一种提取枸杞中玉米黄素的方法和应用
阅读说明：本技术 一种提取枸杞中玉米黄素的方法和应用 (Method for extracting zeaxanthin from Chinese wolfberry and application ) 是由 李春美 沈齐若男 朱婷 于 2021-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种提取枸杞中玉米黄素的方法和应用,该提取方法包括,将枸杞粉加入到含离子液体和无机碱的乙醇溶液中,超声提取,一次离心分离后取上清液,随后旋蒸去除乙醇,加入去离子水混匀后在2-7℃下二次离心分离,取沉淀即得。本发明所提供的提取枸杞中玉米黄素的方法采用素有绿色溶剂之称的离子液体与碱和乙醇组成的混合溶剂代替传统提取剂,辅以超声技术,将提取和皂化同时进行,提取彻底且提取效率高,所使用的乙醇溶剂可回收后循环再利用,提取过程对环境影响很小,具有良好的实际应用价值。(The invention provides a method for extracting zeaxanthin from Chinese wolfberry and application thereof, wherein the extraction method comprises the steps of adding Chinese wolfberry powder into an ethanol solution containing ionic liquid and inorganic base, carrying out ultrasonic extraction, taking supernatant after primary centrifugal separation, then carrying out rotary evaporation to remove ethanol, adding deionized water, mixing uniformly, carrying out secondary centrifugal separation at 2-7 ℃, and taking precipitate to obtain the zeaxanthin. The method for extracting the zeaxanthin from the medlar provided by the invention adopts the mixed solvent composed of the ionic liquid called green solvent, alkali and ethanol to replace the traditional extractant, and is assisted by the ultrasonic technology, so that the extraction and the saponification are carried out simultaneously, the extraction is thorough, the extraction efficiency is high, the used ethanol solvent can be recycled after being recovered, the influence of the extraction process on the environment is small, and the method has good practical application value.)
技术领域
本发明涉及中药活性成分的提取技术领域，更具体地，涉及一种提取枸杞中玉米黄素的方法和应用。
背景技术
枸杞营养丰富，《本草纲目》中就已明确记载：宁夏中宁枸杞为上乘名贵药材，具有良好的护眼以及眼疾治疗作用；现有研究证明，枸杞中起眼保健作用的功能性成分主要是以玉米黄素为主的类胡萝卜素，具有预防白内障、老年黄斑病变、癌症、心血管疾病等多种生理功能。
在成熟的枸杞中，类胡萝卜素的组成较为单一，且多以酯化的形式存在，绝大部分为玉米黄素双棕榈酸酯，通过皂化水解可得到大量游离的玉米黄素和少量其他类胡萝卜素，是提取玉米黄素的理想原料之一。
现有技术中，枸杞玉米黄素的提取方法包括：先采用有机溶剂对枸杞中的玉米黄素酯类进行提取，再加入碱液对其进行皂化；该方法不仅步骤繁琐，耗时长，且需使用较多有机溶剂，易对环境造成污染，且具有一定毒性，不符合绿色化学理念。
综上所述，研究开发一种高效环保的提取枸杞中玉米黄素的方法是本领域亟待解决的关键技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取枸杞中玉米黄素的方法和应用。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种提取枸杞中玉米黄素的方法，包括：
将枸杞粉加入到含离子液体和无机碱的乙醇溶液中，超声提取，一次离心分离后取上清液，旋蒸去除乙醇后，加入去离子水混匀后在2-7℃下二次离心分离，取沉淀即得。
在上述技术方案中，所述离子液体为[Bmim]BF4、[Bmim]Cl、[Emim]OAC、[Bmim]OAC和[Hmim]OAC中的一种或多种。
具体地，在本发明的一个优选实施方式中，所述离子液体为[Hmim]OAC。
在上述技术方案中，所述无机碱为NaOH和/或KOH。
具体地，在本发明的一个优选实施方式中，所述无机碱为KOH。
进一步地，在上述技术方案中，在所述乙醇溶液中，所述离子液体的含量为0.075-0.12g/ml。
具体地，在本发明的一个优选实施方式中，在所述乙醇溶液中，所述离子液体的含量为0.1g/ml。
进一步地，在上述技术方案中，在所述乙醇溶液中，所述无机碱的浓度为4-8wt％。
具体地，在本发明的一个优选实施方式中，在所述乙醇溶液中，所述无机碱的浓度为6wt％。
详细地，在上述技术方案中，所述枸杞粉和乙醇溶液的加入量之比为控制其料液比为1：35-42。
再进一步地，在上述技术方案中，所述超声提取的超声时间为35-42min，优选为40min。
再进一步地，在上述技术方案中，所述超声提取的温度为25-50℃，优选为40℃；
再进一步地，在上述技术方案中，所述超声提取的超声功率为400-445W，优选为420W。
在上述技术方案中，所述提取枸杞中玉米黄素的方法还包括，在所述一次离心分离之前，加入醋酸水溶液直至调节混合溶液为中性。
优选地，在本发明的一个
具体实施方式
中，所述醋酸水溶液的浓度为20wt％。
又进一步地，在上述技术方案中，所述去离子水的加入质量为离子液体的质量的9-12倍，优选为10倍。
又进一步地，在上述技术方案中，所述加入去离子水混匀并进行二次离心分离的次数为多次，优选为2-3次。
在上述技术方案中，所述二次离心分离的温度、转速和时间分别为4℃、8000-12000rpm和15-22min。
本发明另一方面还提供上述方法在提取枸杞玉米黄素中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的提取枸杞中玉米黄素的方法采用素有绿色溶剂之称的离子液体与碱和乙醇组成的混合溶剂代替传统提取剂，辅以超声技术，将提取和皂化同时进行，提取彻底且提取效率高，所使用的乙醇溶剂可回收后循环再利用，提取过程对环境影响很小，具有良好的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同离子液体对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图2为本发明实施例1中采用[Hmim]OAC作为离子液体提取枸杞中玉米黄素得到的样品的高效液相色谱图；
图3为本发明实施例2中不同浓度的KOH对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图4为本发明实施例3中不同浓度的离子液体对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图5为本发明实施例4中不同超声时间对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图6为本发明实施例5中不同料液比对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图7为本发明实施例6中不同超声功率对提取枸杞中玉米黄素的含量结果对比图；
图8为本发明对比例1中提取枸杞中玉米黄素得到的样品的高效液相色谱图；
图9为本发明对比例2中提取枸杞中玉米黄素得到的样品的高效液相色谱图；
图10为本发明对比例3中采用传统有机溶剂提取枸杞中玉米黄素得到的样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明实施例中，所使用的原料均为市售产品。
实施例1
本实施例对比了不同离子液体对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含0.1g/ml的离子液体([Bmim]BF4、[Bmim]Cl、[Emim]OAC、[Bmim]OAC和[Hmim]OAC)和6wt％的KOH的乙醇溶液中，控制料液比为1：30，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用HPLC法分析采用不同离子液体情况下提取得到的玉米黄素的含量。
具体地，HPLC法分析的条件和过程如下：
YMC-C30柱(4.6mm×250mm，5μm)；
流动相A相：甲醇-乙腈-水(81：14：5，v/v/v)；
流动相B相：二氯甲烷-甲基叔丁基醚(1：1，v/v)；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：450nm。
洗脱条件：
0min，流动相B：16％；
22min，流动相B：17％；
40min，流动相B：55％；
45min，流动相B：16％；
55min，流动相B：16％。
标准曲线绘制：
称取玉米黄素标准品2mg，用流动相定容至10mL，配成200μg/mL的标准溶液，避光操作，在-80℃下避光保存备用；分别将标准溶液稀释成10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL后，过0.45μm的有机滤头，备用。
以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得到标准曲线如下：
y＝4.19*107x+22850；
其相关系数R2＝0.9999。
不同离子液体对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图1所示；从图1中可以看出，离子液体中阴离子结构对玉米黄素提取得率有显著影响，而阳离子结构不同对玉米黄素提取得率影响较小，不同离子液体对于枸杞中玉米黄素提取效率如下：[Hmim]OAC>[Emim]OAC>[Bmim]OAC>[Bmim]Cl>[Bmim]BF4。
图2所示为本发明实施例1中采用[Hmim]OAC作为离子液体提取枸杞中玉米黄素得到的样品的高效液相色谱图。
实施例2
本实施例对比了不同浓度的KOH对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含0.1g/ml的[Hmim]OAC离子液体和不同浓度(2wt％、4wt％、6wt％、8wt％、10wt％和12wt％)的KOH的乙醇溶液中，控制料液比为1：30，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用与实施例1相同的HPLC法分析不同浓度的KOH情况下提取得到的玉米黄素的含量。
不同浓度的KOH对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图3所示；从图3中可以看出，随着KOH浓度的增大，玉米黄素的含量先增大后减小；当碱溶液浓度小于6wt％时，皂化不完全，未能将玉米黄素酯转化为玉米黄素，使提取的玉米黄素含量低；当碱溶液浓度为6wt％时，玉米黄素的含量达到最大值，继续增加碱溶液的体积分数，玉米黄素含量下降，其原因可能是玉米黄素在强碱环境易分解，不稳定，或由于碱浓度大，水洗次数增多，过程中可能造成玉米黄素损失。
实施例3
本实施例对比了不同浓度的离子液体对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含不同浓度(0.03g/ml、0.05g/ml、0.08g/ml、0.10g/ml、0.12g/ml和0.15g/ml)的[Hmim]OAC离子液体和6wt％的KOH的乙醇溶液中，控制料液比为1：30，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用与实施例1相同的HPLC法分析不同浓度的离子液体情况下提取得到的玉米黄素的含量。
不同浓度的离子液体对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图4所示；从图4中可以看出，随离子液体浓度的增加，玉米黄素的含量先增大后减小，在0.1g/ml时，玉米黄素含量达到最大，随后增加离子液体浓度，玉米黄素含量降低，可能因为随着离子液体浓度增加，提取液体系粘度增加，影响了提取过程，从而造成含量降低。
实施例4
本实施例对比了不同超声时间对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含0.10g/ml的[Hmim]OAC离子液体和6wt％的KOH的乙醇溶液中，控制料液比为1：30，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取不同时间(10min、20min、30min、40min、50min和60min)，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用与实施例1相同的HPLC法分析不同超声时间下提取得到的玉米黄素的含量。
不同超声提取时间对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图5所示；从图5中可以看出，玉米黄素含量随超声时间的增加而逐渐增加，在40min达到最大值；进一步延长提取时间，玉米黄素含量反而下降，这可能是由于较长时间超声波作用过程破坏了玉米黄素。
实施例5
本实施例对比了不同料液比对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含0.10g/ml的[Hmim]OAC离子液体和6wt％的KOH的乙醇溶液中，控制料液比分别为1：20、1：30、1：40、1：50和1：60，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用与实施例1相同的HPLC法分析不同料液比下提取得到的玉米黄素的含量。
不同料液比对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图6所示；从图6中可以看出，玉米黄素含量随料液比的增加而增加，当液料比大于1:40时，对玉米黄素含量影响差别不大，因此1:40为最合适的料液比。
实施例6
本实施例对比了不同超声功率对提取枸杞中玉米黄素的影响，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，分别加入到含0.10g/ml的[Hmim]OAC离子液体和6wt％的KOH的乙醇溶液中，控制料液比为1：40，在40℃、采用不同超声功率(150W、300W、350W、420W、600W和700W)的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后取上清液，随后旋蒸去除乙醇，加入质量为离子液体的10倍的去离子水作为抗溶剂，破坏离子液体与玉米黄素之间相互作用，降低玉米黄素的溶解度，随后在4℃和10000rpm条件下二次离心分离20min，上清液为含有离子液体的水溶液，而玉米黄素则沉积于离心管底部，再次重复加入去离子水作为抗溶剂并二次离心分离2-3次，直至上清液中滴加福林酚不产生沉淀，合并二次离心分离中得到的沉淀，采用与实施例1相同的HPLC法分析不同超声功率情况下提取得到的玉米黄素的含量。
不同超声功率对提取枸杞中玉米黄素的影响的结果如图7所示；从图7中可以看出，超声功率为400W以下时玉米黄素素提取量较低，可能的原因是输出功率较低时，作用于物料上的超声强度不够，不能使其充分的受到超声波作用；随着超声波输出功率的增大，物料内部分子扩散增加，提取出来的类胡萝卜素随之增多，在420w时达到最大；高功率会对机器有一定程度的损耗；生产成本也会相应增加；因此超声波输出功率为420W左右为宜。
对比例1
本对比例提供了一种离子液体提取枸杞中玉米黄素的方法，具体过程如下：
称取0.2g冻干枸杞粉，以料液比为1：30的比例加入到含0.1g/ml的[Hmim]OAC离子液体的乙醇溶液中，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后，向提取液中加入6ml的氯化钠饱和溶液与12ml的甲基叔丁基醚，将类胡萝卜素转移到醚层，收集上清液，下层用甲基叔丁基醚重复萃取2-3次，合并上清液，旋转蒸发仪上浓缩，定容到一定体积后，进行HPLC分析。
检测结果如图8所示，不论是玉米黄素还是玉米黄素双棕榈酸酯得率都很低，且杂峰较多，其中，玉米黄素的得率为2.06mg/100g；表明，提取液中未加碱，离子液体和乙醇复合溶剂无法对枸杞类胡萝卜素进行有效提取，可能由于枸杞中类胡萝卜素主要以玉米黄素酯类为主，而玉米黄素酯类，不具有氢键结合位点故离子液体无法与之结合，从而造成提取效率低。
对比例2
本对比例提供了一种离子液体提取枸杞中玉米黄素的方法，具体过程如下：
称取0.5g冻干枸杞粉，加入6wt％的KOH-乙醇溶液后充氮气，在黑暗中皂化6h，离心去除上清液，以料液比为1：30的比例加入到含0.1g/ml的[Hmim]OAC离子液体的乙醇溶液中，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在10000prm下离心2min后，向提取液中加入6ml氯化钠饱和溶液与12ml甲基叔丁基醚，将类胡萝卜素转移到醚层，收集上清液，下层用甲基叔丁基醚重复萃取2-3次，合并上清液，旋转蒸发仪上浓缩，定容到一定体积后，进行HPLC分析。
检测结果如图9所示，采用先皂化-后离子液体提取的方式，同样无法对枸杞类中的胡萝卜素进行有效提取，其中，玉米黄素的得率为1.67mg/100g；其原因可能是由于枸杞植物细胞壁较厚，在较温和条件下无法将枸杞中类胡萝卜素酯皂化成游离态，故后续无法有效提取。
对比例3
本对比例提供了一种采用传统有机溶剂提取枸杞中玉米黄素的方法，具体过程如下：
称取冻干枸杞粉0.2g，加入到16mL体积比为2：1：1的正己烷、丙酮和乙醇(0.1％BHT)中，在40℃、超声功率为350W的条件下超声提取40min，随后在4℃、10000prm下离心4min后，于旋转蒸发器上在35℃的条件下蒸干；将残渣溶于2ml甲基叔丁基醚中，加入2ml15w/v％的KOH-甲醇溶液，充氮气，在黑暗中皂化6h；皂化后，用2ml甲基叔丁基醚和4ml氯化钠饱和溶液分离，收集上清液，下方水层用4mlMTBE重复萃取3次。将上清液混合，于旋转蒸发器上在35℃的条件下蒸干，二氯甲烷定容到10ml，进行HPLC分析，检测结果如图10所示。
通过比较本对比例中采用传统有机溶剂(图10)与离子液体提取枸杞中类胡萝卜素(图2)的高效液相色谱图，可以看出，这两种方法提取得到的枸杞类胡萝卜素组成含量并无差异，且枸杞中玉米黄素含量可达总类胡萝卜素的93％。
如下表1所示，采用本发明实施例所提供的在优化条件下离子液体提取得到玉米黄素含量为296.45mg/100g，与传统方法相比提取得率提高了23.08％，并且本实验中采取的提取皂化同时进行，可解决传统提取中步骤繁琐问题，同时也大大缩短了提取时间。
表1本发明离子液体提取与传统有机溶剂提取的对比表
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。