阅读说明：本技术 一种使用磷脂改善均质乳脂肪球膜结构及成分的工艺 (Process for improving structure and components of homogenized milk fat globule membrane by using phospholipid ) 是由 陆乃彦 王霁月 陈喆 杨国锋 翁雨燕 于 2020-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种使用磷脂改善均质乳脂肪球膜结构及成分的工艺,属于乳品加工领域。本发明以生鲜牛乳和天然大豆磷脂为主要原料,通过配料和均质处理,得到的液态乳具有更小的颗粒大小,更完整的磷脂膜结构,降低了均质乳脂肪球表面的乳清蛋白和酪蛋白吸附,而含有更高比例的XDH、PASⅢ/Ⅲ等MFGM功能蛋白；乳中脂肪的消化量相对于普通均质乳增加了9.6％,且脂肪颗粒变化过程更符合鲜奶天然消化状态,达到改善乳脂肪球膜MFGM蛋白功能和强化牛乳营养的目的。该方法适用于液态乳、乳粉及其他乳制品。(The invention discloses a process for improving the structure and components of a homogeneous milk fat globule membrane by using phospholipid, belonging to the field of dairy processing. The invention takes fresh milk and natural soybean phospholipid as main raw materials, and the obtained liquid milk has smaller particle size and more complete phospholipid membrane structure through batching and homogenizing treatment, reduces the adsorption of whey protein and casein on the surface of homogenized milk fat globule, and contains MFGM functional protein such as XDH, PAS III/III and the like with higher proportion; compared with common homogenized milk, the digestion amount of fat in milk is increased by 9.6%, and the change process of fat particles is more consistent with the natural digestion state of fresh milk, so that the aims of improving the function of milk fat globule membrane MFGM protein and strengthening the nutrition of milk are fulfilled. The method is suitable for liquid milk, milk powder and other dairy products.)

一种使用磷脂改善均质乳脂肪球膜结构及成分的工艺

技术领域

本发明涉及一种使用磷脂改善均质乳脂肪球膜结构及成分的工艺，属于乳品加工领域。

背景技术

乳及乳粉对于婴幼儿是主要的营养和能量来源，也是成年人获取营养的良好来源。世界上保持着食用动物乳的人群数以亿计，在某些发达国家甚至将乳作为解渴的饮料。乳脂肪在乳中的存在形式为微米级的球体，天然的乳脂肪球(MFG)表面包被着以三层磷脂膜层结构为骨架的乳脂肪球膜(MFGM)。MFGM的组成和结构有着特殊的生理作用，其不仅可以作为油水界面的乳化剂，维持结构稳定，还能阻止乳脂肪球聚合、防止酶退化、影响消化进程等作用。MFGM中25％～60％为种类丰富的蛋白质，虽然只占乳中总蛋白含量的1％～2％，但其蛋白种类占了乳汁的90％，且有相当数量的功能蛋白，例如黄嘌呤脱氢酶/氧化酶、嗜乳脂蛋白、组织糖蛋白高碘酸稀尔6/7、脂肪酸结合蛋白、血小板糖蛋白4、黏蛋白-1和脂滴包被蛋白等。MFGM蛋白虽然在乳中含量甚微，但却具有重要的生物学意义，如抗癌作用、抗菌性和抗黏着性以及对脑脊髓炎的自身免疫作用等，都是不容被忽视的。

市场上现有液态乳的生产绝大部分都要进行均质处理。均质处理在提高了液态乳稳定性的同时会导致乳脂肪结构产生较大改变：MFGM结构破坏，随之造成原生MFGM蛋白脱落，从而可能阻碍功能膜蛋白的作用；同时大量乳清蛋白和酪蛋白等水相蛋白吸附在乳脂肪球表面形成新膜层，新膜层中磷脂含量下降；以及消化状态的改变等，如在消化前期速度过快等问题。

发明内容

为了解决上述至少一个问题，本发明以生鲜牛乳和磷脂为主要原料，通过配料和均质处理，得到的液态乳具有更小的颗粒大小，更完整的乳脂肪球膜结构，降低了均质乳脂肪球表面的乳清蛋白和酪蛋白吸附，而含有更高比例的XDH、PASⅢ/Ⅲ等MFGM功能蛋白；乳中脂肪的消化量相对于普通均质乳增加了9.6％，且脂肪颗粒变化过程更符合鲜奶天然消化状态，达到改善乳脂肪球膜MFGM蛋白功能和强化牛乳营养的目的。

本发明的第一个目的是提供一种改善液态乳中乳脂肪球膜结构稳定性的方法，包括如下步骤：

在牛奶中加入磷脂，进行预分散、保温、均质，得到液态乳。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂的添加量为牛奶质量的0.1％-1％。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂的添加量优选为牛奶质量的0.5％-1％。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷脂为大豆磷脂、油菜籽磷脂、红蚕豆磷脂、葵花籽磷脂、黑小麦磷脂、玉米磷脂、花生磷脂、鸡蛋磷脂、猪肝磷脂、牛脑磷脂、鸡肝磷脂、鱼头磷脂、奶磷脂中的一种或者几种。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷脂为大豆磷脂或蛋黄磷脂，其中大豆磷脂中磷脂纯度(丙酮不溶物含量)≥95％。

在本发明的一种实施方式中，所述的牛奶是将3-5℃的生鲜牛奶在70-80℃保持20-40min灭活脂肪酶得到的，是为了保证消化实验的脂肪不被消耗以及防止样品过快变质。

在本发明的一种实施方式中，所述的牛奶是将4℃的生鲜牛奶在73℃保持30min灭活脂肪酶得到的，是为了保证消化实验的脂肪不被消耗以及防止样品过快变质。

在本发明的一种实施方式中，所述的预分散是用高速分散机以6000-7000rpm的速度将样品预混合0.5-3分钟。

在本发明的一种实施方式中，所述的预分散是用高速分散机IKA T-18以6300rpm的速度将样品预混合1分钟。

在本发明的一种实施方式中，所述的保温是在45-55℃保温8-20min。

在本发明的一种实施方式中，所述的保温是在50℃保温10min。

在本发明的一种实施方式中，所述的均质是15-25Mpa条件下均质。

在本发明的一种实施方式中，所述的均质是20Mpa条件下均质。

本发明的第二个目的是提供一种制备富含乳脂肪球膜结构的牛奶的方法，所述方法包括如下步骤：

在牛奶中加入磷脂，进行预分散、保温、均质，得到液态乳。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂的添加量为牛奶质量的0.1％-1％。

在本发明的一种实施方式中，所述磷脂的添加量优选为牛奶质量的0.5％-1％。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷脂为大豆磷脂、油菜籽磷脂、红蚕豆磷脂、葵花籽磷脂、黑小麦磷脂、玉米磷脂、花生磷脂、鸡蛋磷脂、猪肝磷脂、牛脑磷脂、鸡肝磷脂、鱼头磷脂、奶磷脂中的一种或者几种。

在本发明的一种实施方式中，所述的磷脂为大豆磷脂或蛋黄磷脂，其中大豆磷脂中磷脂纯度(丙酮不溶物含量)≥95％。

本发明的第三个目的是本发明所述的方法制备得到的富含乳脂肪球膜结构的牛奶。

本发明的有益效果：

本发明以生鲜牛乳和磷脂为主要原料，通过配料和均质处理，得到的液态乳具有更小的颗粒大小，更完整的脂肪球膜结构，降低了均质乳脂肪球表面的乳清蛋白和酪蛋白吸附，而含有更高比例的XDH、PASⅢ/Ⅲ等MFGM功能蛋白；乳中脂肪的消化量相对于普通均质乳增加了9.6％，且脂肪颗粒变化过程更符合鲜奶天然消化状态，达到改善乳脂肪球膜MFGM蛋白功能和强化牛乳营养的目的。该方法适用于液态乳、乳粉及其他乳制品。

附图说明

图1为实施例1、对照例1、对照例2的微观结构图；其中，蛋白质使用FITC(fluorescein isothiocyanate)染色，为图中浅色荧光，磷脂类使用rh-DPOE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-

phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl))染色，为图中深色荧光。

图2为实施例1和对照例2的液态奶的脂肪球蛋白含量图。

图3为实施例1和对照例2的液态奶的脂肪球膜蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图4为实施例1、对照例1、对照例2在乳消化过程中游离脂肪酸(FFA)释放过程对比。

图5为对照例2普通均质组消化不同时间的颗粒大小分布。

图6为实施例1的液态奶消化不同时间的颗粒大小分布。

图7为实施例2中不同大豆磷脂含量的液态乳的平均粒度图。

图8为实施例3中不同蛋黄磷脂含量的液态乳的平均粒度图。

图9为实施例1、2、3的液态奶进行MFG(乳脂肪球)总蛋白含量测试结果。

图10为实施例1、2、3的液态奶进行MFGM蛋白含量的测试结果。

图11为实施例1、2、3的液态奶提取MFGM蛋白质的SDS-PAGE电泳图。

图12为实施例2中大豆磷脂添加量为0.1％和0.2％时得到的液态奶的微观结构图。

图13为实施例3中蛋黄磷脂添加量为0.1％、0.2％、0.5％时得到的液态奶的微观结构图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

测试方法：

1、微观结构：

在0.2mL样品中滴加2μL Nile Red溶液(Nile Red 1mg/mL溶于丙酮)来标记其中的中性脂质；极性脂质使用5μLRh-DOPE溶液(Rh-DOPE 1mg/mL溶于氯仿)，乳蛋白使用5μLFITC(FITC 3.2mg/mL溶于乙醇)多次振筛混合样品以使荧光染料FITC分子和被染物质乳蛋白充分结合，之后在20℃条件下静置20min使之平衡，随后和0.2mL的琼脂糖溶液(5g/L，45℃保存)混合。取出25μL的样品滴加在玻璃载玻片上，覆盖玻璃盖玻片，在63倍油浸物镜下观察。Rh-DOPE染料的激发波长为561nm，FITC染料的激发波长为488nm；Nile Red染料的激发波长为514nm。

2、脂肪球蛋白含量测试：

乳样在25℃和4000rpm离心25分钟，收集上层乳脂。乳脂中的蛋白含量使用凯氏定氮法测定，见GB 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

3、SDS-PAGE电泳：

分离好的MFGM蛋白通过添加等体积的缓冲液(25mM Tris HCl、10％甘油(v/v)、2％十二烷基硫酸钠(w/v)和0.1％溴酚蓝(w/v)，其中％均为占水溶液的体积百分比)制备MFGM蛋白溶液用于SDS-PAGE。在还原条件下，加入5％β-巯基乙醇样品。分离使用12％丙烯酰胺凝胶。SDS-PAGE使用Mini Protean II Xi系统(Bio-Rad公司)，在10℃的条件下，以每凝胶10mA和每凝胶20mA的条件进行SDS-PAGE，直到追踪染料前沿到达凝胶底部。运行缓冲液为25mM TrisHCl，200mM甘氨酸，0.1％w/v SDS。用胶体考马斯亮蓝G250(Bio-Rad实验室)对凝胶进行过夜染色。

4、在乳消化过程中游离脂肪酸(FFA)释放：

模拟小肠液(Simulated intestinal fluid，SIF)根据美国药典配制，其中含有6.8g K2HPO4和190mL 0.2M NaOH，稀释至1L，pH调整到7.5以模拟肠道环境，离子强度略有调整，使之最终含有150mM NaCl(Ye A,Cui J,Singh H.Effect of the fat globulemembrane on in vitro digestion of milk fat globules with pancreatic lipase[J].International Dairy Journal,2010,20(12):822-829.)。

牛乳的体外消化使用pH-stat方法。模拟消化系统包含有一个250mL酶反应器，其中含有25mL SIF和25mL牛奶样品，牛奶样品预先将pH调整到7.5，然后和SIF分别37℃下保温10min后混合，每份SIF中含有胰酶(15mg，4×USP specifications)和胆汁盐(125mg)，胰酶和胆汁盐的最终浓度分别为0.3和2.5mg/mL。整个体系维持在37℃和500rpm的条件下以模拟实际人体肠道的温度和蠕动。消化过程中游离脂肪酸的释放量通过测定滴定所使用的NaOH(0.01M)来测定，每次滴定以使pH达到7.5为终点；每份次级样品(消化过程中吸取出的样品)(0.5mL)在0、5、10、20、30、60、90、120、150和180min取出作后期分析。

5、平均粒度：

基于多源激光衍射法，使用Microtrac S3500粒径分析仪测定乳脂肪球的初始粒径和消化过程粒径变化。乳脂肪在466和633nm下的折射率分别为1.460和1.458.将样品用去离子水直接在样品池中稀释，直到仪器软件显示吸收率为约0.1，稳定后进行测定.粒径结果用D_3,2(体积-表面积平均直径，定义为其中n_i为直径为d_i的粒子数目)和D_4,3(质量-体积平均直径，定义为)，以及Dm(多数直径)来表示。

6、脂肪球膜蛋白的测试：

MFGM蛋白的分离：乳样在25℃和4000rpm离心25分钟，收集上层乳脂。提取的乳脂样品，在42℃水浴中加入PBS(pH 7.2)10min，轻轻摇动，然后在25℃和4000g下离心10min，得到乳膏。反复冲洗乳膏，直到离心后清洗干净。然后向样品中加入去离子水，并在上述条件下离心进行最终清洗。将洗净的乳脂和0.4％十二烷基硫酸钠溶液按1:1的体积比混合，超声处理1分钟，在4℃下以5000g离心10分钟，下层液体为含有MFGM样品的溶液，使用BCA分析试剂盒(美国Thermo Scientific Pierce BCA蛋白检测试剂盒)测定其浓度。

7、稳定性测试：

将制备好的乳样品于Turbiscan稳定性分析仪(法国Formulaction公司)中测定稳定性，测定时长为6h。

实施例1

将取得的生鲜牛奶4℃运输，取乳200mL进行73℃保持30min灭活脂肪酶以保证消化实验的脂肪不被消耗以及防止样品过快变质；随后在牛奶中加入原奶质量0.5％的大豆磷脂，用高速分散机(IKA T-18)以6300rpm的速度将样品预混合1分钟，50℃保温10min后，在20Mpa条件下均质，得到液态乳。

对照例1原奶

对牛奶不进行任何处理，得到原奶。

对照例2普通均质

将取得的生鲜牛奶4℃运输，取乳200mL进行73℃保持30min灭活脂肪酶以保证消化实验的脂肪不被消耗以及防止样品过快变质；随后将牛奶在20Mpa条件下均质5次，得到液态乳。

将实施例1和对照例1、2的液态奶进行性能测试：

脂肪球粒度的测试结果如表1所示。从表1可以看出：实施例1的液态乳相比对照例2的普通均质乳具有更小的颗粒大小，相比于对照例2的普通均质的0.68μm下降了30.9％，达到了0.47μm，有更好的稳定性。

表1为不同条件下均质效果的对比

图1为实施例1、对照例1、对照例2的微观结构图。从图1可以看出：对照例1的原奶和实施例1经过处理的液态奶具有箭头所指空心球所表征的磷脂膜层结构；而对照例2经过普通均质的液态乳则没有该结构，磷脂都是以碎片存在，脂肪球表面被大量的水相蛋白质所包围。

图2为实施例1和对照例2的液态奶的脂肪球蛋白含量图。从图2可以看出：相对于对照例2的液态奶，实施例1的液态奶中脂肪球蛋白含量降低，即脂肪球上磷脂含量相对升高；且膜蛋白含量更高。

图3为实施例1和对照例2的液态奶的脂肪球膜蛋白的SDS-PAGE电泳图。从图3可以看出：相对于对照例2普通均质组的液态奶，添加了磷脂的实施例1的液态奶中的MFGM蛋白(包括XDH(xanthine dehydrogenase/oxidase)、PASⅢ/Ⅲ(PAS-3(mucin 15)；PAS-4(cluster of differentiation 36,CD36))、BTN1A1(Butyrophilin subfamily 1memberA1)、MFGE8(lactadherin)等)占比含量更高，水相蛋白如酪蛋白(Casein)和乳清蛋白(β-Lg(β-lactoglobulin)、α-Lg(α-lactalbumin))含量更低，即MFGM蛋白在膜上占比更高，有利于其发挥生物活性。

图4为实施例1、对照例1、对照例2在乳消化过程中游离脂肪酸(FFA)释放过程对比。从图4可以看出：乳中脂肪的消化量(释放2133μmol游离脂肪酸)相对于普通均质乳(释放1946μmol游离脂肪酸)增加了9.6％；如图4所示，在消化初始阶段之后实施例1的液态乳的消化速度(以脂肪酸释放速率代表)高于均质组。相比于普通均质奶，实施例1的液态奶和鲜奶更加类似，在后期有高消化速度，其消化状态更接近天然。

图5为对照例2普通均质组消化不同时间的颗粒大小分布。图6为实施例1的液态奶消化不同时间的颗粒大小分布。从图5和图6可以看出：相比于普通均质奶消化产生的颗粒在60min完全回归到了较小的大小状态，实施例1的液态奶更快的(10min时已有大部分消化产物颗粒大小较小)达到该状态，说明其消化过程更容易进行。

实施例2

调整实施例1中大豆磷脂的添加量为0.1％、0.2％、0.75％、1％，其他参数保持不变，得到液态奶。

实施例2得到的液态奶的平均粒度测试结果如图7所示。

实施例3

调整实施例1和2中的大豆磷脂(s)为蛋黄磷脂(e)，其他参数保持不变，得到液态奶。

实施例3得到的液态奶的平均粒度测试结果如图8所示。

从图7和图8可以看出：添加大豆(s，图中数字代表添加百分比)和蛋黄(e，图中数字代表添加百分比)磷脂后同等均质条件得到乳脂肪球粒度更小，分布更均匀，也就说稳定性更高。

将实施例1、2、3的液态奶进行MFG(乳脂肪球)总蛋白含量的测试，结果如图9所示。从图9可以看出：s0.2、s0.5、e0.2、e0.5相对于对照(普通均质乳)脂肪球膜蛋白含量显著升高。

将实施例1、2、3的液态奶进行MFGM蛋白含量的测试，结果如图10所示。从图10可以看出：除s1.0(1％大豆磷脂)外其他组相对于对照(均质乳)脂肪球膜蛋白含量显著升高，可能代表着新脂肪球上更多的MFGM蛋白。

图11为实施例1、2、3的液态奶提取MFGM蛋白质的SDS-PAGE电泳图。从图11可以看出：0.1％、0.5％大豆磷脂，0.2％、0.5％蛋黄磷脂组酪蛋白和乳清蛋白含量均低于对照例2的普通均质；0.2％、0.5％大豆磷脂组BTN和XDH含量高于对照，0.1％蛋黄磷脂组、0.5％大豆磷脂组MFGM 8含量高于对照例2的普通均质。

图12为实施例2中大豆磷脂添加量为0.1％和0.2％时得到的液态奶的微观结构图。从图中可以看出：大豆磷脂有利于形成膜状包被结构。

图13为实施例3中蛋黄磷脂添加量为0.1％、0.2％、0.5％时得到的液态奶的微观结构图。从图中可以看出：蛋黄磷脂有利于形成包被结构。

将实施例1的液态奶、对照例1的原奶、对照例2中普通均质的液态奶、实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶进行稳定性的测试。测试结果如下：

表2稳定性指数(TSI)评价

	25℃TSI
		实施例1的液态奶	4.30
实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶	0.75
		对照例2中普通均质的液态奶	1.07
对照例1的原奶	0.84

*稳定性指数是由样品的稳定性谱图的变化程度计算得来，反应了样品稳定性程度，指数越大，样品的稳定性变化越大，稳定性越差。样品的主要变化为都存在顶部上浮问题，同时还存在一定的颗粒团聚，对照例1的原奶上浮问题和颗粒团聚问题都较为明显。

表3分散相分散均匀性评价

	25℃均匀度指数
		实施例1的液态奶	0.16
实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶	0.11
		对照例2中普通均质的液态奶	0.29
对照例1的原奶	0.21

*分散均匀性指数，表征了样品中各个分散组分在体系中的分散均匀性程度，分散均匀性指数越大，样品的分散均匀性程度越差。就分散均匀性而言，实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶的分散均匀性最好。

表4背散射光强绝对值评价

	25℃光强绝对值
		实施例1的液态奶	57.51
实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶	59.3
		对照例2中普通均质的液态奶	59.39
对照例1的原奶	41.4

表5背散射光强变化值评价

	25℃光强变化值
		实施例1的液态奶	-0.21
实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶	-0.15
		对照例2中普通均质的液态奶	0.16
对照例1的原奶	-1.93

*表5中绝对值越大表明样品颗粒团聚越大，对照例1的原奶颗粒团聚明显。

表6分层分析评价

	25℃顶部峰高@6h	25℃顶部分层高度@6h
			实施例1的液态奶	21.63	1.23
实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶	11.30	1.85
			对照例2中普通均质的液态奶	16.68	1.22
对照例1的原奶	27.83	3.07

从表6可以看出：样品整体都存在顶部上浮的问题，峰值越高，浓度变化越大。一般而言，在峰高和分层宽度比较分析，峰高更为重要。实施例1中液态奶和实施例3中蛋黄磷脂含量为0.5％的液态奶的峰高都不大。

对照例1

调整实施例1中大豆磷脂的加入时机为均质之后，其他参数和实施例1保持一致得到液态乳。

均质之后加，磷脂呈现原本的粉末状和块状，如同在水中加入肉块一般，无法溶解和分散，因此得到的液态奶肉眼可见完全不均匀。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的技术和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。