阅读说明：本技术 一种黄白侧耳多糖及其制备方法和应用 (Pleurotus citrinopileatus polysaccharide and preparation method and application thereof ) 是由 丁祥 侯怡铃 唐贤 朱淼 宋志强 陈茜 杨彤 朱洪庆 于 2020-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明具体公开了一种黄白侧耳多糖(PC-1)及其制备方法和应用。将黄白侧耳子实体经热水浸提、乙醇醇沉、除蛋白、离子交换柱层析和透析,最后浓缩得到纯化的黄白侧耳多糖(PC-1)。本发明还公开了黄白侧耳多糖(PC-1)的组成：α-D-木糖、α-D-半乳糖、α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖；其中α-D-木糖、α-D-半乳糖与葡萄糖(包括α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖)的残基的摩尔比为2:2:8,α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖的残基的摩尔比为7:1。本发明制备的黄白侧耳多糖(PC-1)具有显著的免疫调节活性,可应用在药品、保健品或食品中。该应用为黄白侧耳的开发提供了一种新的途径。(The invention particularly discloses pleurotus citrinopileatus polysaccharide (PC-1) and a preparation method and application thereof. The pleurotus citrinopileatus polysaccharide (PC-1) is obtained by extracting pleurotus citrinopileatus sporocarp with hot water, precipitating with ethanol, removing protein, performing ion exchange column chromatography and dialysis, and finally concentrating. The invention also discloses the composition of pleurotus citrinopileatus polysaccharide (PC-1): alpha-D-xylose, alpha-D-galactose, alpha-D-glucose and beta-D-glucose; wherein the molar ratio of the residues of alpha-D-xylose, alpha-D-galactose and glucose (including alpha-D-glucose and beta-D-glucose) is 2:2:8, and the molar ratio of the residues of alpha-D-glucose and beta-D-glucose is 7: 1. The pleurotus citrinopileatus polysaccharide (PC-1) prepared by the invention has obvious immunoregulation activity and can be applied to medicines, health-care products or foods. The application provides a new way for the development of Pleurotus cornucopiae.)

一种黄白侧耳多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于真菌多糖应用技术领域，本发明涉及一种黄白侧耳多糖(PC-1)及其制备方 法和应用。

背景技术

食用菌俗称蘑菇，是一种大型真菌，其子实体中富含蛋白质、维生素、矿质元素、氨基 酸以及多糖等营养物质。

食用菌多糖具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、促进免疫细胞的增殖分化和淋巴因 子的分泌、激活补体等免疫调节等生物活性等特点，安全无毒，使其在保健食品和生物医药 等领域受到广泛的关注。而且食用菌多糖是一种非特异性免疫增强剂，它可通过多种途径提 高机体免疫功能，而对机体没有副作用。

黄白侧耳(Pleurotus cornucopiae)又名秀珍菇、袖珍菇、小平菇、姬菇等，隶属担子菌亚 门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，其味道鲜美，营养丰富，含有人体八种必需氨基酸， 有抗癌、抗氧化、提高免疫力、降血压、胆固醇的功能，是一种在中国、韩国和日本商业化 种植的低热量低脂肪食用菌。黄白侧耳在1978年从香港引进，相继在我国广州、福建、山西、 吉林等多地进行栽培试验并且得到广泛的推广。

黄白侧耳的菌丝体呈白色，有锁状联合，菌落外观薄、细，平坦、舒展。子实体单生或 丛生，中等至大型，菌盖的直径可以达到3cm～12cm，表面呈浅棕褐色，成熟后菌盖边缘常 呈波状；菌褶和菌肉呈白色，菌褶延生，不等长；菌柄侧生，白色，基部稍细，粗0.6cm～1.5cm， 长2cm～6cm。成熟的黄白侧耳子实体，菌盖完全伸展，外观与一般平菇没有明显的差异，但 在品质和口感上，黄白侧耳子实体菌柄纤维化程度低，口感上较其它侧耳品种细腻且柔爽， 比较绵脆，菇味清香浓郁。并且从生菇菇柄处极易剥离，人们非常喜欢。黄白侧耳的栽培工 艺简单，出菇整齐，栽培周期短，抗逆性强，产量高，市场好，这些特点非常适合工厂化栽 培。

刘东等在《黄白侧耳(Pleurotus cornucopiae(paul.ex.per)Roll)子实体多糖的研究》(甘肃科 学学报，1993，5(3):6-13.)报道了黄白侧耳子实体经热水提取，乙醇沉淀得到多糖粗制品P_Ⅲ； 再经去蛋白，透析，DEAF-SephadexA-25纯化得P_FⅢ-1、P_FⅢ-2、P_FⅢ-3三个多糖组分。其含量 比约为146:2:1。P_FⅢ-1用SephadexG-200凝胶层析及醋酸纤维素薄膜电泳证明为均一体。 平均分子量比旋度[a]²⁰ _D＝+168°(C＝0.0l,H₂O)经P.L.C和G.L.C分析表 明，P_FⅢ-1是一种含果糖的杂多糖。由葡萄糖、果糖、甘露糖组成，其摩尔比为l:0.76.:0.286。 元素分析表明P_FⅢ-1不含N,C:39.97％,H:6.13％，在3300-3490cm^-1，1645cm^-1.1195cm^-1处 有红外吸收。动物药理实验表明：P_Ⅲ、P_FⅢ-1具有增强机体免疫功能，对Lewis肺癌，C₂₇结 肠癌，Hep肝癌等多种种瘤均有抑制作用。

Zhang等在Fractionation,partial characterization arid bioactivity ofwater-soluble polysaccharides and polysaccharide-protein complexes fromPleurotus geesteranus.([J].International Journal of BiologicalMacromolecules,2011,48:5-12.)报道了在黄白侧耳子实体中分离到了具有 高抗肿瘤活性的多糖。

可见，现有技术中缺少对黄白侧耳多糖的精细结构、黄白侧耳多糖在免疫调节活性中应 用的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷，提供一种黄白侧耳多糖(PC-1)及其制备 方法和应用。

其具体技术方案为：

本发明提供一种黄白侧耳多糖(PC-1)，其为α-D-木糖、α-D-半乳糖、α-D-葡萄糖和β- D-葡萄糖组成的杂多糖，其中所述木糖、半乳糖与葡萄糖(包括α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖) 的残基的摩尔比为2:2:8，所述α-D-葡萄糖与β-D-葡萄糖的残基的摩尔比为7:1。

进一步地，上述多糖的重均分子量为8000-20000Da；在本发明的一个实施例中，该多糖 的重均分子量为14992Da。

进一步地，上述多糖的化学结构中包含1,6-连接的α-D-葡萄糖残基、1,4,6-连接的α-D-葡 萄糖残基、1,2,6-连接的α-D-半乳糖残基、1-连接的α-D-木糖残基和4-连接的β-D-葡萄糖残 基。

再进一步地，上述多糖的化学结构中包含由1,6-连接的α-D-葡萄糖构成的主链，由1,4,6- 连接的α-D-葡萄糖残基、1,2,6-连接的α-D-半乳糖残基、1-连接的α-D-木糖残基和4-连接的 β-D-葡萄糖残基构成的侧链。

进一步地，上述多糖包含如下结构式：

其中，n为3-10的整数(如3、4、5、6、7、8、9、10)。

本发明还提供一种上述多糖的制备方法，其包括对黄白侧耳子实体进行提取的步骤。

进一步地，上述制备方法包括通过水提醇沉法提取得到粗多糖的步骤。

进一步地，上述制备方法还包括(例如通过离子交换柱层析)对粗多糖进行纯化的步 骤。

在本发明的一个实施方式中，上述制备方法包括如下步骤：

(1)取黄白侧耳子实体粉末，用热水浸提，将所得水提物依次经浓缩、醇沉、烘干得到粗多糖；

(2)将步骤(1)所得粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液；

(3)将步骤(2)所得洗脱液用透析袋进行透析浓缩。

优选地，(4)将步骤(3)完成后的透析袋内液体冷冻干燥。

进一步地，步骤(1)中，浸提温度可以为80-100℃(如80、85、90、95、100℃)； 在本发明的一个实施例中，该浸提温度为98℃。

进一步地，步骤(1)中，黄白侧耳子实体粉末与水的料液比(W/V，mg/mL)为1:1- 10(如1:1、1:2、1:3、1:5、1:8、1:10)；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:3。

进一步地，步骤(1)中，浸提次数为1次或多次(如2、3、4、5次)；在本发明的一 个实施例中，该浸提次数为3次。

进一步地，步骤(1)中，每次浸提时间为1-10小时(如1、3、6、8、10小时)；在 本发明的一个实施例中，每次浸提时间为6小时。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)中的浸提步骤可以包括：取黄白侧耳子实体粉末，与水混合，并置于水浴中煮沸。

进一步地，步骤(1)中，醇沉步骤中，醇与水提物的浓缩液的体积比为1-10:1(如1:1、3:1、4:1、5:1、10:1)；在本发明的一个实施例中，该体积比为3:1；

在本发明的一个实施例中，上述醇沉步骤中，醇为乙醇。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：取黄白侧耳子实体粉末，热水浸提，收集上清液，浓缩，加入无水乙醇，收集沉淀，烘干，除去其中蛋白质，得到粗多糖。

进一步地，步骤(2)中，离子交换柱可以为纤维素柱，该纤维素柱的填料如DEAE-纤维素。

进一步地，步骤(2)中，洗脱所用洗脱剂可以为NaCl溶液；具体地，该NaCl溶液浓度为0.01-1.0mol/L(如0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0)mol/L。

进一步地，步骤(2)中，洗脱可以为梯度洗脱，洗脱剂浓度可以为0.01-1.0mol/L(如 0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0)mol/L。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得粗多糖的水溶液通过纤 维素柱，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩。

进一步地，步骤(3)中，透析袋的截留分子量为5000-10000Da(如5000、6000、7000、8000、9000、10000Da)；在本发明的一个实施例中，该截留分子量为7000Da。

在本发明的一个实施例中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得洗脱液置于透析袋中进行 透析，持续3天，透析两天。

本发明还提供一种上述方法制备得到的粗多糖。

本发明还提供一种上述多糖在制备增强免疫的保健品和食品中的应用。

上述应用中，上述多糖可单独使用，可也与其他活性成分联合使用。

本发明的发明人自黄白侧耳分离纯化得到多糖PC-1，并对其分子量、单糖组成、化学 结构等进行了分析鉴定，确定了其重均分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著 的免疫调节活性，特别在15μg/mL浓度时，T细胞的增殖率最高；特别在10μg/mL浓度时，B细胞和RAW264.7细胞促增殖率最高；

该多糖同时还能促进B细胞分泌免疫球蛋白。基于此，该多糖可用于制备增强免疫的 保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提黄白侧耳的利用价值。

附图说明

图1所示为PC-1的HPGPC谱图；

图2所示为PC-1的红外谱图；

图3所示为PC-1的HLPC谱图；

图4所示为PC-1的¹H NMR谱图；

图5所示为PC-1的¹³C NMR谱图；

图6所示为PC-1的¹H-¹H-COSY谱图；

图7所示为PC-1的HMQC谱图；

图8所示为PC-1的HMQC谱图；

图9所示为PC-1的化学结构；

图10所示为PC-1对B细胞增殖的影响的实验结果；

图11所示为PC-1对T细胞增殖的影响的实验结果；

图12所示为PC-1对RAW264.7细胞增殖的影响的实验结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技 术人员通常理解的相同的含义。

在本发明中，“黄白侧耳(Pleurotus cornucopiae)”是指担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、 侧耳科、侧耳属真菌，其包含子实体和菌丝体。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域 普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的 范围。

实施例1黄白侧耳多糖PC-1的分离提取

1、黄白侧耳多糖PC-1的分离提取

1.1、水提醇沉法提取黄白侧耳粗多糖

称取干燥的黄白侧耳子实体200g粉碎，于烧杯中以料液1:3的比例加入粉碎后的黄白侧 耳子实体与蒸馏水，在98℃水浴6小时，收集上清液浓缩，重复3次，最终将全部的上清液 浓缩至200mL。加入三倍体积的无水乙醇，使其沉淀，收集沉淀并干燥，除去提取液中的蛋 白质，从而获得黄白侧耳粗多糖。

1.2、DEAE-纤维素柱层析法分离纯化绒白乳菇粗多糖

精确称取50g DEAE纤维素，并将其溶解在1L的超纯水中，充分搅拌，若无肉眼可见的 纤维素颗粒则停止搅拌。静置24h，弃去上清液，待用。配置0.5mol/L NaOH，浸泡纤维素6h，用超纯水洗涤至中性后，弃去上清，再加入0.5mol/L HCl浸泡6h，蒸馏水洗涤至中性，弃去上清；再加入0.5mol/L NaOH再次浸泡6h，用蒸馏水洗涤至中性，静置待用。

将活化的纤维素装柱后，经蒸馏水压柱平衡24h后即可进行粗多糖的分离纯化。将粗多 糖稀释后的上清液(5mL)加入DEAE纤维素柱中，加入不同浓度的NaCl(0.01mol/L，0.05mol/L， 0.1mol/L)进行洗脱。多糖用硫酸-苯酚法测定。将洗脱液浓缩至5mL，将样品在纤维素柱上 纯化。用透析袋(Mw≥7kDa)透析，持续48h，冷冻干燥，得到黄白侧耳多糖，命名为PC-1。

2、黄白侧耳多糖PC-1的结构鉴定

运用酸水解、甲基化分析、高效凝胶渗透色谱法、高效液相色谱、气相色谱和质谱联用 技术、红外谱技术、核磁共振技术，对黄白侧耳多糖(PC-1)进行结构解析。

2.1、分子量的测定

将10mg黄白侧多糖PC-1样品用1mL ddH₂O溶解，超声5min，进行HPGPC分析。

2.2、黄白侧耳多糖PC-1的红外谱分析

将2mg PC-1与KBr混合压片，通过红外分光光度计扫描4000cm^-1-400cm^-1范围。

2.3、黄白侧耳多糖PC-1的单糖组成分析

将六种标准品和经TFA酸水解后的PC-1样品用流动相(75％乙腈)溶解后进行HLPC分 析。

2.4、黄白侧耳多糖PC-1的核磁共振分析

取50mg BA-T样品溶于0.6mL重水(D₂O)中，装入核磁管中，在核磁共振仪上检测。

2.5、黄白侧耳多糖PC-1的甲基化与硅烷化衍生后进行GC-MS分析

称取20mg PC-1样品，将烧杯密封，向密封的烧杯中加入2mL DMSO(二甲基亚砜)，轻轻振荡烧杯，使PC-1充分溶解。然后加入200mg的NaOH，直至NaOH刚好不溶解为止 并将其放置在摇床中室温振荡1h。振荡完成后，加入1.5mL碘甲烷，避光反应1h，反应后加 水终止反应。用氯仿萃取产物，干燥后得甲基化多糖。甲基化多糖经TFA完全酸水解后，水 洗三次，得甲基化完全酸水解产物。

将上述样品与2mL六甲基二硅烷胺、1mL三甲基氯硅烷以及2mL的无水吡啶充分反应， 并在50℃条件下水浴20min，采用低温高速离心机在转速12000rpm/min，4℃条件下离心10min， 弃去沉淀，用0.22μm过滤器过滤，取上层溶液用于GC-MS分析。

3、结果

3.1、黄白侧耳多糖PC-1的基本性质结果

PC--1的HPGPC谱图如图1所示，其显示PC-1的重均分子量为14992Da。

3.2、黄白侧耳多糖PC-1的FTIR谱分析

采用傅里叶红外光谱对PC-1进行初级结构表征，结果如图2所示，波数在3432cm^-1，2924cm^-1以及1400～1200cm^-1等处内有典型的多糖吸收峰，且无其他杂峰，说明分离纯化的PC-1为一种多糖物质。波数在3432cm^-1的宽吸收峰O-H的伸缩振动峰，2924cm^-1范围内的 吸收峰为-CH₂的伸缩振动峰，1 637cm^-1为C＝O伸缩振动峰，1402cm^-1为-CHO的C-H面 内弯曲振动峰，1086cm^-1的峰为糖类C-O伸缩振动峰。在1200-1000cm^-1范围内的吸收峰是 吡喃糖环内酯和羟基的吸收产生的吸收峰，表明PC-1有吡喃环。在877cm^-1有吸收峰说明 PC-1含有β-吡喃糖，在797cm^-1为α-吡喃己糖环对称振动峰，在557cm^-1有吸收峰出现表明 PC-1含有α-构型。此外，在1730cm^-1附近无吸收峰，说明PC-1不含糖醛酸。

3.3、黄白侧耳多糖PC-1的单糖组成分析

将PC-1完全水解后，采用HPLC对其进行单糖组成分析，结果如图3所示，其中峰1为木糖(Xyl)，保留时间为5.313min；峰2为葡萄糖(Glc),保留时间为6.953min；峰3为半 乳糖(Gal)，保留时间7.504min。且木糖、葡萄糖和半乳糖的比例为2：8：2。

3.4、黄白侧耳多糖PC-1的NMR谱分析

PC-1的¹H NMR结果如图4所示。结果显示，PC-1有五个异头氢信号，分别为：δ5.19ppm、δ4.95ppm、δ4.81ppm、δ4.62ppm和δ4.33ppm，且积分面积比为0.8：1.83：1.29： 1.03：0.53。δ3.0～4.2ppm之间的信号归属为糖残基中C2-C6的氢信号。

PC-1的¹³C NMR结果如图5所示，PC-1在δ102.65ppm、δ101.62ppm、δ98.22ppm、 δ98.59ppm和δ98.06ppm处有五个异头碳信号。δ60～78ppm之间的信号归属为糖残基中 C2-C6的碳信号。

PC-1的¹H-¹H-COSY谱图如图6所示，据其可以鉴定相邻氢核间的耦合关系。A部分H1/H2的信号为δ5.19/3.54，B部分H1/H2的信号为δ4.95/3.83，C部分H1/H2的信号为δ4.81/3.73，D部分H1/H2的信号为δ4.62/4.01，E部分H1/H2的信号为δ4.33/3.20。

所有的氢的化学位移都总结于表1中。

PC-1的HMQC光谱图如图7所示，据其可以鉴定近程相关的¹H和¹³C间的耦合关系。 A部分H1/C1的信号为δ5.19/99.28，B部分H1/C1的信号为δ4.95/98.59，C部分H1/C1的 信号为δ4.81/98.06，D部分H1/C1的信号为δ4.62/101.62，E部分H1/C1的信号为δ4.33/102.65。

PC-1的HMBC光谱图如图8所示，据其可以鉴定远程相关的¹H和¹³C间的耦合关系。 A残基的H5/C3的信号为δ3.38/72.84，B残基的H5/C3的信号为δ3.91/60.97，C残基的 H3/C5的信号为δ3.91/72.84，D残基的H1/C3的信号为δ4.62/70.34，H1/C5的信号为δ 4.62/76.88，E残基的H6/C4的信号为δ3.91/66.71。

所有的碳的化学位移都总结于表2中。

表1 PC-1的¹H的化学位移

表2 PC-1中¹³C的化学位移

3.5、黄白侧耳多糖PC-1的气相色谱与质谱分析

甲基化结果如表3所示，表明PC-1的主要重复结构单元由1,6-连接的α-D-葡萄糖构成 主链，1,2,6-连接的α-D-半乳糖残基1,4,-连接的α-D-木糖和4-连接的β-D-葡萄糖残基构成支 链。综上可初步推断BA-T的结构如图9所示。

表3 PC-1甲基化结果分析

实施例2：黄白侧耳多糖PC-1的免疫调节活性研究

在体外运用两种CCK-8法测定黄白侧耳多糖PC-1的免疫调节活性。

1、试剂

CCK-8试剂盒、RPIM1640、FBS、DMSO、双抗等，均为市售产品。

2、仪器

酶标仪；细胞培养箱。

3、方法

PC-1对免疫细胞(B细胞、T细胞和RAW264.7细胞)的增殖影响

通过细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定黄白侧耳多糖(PC-1)对T细胞、B细胞和RAW264.7 细胞增殖的影响。体外培养T细胞、B细胞和RAW264.7细胞至对数生长期，细胞计数板计 数后，用新的培养液将细胞悬液稀释至1×10⁵个/mL，将细胞悬液加入96孔板，每孔100μL， 将96孔板放入CO₂培养箱中培养24h。24h后，实验组分别加入不同质量浓度的BA-T溶液 (最终质量浓度为2.5、5、10μg/mL)，阳性对照加入100μL LPS溶液(最终质量浓度5μg/mL)， 空白组加入100μL细胞培养液。在CO₂培养箱中培养24h后，分别向每孔加入5μl的CCK-8，放入CO₂培养箱中孵育3h后在酶标仪上检测(450nm)吸光度值并拍摄图像。

4、结果

4.1 PC-1对B细胞的增殖影响

结果如图10所示，与空白组相比，LPS组能极显著(P<0.01)促进B细胞增殖，增殖率为22.47％；当PC-1的质量浓度为5、10和15μg/mL时，能极显著(P<0.01)促进B细胞的 增殖；且PC-1质量浓度为10μg/mL时，PC-1对B细胞的增殖效果最为明显，最大增殖率达 到34.58％。

4.2 PC-1对T细胞的增殖影响

结果如图11所示，与空白组相比，LPS组能显著(P<0.05)促进T细胞增殖，增殖率为26.70％；当PC-1的质量浓度为5、10和15μg/mL时，能极显著(P<0.01)促进T细胞的增 殖；当PC-1质量浓度为15μg/mL时，PC-1对T细胞的增殖效果最为明显，最大增殖率达到 57.62％。

4.3 PC-1对RAW264.7细胞的增殖影响

结果如图12所示，与空白组相比，LPS组能显著(P<0.05)促进RAW264.7细胞增殖，增殖率为18.54％；当PC-1的质量浓度为5、10和15μg/mL时，均能极显著(P<0.01)促进RAW264.7细胞的增殖；当PC-1质量浓度为10μg/mL时，PC-1对RAW264.7细胞的增殖效 果最为明显，最大增殖率达到76.91％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所 不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。