阅读说明：本技术 芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of ethanol extract of gorgon fruit leaves ) 是由 叶满红 周斌 于 2020-07-20 设计创作，主要内容包括：芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用,涉及蜜蜂的蜜蜂美洲幼虫病防治技术领域。将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡,经抽滤,取滤液旋转蒸发,取得芡实叶子的乙醇提取物。将该提取物溶解于二甲基亚砜中,用于防治蜜蜂美洲幼虫病。该提取物的使用不存在停药期,在蜂群的整个生产及繁殖阶段均可安全使用,有助于维护蜂群的健康,促进蜂群整体生产力的提高。(A preparation method and application of an ethanol extract of gordon euryale leaves relate to the technical field of prevention and treatment of bee American larva diseases of bees. Grinding the dried gordon euryale seeds in the shade into powder, soaking the powder in an ethanol water solution, performing suction filtration, taking filtrate, and performing rotary evaporation to obtain an ethanol extract of the gordon euryale seeds. The extract is dissolved in dimethyl sulfoxide for preventing and treating American larva of bee. The extract has no drug withdrawal period, and can be safely used in the whole production and reproduction stage of bee colony, which is helpful for maintaining health of bee colony and promoting improvement of integral productivity of bee colony.)

芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及蜜蜂的蜜蜂美洲幼虫病防治技术领域。

背景技术

蜜蜂是重要的经济昆虫，蜜蜂是传花授粉媒介的重要组成部分,是构成全球生物多样性的重要组成成分,它们对作物、水果和野生植物的授粉活动，使其成为世界范围内最重要的传花授粉昆虫之一，不仅对于农业生产意义重大，更是在维系生物多样性中扮演着重要角色。同时，蜜蜂生产的蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆、蜂胶等蜜蜂产品也是重要的保健食品和化工原料。

美洲幼虫病(American Foulbrood，AFB，又称美洲幼虫腐臭病、美洲幼虫腐烂病)，简称美腐病，是一种恶性的蜜蜂幼虫传染病，在世界范围内均有发生。美洲幼虫病与幼虫芽孢杆菌感染有关，该病的发生与幼虫的抵抗力有很大的关系，主要是通过已经感染的蜜蜂饲喂蜂群幼虫，使得该病迅速在蜂群的幼虫间快速传播。通常现代的处置方式是在蜂群确诊该病后需要就地焚烧处理，防止疾病扩散。AFB的病原是幼虫芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae)，属于一种***。蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌的敏感性随着日龄的增长而降低，在每个感染的幼虫体内能产生数以亿计的、具有感染能力的孢子，由于其孢子对热和化学物质有极强的抵抗力，可存活长达35年之久，导致AFB感染后，幼虫残骸的鳞片、蜂箱、产品和设备都是潜在的污染源。

目前用于治疗AFB的抗生素很多，如磺胺类药物、盐酸土霉素、四环素、青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉素、红霉素、泰乐霉素等，药物通常配用糖浆或者蜜水，勾兑后喷施。每次糖浆和蜜水用量，每脾用100-150mL，间隔4-5d喷施1次。但是，连续使用抗生素有污染蜂产品的可能。为此，用药用量要控制得当，尤其要避开生产季节，防治抗生素在蜂产品中的残留。而且，尽量选择早春或晚秋，治疗效果则会更好些。然而，总体来看，抗生素会在蜂产品中残留，严重影响蜂产品的质量，给人类的健康造成威胁。除此之外，抗生素还会使蜜蜂病原体的耐药性增强，导致病原体产生相应的变异，使得蜂群患病更加严重。

可见，通过使用抗生素对AFB进行防控，往往因超量使用，或者使用抗生素时间不当很容易造成蜂产品中抗生素残留超标，抗生素只能抑制临床症状并不能对孢子发挥作用，且接触了抗生素的幼虫和成蜂，其寿命明显缩短，更严重的是耐药性的产生是导致其对AFB已无法有效地控制主要原因，在全世界范围内给养蜂者造成了巨大的经济损失，与此同时也直接影响了人们食品安全问题。

为了减少养蜂生产中抗生素的使用，人们采用植物进行蜂病的防治。如山西振兴鱼蜂药业公司的纯中药制剂-毒螨菌一次净、甘肃天水汇涛蜂业公司的中草药植物粉剂-健蜂抗螨香粉、山西卫鹏制药有限公司的中草药制剂-蜂康等。不过，目前这些治疗蜂病的产品从种类和疗效上都不能较好满足绿色蜂业的发展需要。还有通过拮抗性细菌发挥生物防控作用，如Evans and Armstrong首次成功地利用培养的P.larvae对幼虫芽孢杆菌引起的AFB进行了生物防控；日本研发的原露技术，对防治蜂病，特别是爬蜂病、大肚病、幼虫病和蜜蜂痢疾等有明显的预防效果，不过其作用谱窄、药效慢、持效短、且易受外界条件的影响。

目前在全世界范围蜜蜂的种群数量逐年递减，在引起蜜蜂种群锐减的诸多因素中，病原体对抗生素产生耐药性，是导致蜂群疾病防控失败的主要原因。随着抗生素类药物的长期使用，蜂群耐药性病菌不断出现，药物抗性问题日显突出，而因为药效逐渐降低、抗生素的用量又不断加大，由此形成了一个恶性循环。

发明内容

本发明目的在于提出一种天然的、能够替代抗生素的植物源的用于防治蜜蜂美洲幼虫病的芡实叶子的乙醇提取物。

本发明芡实叶子的乙醇提取物的制备方法是：将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡，经抽滤，取滤液旋转蒸发，取得芡实叶子的乙醇提取物。

所述芡实叶子的乙醇提取物的含水量为10～20wt.％。

所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分数为75～85％。

本发明工艺简单，经试验证实其对蜜蜂幼虫芽孢杆菌具有抑制效果。

本发明另一目的是提出上述制备方法取得的芡实叶子的乙醇提取物的应用。

将所述芡实叶子乙醇提取物溶解于二甲基亚砜中，用于防治蜜蜂美洲幼虫病。

经试验证实，不同的芡实叶子乙醇提取物都对蜜蜂幼虫芽孢杆菌具有抑制效果，这为开发防治AFB提供了天然药物及饲料奠定了基础，同时也为绿色养蜂生产寻找出新型的、天然的、能够替代抗生素的植物源制剂。

更优越的是芡实叶子乙醇提取物的使用不存在停药期，在蜂群的整个生产及繁殖阶段均可安全使用，有助于维护蜂群的健康，促进蜂群整体生产力的提高。植物源抗生素替代制剂可减少抗生素的使用、降低蜂产品中抗生素的残留，提高蜂产品的产量和质量。

附图说明

图1为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为芡实叶子提取物的抑菌效果图。

具体实施方式

1、材料与方法：

1.1实验材料

1.1.1实验样本的采集

蜜蜂的成虫及幼虫采集于当地转地放蜂的蜂场，在已经有临床症状的蜂群中，取成年有临床症状的蜜蜂及有临床症状的幼虫分别放入无菌的指型管中，置于冰上。同时，收取来自同一蜂场看起来是健康的蜂箱及巢脾的成年蜜蜂及幼虫带回，并置于-70℃冷冻保存。

1.1.2芡实叶子提取物的制备

将采集来的阴干的芡实叶子研磨，分别称取20g粉末，按照1:20的质量比例分别用体积百分数为75～85％的乙醇水溶液浸泡2h后抽滤，再将抽滤后的粉末继续浸泡24h后再抽滤，如此反复3、4次，合并各抽滤所得的滤液，利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得芡实叶子乙醇提取物。

经检测取得的芡实叶子乙醇提取物的含水量为10～20wt.％。

1.1.3实验试剂的配置

制备Luria-Bertani液体培养基：将酵母抽提物1g、胰化蛋白胨0.5g和氯化钠0.5g混合后，采用缓冲液调整pH值至7.2，加入适量双蒸水定容到100mL，高压灭菌，降温，取得Luria-Bertani液体培养基。

制备蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉：将25％蜂王浆、50％雄蜂蛹粉、15％蛋白粉和10％蜂王幼虫粉混合，合计100％，经冷冻干燥，取得蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉。

将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉分包装、密封后置于-20-20℃保存。

1.1.4实验仪器

南京优普环保设备有限公司出品的制水机；METTLERTOLEDO电子天平；SHEL LAB水浴锅；5834R型冷冻离心机；Telstar LyoQuest冻干机；GHX9160B-1培养箱；超低温冰箱；SW-CJ-2HD超净工作台。

1.2.实验方法

1.2.1蜜蜂样本的处理

取自已经发病蜂群的幼虫采用PBS(幼虫和PBS的混合比为10g∶100ml)匀浆得悬浮液，然后在80℃下加热10min或95-96℃加热3-5min。

将已经发病蜂场的成年蜜蜂用PBS充分荡洗，所得到的样品分为三份，每份分别进行三种处理：不经加热处理；在80℃下热处理10min；在95℃下热处理3min。

将已经发病蜂场的成年蜜蜂用PBS充分荡洗，取出肠子，采用PBS(肠子和PBS的混合比为10g∶100ml)匀浆30sec。再将匀浆液通过滤纸过滤、离心，取沉淀再重新悬浮在PBS中。

1.2.2细菌的分离培养

将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉溶于PBS(培养粉和PBS的混合比为10g∶100ml)，并用一次性滤器除菌后，取得蜜蜂芽孢杆菌的培养液。

将蜜蜂芽孢杆菌的培养液和液体Luria-Bertarfi培养基按体积占比为20％的比例混合，取得培养液。

将以上培养液分别涂抹于无菌培养盘上，再将经过1.2.1处理的样品分别涂抹于各个培养基上，在37℃下培养1～3天。

结果发现：各无菌培养盘中细菌生长旺盛，菌落聚集成团。

说明：在以上培养粉中的确含有幼虫芽孢杆菌生长所需的物质，并且将其作为营养组分添加于普通LB培养基后，可以用于幼虫芽孢杆菌的实验室培养。

在各份培养基上挑取单菌落再移入与对应的相同的培养液中进行扩大培养。

通常幼虫芽孢杆菌单菌落小、规则、大多粗糙、扁平或凸起，呈白色至米色。

1.2.3细菌DNA的提取、扩增

对各个扩大培养后的单菌落DNA进行提取，方法如下：用灭菌牙签挑取各培养基上长出的单个菌落，将其悬浮在50μL蒸馏水中，加热至95℃维持15min，离心5min后，取1-5μL上清液用作PCR的模板。

PCR(50μL)反应体系，其中包括：1-5μL模板DNA；50pmol/L正向(AFB-F)和反向引物(AFB-R)；包括10nmol/L dNTPs、2mM MgCl₂、1-2.5U的Taq聚合酶的Mix；ddH₂O。

扩增条件：95℃预变性1min，93℃变性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环后于72℃延伸5min。

1.2.4菌落PCR鉴定

对培养基上生长的细菌单克隆，进行菌落PCR鉴定：用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，在约1100bp位置附近出现目的条带，见图1所示。

图1中泳道M为DL2000 DNA marker，泳道2为阴性对照，泳道1,3-8为菌落PCR的扩增产物。

由菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图说明：以上经过1.2.1处理的样品都携带AFB的幼虫芽孢杆菌。

1.2.5芡实叶子提取物抑菌效果的测定

将芡实叶子乙醇提取物用二甲基亚砜溶解配成1g/mL的溶液，然后再用二甲基亚砜进行梯度稀释，制出浓度分别为200mg/mL、100mg/mL、50mg/mL、25mg/mL和12.5mg/mL的5个浓度梯度的芡实叶子乙醇提取物。

将以上培养液分别涂抹于无菌培养盘上，再以经过1.2.1处理的样品分别进行涂布平板，待菌液干后，用灭菌的枪头对每份菌液干后的涂布平板戳出小洞若干，然后在小洞中分别滴入上述5个浓度梯度的芡实叶子乙醇提取物，同时留下不滴加芡实叶子乙醇提取物作为对照组。

然后将以上各培养盘置入37℃培养箱中培养3天。

观察结果：用十字交叉法测量抑菌圈直径，每个抑菌圈测量3次，取其平均值作为最后的抑菌圈直径。

2实验结果

在滴加不同芡实叶子乙醇提取物浓度的培养盘上的小洞发生透明抑菌圈直径扩大现象，如图2所示。

而不滴加芡实叶子乙醇提取物的培养盘上的小洞没有发生变化。

可见芡实叶子乙醇提取物对幼虫芽孢杆菌均表现出一定的抑菌活性，即便在较低浓度下也表现出一定的抑菌效果。

下表为不同芡实叶子乙醇提取物浓度对应的抑菌效果对比表。

由上表可见，芡实叶子乙醇提取物浓度越高抑菌效果越好。

结论：芡实叶子乙醇提取物可用于防治AFB。