；所述Tris-HCl缓冲液、EDTA、氯化钠、柠檬酸钠、无水乙醇各自在不同的容器中。

本发明所取得的有益效果为：本发明涉及一种粪便核酸保存液，利用该保存液配置收集新鲜粪便样品，具有能保护粪便内微生物及其核酸免于降解，保护微生物多样性、利于粪便样品收集运输、利于下游基因检测等特点，有助于肠道菌群多样性研究，以及以肠道菌群为靶点的基因检测应用。

附图说明

图1是根据本发明的实施例提供的经5种保存方式保存的5个志愿者粪便样品的DNA提取结果电泳检测比较图。

图2是根据本发明的实施例提供的经5种保存方式保存的5个志愿者粪便样品的微生物多样性指数比较图。

图3是根据本发明的实施例提供的经5种保存方式保存的5个志愿者粪便样品的微生物主成分分析比较图。

图4是根据本发明的实施例提供的经5种保存方式保存的5个志愿者粪便样品的微生物门分类水平上的比较图。

其中图1～图4中标号1对应1号处理组，即新鲜样本直接提取；标号2对应2号处理组，即将新鲜样本在-80摄氏度条件下保存7天；标号3对应3号处理组，即将新鲜样本和保存液混合，在40摄氏度条件下保存3天，然后在-80摄氏度条件下保存4天；标号4对应4号处理组，即将新鲜样本和保存液混合，在40摄氏度条件下保存7天；标号5对应5号处理组，即将新鲜样本在40摄氏度条件下放置7天。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

利用本发明提供的粪便核酸保存液可以有效保持粪便中核酸的稳定性，方便使用者随时取样及常温运输。而且不影响下游检测程序。本保存液与粪便的混合物可直接用于下游检测(核酸提取及相关检测)无需样品前处理，极大的方便了样品保存及运输的灵活性，有助于提高肠道菌群为靶点的基因检测的效率和准确性。

为此，本发明提供了一种粪便核酸保存液，包括：Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01～1M；EDTA，所述EDTA的浓度为0.01～1M；氯化钠，所述氯化钠的浓度为0.01～0.5M；柠檬酸钠，所述柠檬酸钠的浓度为0.01～0.5M；无水乙醇，所述无水乙醇的体积浓度为10～30％；所述保存液pH值为7.0-10.0。

本发明还提供了一种粪便核酸保存液的制备方法，包括：

(1)称取所需Tris，用盐酸调节pH至5.0-10.0，制得Tris-HCl缓冲液；

(2)将所需量的EDTA溶于无菌去离子水，用盐酸调节pH至5.0-10.0，制得EDTA溶液；

(3)将所需量的氯化钠和柠檬酸钠溶于无菌去离子水，并加入Tris-HCl溶液、EDTA溶液混合，用NaOH调节PH值至7.0-10.0，于121℃高压灭菌30min；

(4)将所需量的无水乙醇加入步骤(3)的溶液，微孔滤膜过滤除菌。

(5)将所配制的保存液分装至取样管，常温严格密封保存。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实施例1对5位志愿者的新鲜粪便样本，分别按照如下5种条件进行保存，并通过核酸提取验证每种保存条件对于粪便样本核酸的影响。其过程具体如下：

首先，采集了5位志愿者的新鲜粪便样本，分别按照下列5种条件进行保存：

1号处理组(取样后立即提取)：采集约0.2g新鲜粪便样品，立即进行DNA提取；

2号处理组(直接超低温保存7天)：采集约0.2g新鲜粪便样品，立即冻存于-80℃，保存7天后再进行DNA提取；

3号处理组(保存液40℃保存3天和超低温保存4天)：采集约0.2g新鲜粪便样品，立即放入等体积保存液，颠倒混匀，于40℃保存3天，再于-80℃保存4天后，再进行DNA提取；

4号处理组(保存液结合40℃保存7天)：采集约0.2g新鲜粪便样品，立即放入等体积保存液，颠倒混匀，于40℃保存7天后，再进行DNA提取；

5号处理组(40℃保存一周)：采集约0.2g新鲜粪便样品，不加保存液，直接于40℃放置7天后，再进行DNA提取。

其中，3号处理组和4号处理组所用到的保存液包括Tris-HCl、EDTA、NaCl、柠檬酸钠和无水乙醇，其中：所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0.5M；所述EDTA的浓度为0.15M；所述氯化钠的浓度为0.5M；所述柠檬酸钠的浓度为0.1M；所述无水乙醇的体积浓度为20％，所述保存液的pH值为8.0。

具体地，粪便样本处理及核酸提取过程如下：

(1)所保存的粪便样本的处理

1号处理组：取约0.2g固体粪便样本于离心管中，加入1.4mL Buffer ASL(DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，在涡旋仪上震荡至充分均匀；

2号处理组：取约0.2g固体粪便样本于离心管中，加入1.4mL Buffer ASL(

DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，在涡旋仪上震荡至充分均匀；

3号处理组和4号处理组：将整支保存管在涡旋仪上充分震荡混匀，取300-500μL混合物，加入1mL Buffer ASL(

DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，在涡旋仪上震荡至充分均匀；

5号处理组：取约0.2g固体粪便样本于离心管中，加入1.4mL Buffer ASL(

DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，在涡旋仪上震荡至充分均匀；

(2)70℃恒温金属浴上孵育5min；

(3)充分涡旋15秒，高速离心1分钟，沉淀杂质；

(4)吸取1.2mL上清，弃去沉淀；

(5)向每个样本管(上清)加入1片InhibitEX Tablet药片(

DNA StoolKit,Qiagen,Germany)，立即充分涡旋1分钟，使药片充分溶解。常温孵育1分钟；

(6)高速离心3分钟，吸取全部上清，弃去沉淀；

(7)向每个新的空管里加入200μL上述上清溶液及15μL蛋白酶K(DNAStool Kit,Qiagen,Germany)，混合均匀；再加入200μL Buffer AL，再次涡旋混合均匀；

(8)70℃恒温金属浴或水浴上孵育10min；

(9)加入500μL无水乙醇，震荡混匀并微离心；

(10)将以上混合液缓慢加入QIAamp离心柱(DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，以20000rcf转速离心1min，弃去残液；

(11)打开QIAamp离心柱，加入500μL Buffer AW1(DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，以20000rcf转速离心1min，弃去残液；

(12)打开QIAamp离心柱，加入500μL bufferAW2(DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，以20000rcf转速离心1min，弃去残液；重复离心一次；

(13)将QIAamp离心柱放入新的2mL EPP管，室温下干燥2min；

(14)加入100μL Buffer ATE(DNA Stool Kit,Qiagen,Germany)，于室温孵育3min,以20000rcf转速离心1min，洗脱DNA，收集DNA溶液。

以上5种方式保存粪便样本并提取DNA的结果如图1所示。所提取的目的DNA主带在1.5Kb左右，若该位置有明显亮色条带，且条带清晰无拖带，表明成功提取了该粪便样本内的微生物DNA，其DNA分子完整性未受到破坏。从图1的可以可以看出，相较于5号处理组来说，1号处理组～4号处理组均获得了比较其他清晰的条带。

结果表明，在获得新鲜的粪便样本后立即提取和取样后立即于-80度冻存的样本均可提取出完整的DNA；利用本发明所提供的保存液分别于两种条件下(40℃保存3天，超低温保存4天；或者40℃保存7天)保存的样本均可提取出完整的DNA；而不添加保存液，直接40℃放置7天的样本，其DNA发生了严重降解，没有明显主条带，仅在胶图下方有较小的片段。该结果说明，本发明提供的保存液在所测试的两种温度保存条件下均可以有效保护微生物DNA，提取效果良好。

实施例2

1、核糖体16S rRNA基因V3-V4区片段扩增及测序

(1)试剂：高保真PCR聚合酶系统(Kapa Biosystems)

(2)引物序列：

上游引物(341F)：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG(SEQ ID NO:1)

下游引物(806R)：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT(SEQ ID NO:2)，其中V代表碱基A或碱基G或者碱基C；W代表碱基A或T；H代表碱基A或碱基C或碱基T。

(3)操作步骤：设置PCR总体系为30μL，包括15μL 2×KAPA HiFi HotStartReadyMix(Kapa Biosystems)，上下游引物各0.2μM，DNA模板30-50ng。按照下列PCR反应条件进行反应：

表1 PCR反应条件

(4)将扩增后得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳切胶纯化，使用Illumina MiSeq测序平台以PE300模式进行测序。

2、测序结果分析及比较

(1)经过上述实验，我们获得了5位志愿者的粪便样本经5种条件下保存后测得的菌群多样性测序结果。经过生物信息学分析，我们得到了每个样本的微生物Alpha-多样性分析结果，其结果用物种丰富度(即物种数目，以操作分类单元，Operational TaxonomicUnits,OTU数目)和多样性指数(香农多样性指数，Shannon Diversity Index)来代表。

如图2所示，结果表明，各志愿者的1-4号处理组，即：立即提取和取样后立即于-80度冻存的样本、保存于保存液并分别在两种条件下保存的样本，其菌群丰富度和多样性一致；而各志愿者的5号处理组，即：取样后直接40度放置7天的样本，其菌群丰富度和多样性均明显低于前述1-4号处理组，提示由于DNA降解，所能检测到的物种多样性发生了明显的下降。该结果说明，本发明所提供的保存液在所测试的两种温度保存条件下均可以有效反映菌群的物种多样性信息。

(2)通过生物信息学分析，计算不同样本之间的加权UniFrac距离，并做主成分分析(Principal Coordinates Analysis,PCoA)，进行比较。基于加权UniFrac距离的PCoA所显示的样品间相互关系如图3所示。图3中图上每个点代表1种保存方式得到的1位志愿者的粪便菌群的组成信息。两个点距离越近，代表这两个菌群的组成结构越相似，反之亦然。

图3的结果表明，各志愿者的1-4号处理组，即：立即提取和取样后立即于-80℃冻存的样本、保存于保存液并分别于两种条件保存的样本，其菌群物种组成更相似，而各志愿者的5号样本，即：取样后直接40℃放置7天的样本，其菌群物种组成与上述1-4号处理组差异较大。特别的，在1-4号志愿者中，观察到以保存液保存的两种条件下，菌群物种组成与立即提取的样本菌群物种组成更为相似。

(3)通过生物信息学分析及比对，比较不同样本在细菌门分类水平上的组成差异。基于门水平的细菌相对丰度如图4所示，图上每个柱子代表1种保存方式得到的1位志愿者的粪便菌群信息，纵轴代表每个样本里各个细菌门的相对丰度。

图4的结果表明，各志愿者的1-4号处理组，即：立即提取和取样后立即于-80℃冻存的样本、分别于两种条件下保存于本保存液的样本，其菌群物种组成相似；特别地，立即提取和分别于两种条件下保存于本保存液的样本，其菌群物种组成更显著相似。而各志愿者的5号处理组，即：取样后直接40℃放置7天的样本，其菌群物种组成与上述1-4号处理组差异较大。具体而言，5位志愿者样本的测试结果均表明，拟杆菌门(Bacteroidetes)在40℃下放置7天的保存条件下丰度下降，而变形菌门(Proteobacteria)在此条件下丰度上升。相对丰度较低的细菌在此保存条件下，其相对丰度也出现显著上升。

基于粪便微生物的DNA提取效果、所检测到的细菌丰富度、多样性分析、所检测到的菌群结构、所检测到的细菌门水平的组成，可得出结论：本发明涉及的粪便核酸保存液用于在不同温度条件下保存粪便样本，其核酸提取效果与采集新鲜粪便样本后立即提取核酸或立即超低温冻存后提取核酸的效果一致，其核酸提取效果优于直接40℃放置后提取核酸的效果。

同时研究了不同成分的粪便核酸保存液对于粪便样本的保存效果。

我们设计了粪便核酸保存液配方试剂的不同梯度进行实验，和专利所述配方中的保存液用同样的方法进行了5个实验组，用专利中所述相同的方法进行验证不同配方保存液的效果，结果显示专利中所述的保存液配方效果最佳。同时我们也设计了不同的试剂组成类似的配方，和专利所述配方中的保存液用同样的方法进行了5个实验组，用专利中所述相同的方法进行验证不同配方保存液的效果，结果显示专利中所述的保存液配方效果最佳。

结果说明，采用本发明提供的粪便核酸保存液，可以维持粪便中核酸的稳定性，方便使用者随时取样及常温运输，而且保存液与粪便混合后，无需进行前处理，即可直接用于下游检测，方便了样本保存及运输的灵活性，有利于提高肠道菌群为靶点的基因检测的效率和准确性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海锐翌生物科技有限公司

<120> 粪便核酸保存液及其制备方法和应用

<130> PIDC4180303

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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