阅读说明：本技术 一种微藻总核糖核酸样品制备方法 (Preparation method of microalgae total ribonucleic acid sample ) 是由 薛松 范旭冉 曹旭鹏 朴海龙 于 2019-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种微藻总核糖核酸(RNA)样品制备技术,具体的说是对于高糖能源微藻特点而开发的一种总RNA提取纯化方法。本发明以微藻生物质为原料,经过液氮研磨、均相试剂提取和纯化,最终获得满足高通量测序所需要的总RNA样品。本发明操作简单,尤其适用高糖微藻总RNA样品制备。(The invention relates to a microalgae total ribonucleic acid (RNA) sample preparation technology, in particular to a total RNA extraction and purification method developed for the characteristics of high-sugar energy microalgae. According to the method, microalgae biomass is used as a raw material, and a total RNA sample required by high-throughput sequencing is finally obtained through liquid nitrogen grinding, homogeneous reagent extraction and purification. The method is simple to operate, and is particularly suitable for preparing the total RNA sample of the high-sugar microalgae.)

一种微藻总核糖核酸样品制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微藻总RNA的提取方法，尤其适用于从高糖微藻样品提取总RNA用于转录组学的研究。

背景技术

微藻因其生长快速、可通过简单培养调节代谢通路，定向富集储能物质而成为新一代天然、低成本并且绿色环保的能源原料、工业原料或食品原料。在对微藻代谢通路调控机制的研究中，转录组测序是一种高效、经济的技术手段，近年来已在微藻研究领域中被广泛应用。通过转录组信息可以对微藻细胞中基因在特定环境与时间下的转录情况进行定性与定量，但转录组测序需要高质量的RNA样品才能准确的展现细胞在特定时间阶段的转录情况。

高糖微藻细胞中富含多种多糖。多糖与RNA的多个理化性质相似，在沉淀RNA时，多糖往往会与RNA共同沉淀，形成富含多糖的凝胶状RNA沉淀，并会形成大量的挂壁。去除多糖的过程中，部分RNA容易被一同去除，从而降低RNA的得率，而增加的步骤又给总RNA增加了很大的降解风险。尤其在胁迫环境下培养的微藻，细胞本身的RNA已经开始降解，长时间的提取与纯化步骤会进一步降低样品质量，所产生的差异会在后续测序过程中的PCR倍增步骤中被进一步放大，使得转录组测序的定量出现显著误差。另外，多糖会抑制部分酶的活性，同样会对后续的建库与测序产生干扰。

本发明基于酚类及异硫氰酸胍等试剂提取细胞总RNA的技术，从新鲜收集或低温保存的高糖微藻细胞中提取总RNA，可直接用于转录组测序的建库，是一种高效、简洁的获取高质量RNA样品的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为高糖微藻细胞中提取总RNA质量不高，提取率较低的问题，提供了一种微藻总RNA样品制备技术，本发明所属方法可以高效、简洁的获取高质量RNA样品。

本发明提供一种微藻总RNA样品制备技术，包括以下步骤：

①在即将使用的研钵中加入2/3体积的液氮，等待液氮完全蒸发；②将藻泥样品在融化前置于研钵中，加入少量液氮，在液氮中将藻沉淀磨成粉末状，过程中需再加1-2次液氮；③按照100mg藻沉淀/1mL TRIzol比例加入TRIzol(Ambion-Life Technologies Co.,Carlsbad,CA,USA)将藻粉覆盖住，然后加入少量液氮使其变固体，并在室温融化，融化过程中在膏状时用研杵充分搅拌；④完全融化后用研杵混匀样品与试剂，每1000μL转移至一个新的1.5mL离心试管中，12000g离心5min，取上清750μL，完全不吸入破碎物；⑤每个离心管加入150μL体积的氯仿，手振15s，室温静置5min，之后12000g离心15min；⑥取上清，完全不触碰到中间层，留有较大距离以防吸入，加入375μL的异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g离心10min，弃上清；⑦加入1mL 75％乙醇，上下颠倒清洗沉淀，12000g离心5min，尽可能的去除乙醇；⑧室温干燥2-5min，用100μL DEPC-H₂O依次溶解20min后，分别定量和琼脂糖凝胶电泳验证。

本发明关键操作内容注意事项包括：

(1)操作环境干净无尘，事先用DNA&RNase Away处理，严格戴好口罩、头套、手套；

(2)移液器杆、实验台面彻底处理，枪头、离心管等耗材、试剂均采用无RNase的耗材与试剂；

(3)样品加入TRIzol后的冻融过程可以提高RNA提取率；

(4)去除乙醇步骤中，按顺序分别使用1000μL，100μL，10μL移液器尽量去除乙醇，可以显著降低RNA样品中盐含量。

本发明以微藻生物质为原料，经过液氮研磨、均相试剂提取和纯化，最终获得满足高通量测序所需要的总RNA样品。本发明操作简单，尤其适用高糖微藻总RNA样品制备。

附图说明

图1湛江等鞭金藻总RNA样品琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker，最右边1条带为序号15样品；

图2亚心形四爿藻的总RNA样品琼脂糖凝胶电泳图，左侧为Marker；

图3暗诱导后藻液Total RNA质量分析图；

具体实施方式

本发明公开了一种微藻总RNA样品制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进技术参数实现，技术参数包括微藻的种类，样品量，室温干燥时间，最终RNA样品溶解时DEPC-H₂O添加量。若样品后续应用于定量PCR，需要加入Dnase降解残留DNA步骤。以上技术参数的改动对结果的影响不大，都被视为包括在本发明。本发明方法及应用已经通过实例进行详细描述，相关人员能够轻松的对本文所述方法进行应用。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：方法简易、易行，能快速、高质量的从高糖微藻细胞中提取总RNA。

实施例1

湛江等鞭金藻的总RNA样品制备

湛江等鞭金藻细胞样品与其他常规细胞样品相比，尤其是胁迫条件下的样品，具有高糖、高脂的特点。本实验取-80℃下冻存的湛江等鞭金藻细胞，每个样品150-300mg(此处采用200mg)。在即将使用的8cm直径研钵中加入其2/3体积的液氮，等待液氮完全蒸发，将金藻细胞样品在融化前置于研钵中，加入5mL液氮，可见样品***变脆，在液氮中将其磨成粉末状，反复将所有大颗粒碾至细微的粉末，过程中需再加1-2次液氮(此处采用2次)，保持样品处于固体冷冻状态。按照100mg金藻细胞/1mL TRIzol比例加入TRIzol(Ambion-LifeTechnologies Co.,Carlsbad,CA,USA)将藻粉覆盖住，然后加入少量液氮使其变固体，并在室温融化，融化过程中在膏状时用研杵充分研磨和搅拌。完全融化后用研杵混匀样品与试剂，每1000μL转移至一个新的1.5mL离心试管中，12000g，室温离心5min，取上清750μL，避免吸入任何离心管底部的破碎物。每个离心管加入150μL体积的氯仿，手振15s，室温静置5min，之后12000g室温离心15min。此时离心管中样品分为三层，缓慢的使用移液器吸取上清，完全不触碰到中间层，与中间层保持一定距离以防吸入。将上清置于新的1.5mL离心管中，加入375μL的异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g，室温离心10min，弃上清。加入1mL75％乙醇，上下颠倒清洗沉淀，12000g，室温离心5min，按顺序分别使用1000μL，100μL，10μL移液器尽量去除乙醇。室温干燥5min，每个样品用100μL DEPC-H2O溶解20min。

琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解及污染程度

琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖质量浓度为1％，电压为180V，电泳时间为16min；Marker为Trans 2K Plus，序列1为原液稀释3倍上样量1μL；序列2-3、5-7、9、14、15为原液稀释5倍上样量1μL；序列8、10-11、13为原液稀释7倍上样量1μL；序列4、12为原液上样量0.5μL。结果如图1所示，可见序列2，3，5，12样品有轻微蛋白质污染，但少量不影响测序质量。

RNA样品的质量分析和定量

为了获得质量符合测序要求的mRNA样品，对所提取的总RNA样品进行了一系列质量检测。RNA样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.848～1.989区间内，OD₂₆₀/OD₂₃₀值在2.109～2.583区间内，RIN值在7.1～8.5之间。本实验采用NanoDrop检测RNA的纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀，OD₂₆₀/OD₂₃₀)；采用Qubit对RNA浓度进行精确定量；采用Agilent 2100检测RNA的完整性。检测结果如表1所示，其中总RNA样品质量合格标准为：1.8<OD₂₆₀/OD₂₈₀<2.0，OD₂₆₀/OD₂₃₀>2，RIN>6.3，轻微蛋白质污染样本总量要多于6μg，无污染样本总量要多于3μg。

表1湛江等鞭金藻总RNA样品质量分析表。

实施例2

亚心形四爿藻的总RNA样品制备

取约2×10⁸个藻细胞(100mg)，1000g离心2min收集藻细胞，置于-70℃预冷的研钵中，液氮研磨至粉末状。向研钵中加入1mL RNAiso for Polysaccharide-rich PlantTissue，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。将裂解液转移至1.5mL离心管中，12000g，4℃离心5min后，小心吸取上清液，平均分至2个新的1.5mL离心管中。向上述上清中加入1/5体积的5M NaCl和3/5体积的氯仿。盖紧离心管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后，室温静置5min。12000g，4℃离心15min后，匀浆液分为3层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新离心管中。向上清中加入1/2体积的异丙醇和1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠+1.2M NaCl)，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温静置10min。12000g，4℃离心10min，试管底部出现白色沉淀。小心弃去上清，加入75％乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000g，4℃离心5min后，小心弃去乙醇。室温干燥沉淀3min，加入50μL RNA-free水溶解沉淀，置于-70℃保存。将10μg总RNA(不超过26μL)，3μL 10倍DNaseBuffer，1μL DNase用DEPC水调整至30μL，在37℃孵育30min。加入100μL TRIzol混匀；加入20μL氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置3min。4℃，12000g离心15min，将无色上层转移到新的试管中，加入84μL异丙醇，混匀，在室温沉淀15min。4℃，12000g离心15min。取出上清，用1mL75％乙醇清洗两次。用10μL枪头取出全部乙醇，在超净台中室温干燥3-5min。加入10μLRNase-Free水，溶解RNA。将纯化好的RNA置于-70℃保存。

RNA样品的质量分析

检测RNA溶液的OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀，计算比值来衡量样品的纯度和浓度。OD₂₆₀/OD₂₈₀的值为2.17，说明RNA纯度较高，没有DNA污染，但可能有少量异硫氰酸残留。OD₂₆₀/OD₂₃₀的值为1.938，证明去盐比较充分。

取2μL样品，用琼脂糖凝胶电泳(胶浓度：1％，电流：100mA，电泳时间：20min)进一步检测RNA完整性。结果如图2所示，28s，18s和5s三个主要rRNA能清晰分辨；样品纯度较高，没有DNA污染。28s和18s含量比值大于1，说明RNA基本没有降解，完整性较好，可以用于3’RACE和RT-PCR实验。

用Agilent 2100Bioanalyzer检测正常藻液和暗诱导3h后的总RNA质量。暗诱导3h的藻液RNA检测结果如图3所示。28S：18S的值为1.5，说明RNA质量较好，没有降解，可以用于转录组测序。