阅读说明：本技术 重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用 (Recombinant human-derived collagen membrane and preparation method and application thereof ) 是由 樊璐露 钱松 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物制药技术领域,具体涉及一种重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用。本重组人源胶原蛋白膜包括：制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品；荧光照射重组人源胶原蛋白样品,以诱发交联反应,形成重组人源胶原蛋白膜。重组人源胶原蛋白中引入甲基丙烯酰基,经荧光照射诱发交联反应,形成重组人源胶原蛋白膜,具有制备工艺简单、厚度可控、性质稳定等优点,可用于创面的修复,具有良好的应用前景。(The invention belongs to the technical field of biological pharmacy, and particularly relates to a recombinant human collagen membrane and a preparation method and application thereof. The recombinant human collagen film comprises: preparing a methacryl modified recombinant human collagen sample; and (3) performing fluorescence irradiation on the recombinant human collagen sample to induce a crosslinking reaction to form a recombinant human collagen film. The recombinant human collagen membrane is formed by introducing methacryloyl into the recombinant human collagen and inducing a cross-linking reaction through fluorescent irradiation, has the advantages of simple preparation process, controllable thickness, stable property and the like, can be used for repairing wound surfaces, and has good application prospect.)

重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用。

背景技术

创面是正常组织(皮肤或粘膜)在外界致伤因子如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下导致的损害，常伴有组织完整性的破坏和一定量正常组织的丢失，同时组织正常生理功能也有一定程度的受损，而创面的修复不仅包括对受损组织完整性的修复，还包括对组织生理功能的修复。

胶原蛋白是细胞外基质的主要组成成分，是动物体内含量最多、分布最广的蛋白质。它具有独特的组织结构和生物功能，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能和损伤修复有重要作用，同时胶原蛋白还具有低免疫原性、可生物降解、良好的生物相容性和机械性能等特点，是良好的创面修复材料。

重组人源胶原蛋白是将人胶原蛋白的一段基因序列进行修改或重新合成，再通过宿主蛋白表达系统将新的基因序列进行表达的一种重组蛋白。重组人源胶原蛋白具有胶原蛋白的抗原性、可生物降解性、良好的生物相容性等优点，且没有动物源胶原蛋白存在的病毒隐患，免疫排斥等缺点，故而被广泛应用于生物材料领域。

发明内容

本发明提供了一种重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组人源胶原蛋白膜的制备方法，包括：制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品；荧光照射重组人源胶原蛋白样品，以诱发交联反应，形成重组人源胶原蛋白膜。

第二方面，本发明还提供了一种如前所述的制备方法制备的重组人源胶原蛋白膜。

第三方面，本发明还提供了一种如前所述的重组人源胶原蛋白膜在创面修复中的应用。

本发明的有益效果是，本发明的重组人源胶原蛋白膜及其制备方法、应用，在重组人源胶原蛋白中引入甲基丙烯酰基，经荧光照射诱发交联反应，形成重组人源胶原蛋白膜，具有制备工艺简单、厚度可控、性质稳定等优点，可用于创面的修复，具有良好的应用前景。

本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的重组人源胶原蛋白膜的制备工艺流程图；

图2是本发明的甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白实物图；

图3是本发明的甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白光谱检测图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

第一部分：阐述具体技术方案

申请号201911000883.5的专利中公开了一种光交联重组胶原蛋白水凝胶、制备方法及其在3D生物打印中的应用，提及将甲基丙基酸酐改性重组胶原蛋白溶解于培养基中，加入光引发剂水溶液，混合均匀得到水凝胶前驱液，光反应交联固化得到重组胶原蛋白水凝胶。较高含量的光引发剂会在交联固化后存留在重组胶原蛋白水凝胶中，严重影响了甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白的占比量，降低重组人源胶原蛋白膜的纯度，导致创面修复效果较差，由于光引发剂具有一定毒性，大量使用也会影响伤口愈合，导致重组人源胶原蛋白膜很难用于临床研究。因此，见图1，本发明提供了一种重组人源胶原蛋白膜的制备方法，包括：制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品；荧光照射重组人源胶原蛋白样品，以诱发交联反应，形成重组人源胶原蛋白膜。

可选的，重组人源胶原蛋白样品的质量占比重组人源胶原蛋白膜总质量为20-70％，可选为30％、45％、60％。

可选的，可以通过蓝光进行照射，以及蓝光的垂直照射距离为1-5cm，蓝光照射的时间为1-30min。

本发明的重组人源胶原蛋白膜的制备方法通过荧光照射重组人源胶原蛋白样品，以诱发交联反应，形成重组人源胶原蛋白膜，可以大幅提高重组人源胶原蛋白样品的质量占比，提高重组人源胶原蛋白膜的有效成分。

作为甲基丙烯酰基修饰重组人源胶原蛋白样品的一种可选的实施方式。

所述制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品包括：将重组人源胶原蛋白和甲基丙烯酰氯在一定温度下加入碱性水溶液中进行修饰反应；将修饰反应产物透析；离心；干燥，得到甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品(如图2所示的实物照片)。

可选的，所述重组人源胶原蛋白例如但不限于通过基因重组技术经生物发酵方法制得的类人胶原蛋白。重组人源胶原蛋白的浓度为0.025-0.2g/mL，可选为0.05g/mL、0.08g/mL；重组人源胶原蛋白与甲基丙烯酰氯的质量比为(2-10)：1，可选为5：1或8：1。

可选的，碱性水溶液的pH值为-7.5-10，碱性水溶液的碱溶质为Na₂CO₃，NaHCO₃，K₂CO₃，NaOH，KOH，KH₂PO₄，NaH₂PO₄，Na₂HPO₄等无机碱中的一种或几种；修饰反应的反应温度为25-70℃，反应时间为12-72h。

可以但不限于采用透析袋进行透析，例如纤维质膜透析袋，以及透析袋的残留分子量为8000-14000Da，透析时间为1-7天；离心机转速为5000-10000rpm，离心时间为5-30min；干燥方式自然风干或冻干，冻干条件为：-20℃预冻24-48h，以及-80℃冷冻干燥24-72h。

修饰反应的反应式为：

本案中采用甲基丙烯酰氯修饰重组人源胶原蛋白，甲基丙烯酰氯反应活性高，更有利于修饰反应高效进行，反应副产物M⁺Cl^-为NaCl或KCl，另一副产物为水，毒性小，反应更绿色。反应后通过透析、离心、冻干，得到甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品，利用甲基丙烯酰基的高活泼性，在蓝光照射下，可以减小光引发剂的用量，有助于甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品诱发交联反应。

作为交联反应的一种可选的实施方式。

交联反应中用的光引发剂包括樟脑醌和二苯基碘鎓六氟磷酸盐的混合体系；所述光引发剂的质量占比重组人源胶原蛋白膜总质量为0.05-1％，可选为0.1％、0.5％、0.8％。本光引发剂相较于常规光引发剂，主要是可以在蓝光下诱发交联反应，比紫外光更安全、更高效，是一种新型可见光聚合技术，可以有效地避免高能量紫外光易使生物活性物质(例如蛋白质等)失活、固化深度浅、辐射和臭氧污染等问题。

本实施方式的交联反应采用樟脑醌和二苯基碘鎓六氟磷酸盐的混合体系，采用蓝光照射诱发，可以减少光引发剂用量，以降低引发剂引入毒性，在原料上控制重组人源胶原蛋白膜中的组分，从而保持甲基丙烯酰基修饰重组人源胶原蛋白样品具有较高的质量占比，提高创面修复效果。由于单独的樟脑醌做引发剂，交联效率低，用量大，而助引发剂二苯基碘鎓六氟磷酸盐的加入，能显著增加交联效率，降低光引发剂的用量。

进一步，本发明提供了一种如前所述的制备方法制备的重组人源胶原蛋白膜。

采用樟脑醌和二苯基碘鎓六氟磷酸盐的混合体系作为光引发剂，既可以减小用量，又可以使重组人源胶原蛋白膜呈现出一定的色泽，一般为淡黄色的薄膜状，比较接近皮肤色泽，有助于创面的贴敷和修复。

进一步，本发明提供了一种如前所述的重组人源胶原蛋白膜在创面修复中的应用。

第二部分：列举部分实施例

实施例1

(1)制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品

将重组人源胶原蛋白1g溶于10mL碱性水溶液(pH＝8)中，之后滴加0.2mL甲基丙烯酰氯纯溶液，并控制滴加时间为10min。将反应液在25℃下反应3h，之后加入20mL碱性水溶液(pH＝8)终止反应。将上述稀释后的反应液置于10KDa透析袋中用去离子水透析72h，每隔24h换水一次。透析完成后，将溶液装入离心管中，在10000rpm下离心5min，取上层清液进行冻干操作，冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h，之后得甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白白色固体，即甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品。

(2)蓝光照射诱发交联反应

将1g(1)制备的重组人源胶原蛋白白色固体溶于5mL浓度为0.001g/mL的樟脑醌和0.001g/mL的二苯基碘鎓六氟磷酸盐的混合溶液中，取0.5mL溶液于洁净载玻片上，用蓝光照射5min，保持照射距离为2cm。之后自然风干后得重组人源胶原蛋白膜。

实施例2

(1)制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品

将重组人源胶原蛋白1g溶于10mL碱性水溶液(pH＝8)中，之后滴加0.5mL甲基丙烯酰氯纯溶液，并控制滴加时间为10min。将反应液在25℃下反应5h，之后加入20mL碱性水溶液(pH＝8)终止反应。将上述稀释后的反应液置于10KDa透析袋中用去离子水透析72h，每隔24h换水一次。透析完成后，将溶液装入离心管中，在10000rpm下离心5min，取上层清液进行冻干操作，冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h，之后得甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白白色固体。

(2)蓝光照射诱发交联反应

将1g(1)制备的重组人源胶原蛋白白色固体溶于5mL浓度为0.0002g/mL的樟脑醌和0.0002g/ml的二苯基碘鎓六氟磷酸盐混合溶液中，取0.5mL溶液于洁净载玻片上，，用蓝光照射5min，保持照射距离为2cm。之后自然风干后得重组人源胶原蛋白膜。

实施例3

(1)制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品

将重组人源胶原蛋白1g溶于10mL碱性水溶液(pH＝8)中，之后滴加0.1mL甲基丙烯酰氯纯溶液，并控制滴加时间为10min。将反应液在25℃下反应5h，之后加入20mL碱性水溶液(pH＝8)终止反应。将上述稀释后的反应液置于10KDa透析袋中用去离子水透析72h，每隔24h换水一次。透析完成后，将溶液装入离心管中，在10000rpm下离心5min，取上层清液进行冻干操作，冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h，之后得甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白白色固体。

(2)蓝光照射诱发交联反应

将1g(1)制备的重组人源胶原蛋白白色固体溶于5mL浓度为0.002g/mL的樟脑醌和0.002g/mL的二苯基碘鎓六氟磷酸盐溶液中，取0.5mL溶液于洁净载玻片上，用蓝光灯照射2min，保持照射距离为2cm。之后自然风干后得重组人源胶原蛋白膜。

实施例4

(1)制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品

将重组人源胶原蛋白1g溶于10mL碱性水溶液(pH＝8)中，之后滴加0.25mL甲基丙烯酰氯纯溶液，并控制滴加时间为10min。将反应液在25℃下反应5h，之后加入20mL碱性水溶液(pH＝8)终止反应。将上述稀释后的反应液置于10KDa透析袋中用去离子水透析72h，每隔24h换水一次。透析完成后，将溶液装入离心管中，在10000rpm下离心5min，取上层清液进行冻干操作，冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h，之后得甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白白色固体。

(2)蓝光照射诱发交联反应

将1g(1)制备的重组人源胶原蛋白白色固体溶于5mL浓度为0.001g/mL的樟脑醌和0.001g/mL的二苯基碘鎓六氟磷酸盐混合溶液中，取0.5mL溶液于洁净载玻片上，用蓝光灯照射2min，保持照射距离为2cm。自然风干后得重组人源胶原蛋白膜。

实施例5

(1)制备甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品

将重组人源胶原蛋白0.8g溶于10mL碱性水溶液(pH＝8)中，之后滴加0.1mL甲基丙烯酰氯纯溶液，并控制滴加时间为10min。将反应液在50℃下反应5h，之后加入20mL碱性水溶液(pH＝8)终止反应。将上述稀释后的反应液置于10KDa透析袋中用去离子水透析72h，每隔24h换水一次。透析完成后，将溶液装入离心管中，在10000rpm下离心5min，取上层清液进行冻干操作，冻干条件为：-20℃预冻24h，-80℃冷冻干燥72h，之后得甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白白色固体。

(2)蓝光照射诱发交联反应

将1g(1)制备的重组人源胶原蛋白白色固体溶于5mL浓度为0.0016g/mL的樟脑醌和0.0016g/mL的二苯基碘鎓六氟磷酸盐混合溶液中，取0.5mL溶液于洁净载玻片上，用蓝灯照射2min，保持照射距离为2cm。之后自然风干后得重组人源胶原蛋白膜。

第三部分：性能参数对比分析

本部分对实施例1-5制备的甲基丙烯酰基修饰的重组人源胶原蛋白样品进行核磁共振波谱检测，如图3所示，从上到下依次是实施例1、2、3、4、5制备的重组人源胶原蛋白核磁共振波谱曲线，其特征峰如图2中特征峰所指方框中圈定的图示，通过特征峰可以确定本案中的重组人源胶原蛋白样品通过高活泼性的甲基丙烯酰氯对常规重组人源胶原蛋白修饰成功。

综上所述，本发明的重组人源胶原蛋白膜及其制备方法利用甲基丙烯酰氯修饰重组人源胶原蛋白，并配合蓝光照射的方法实现了重组人源胶原蛋白样品的交联反应，生成重组人源胶原蛋白膜，可以减小光引发剂的用量，保证重组人源胶原蛋白膜的质量，其膜厚度可控、制备过程简单、适于工业化生产，尤其在用于创面修复领域，在临床中具有广泛的应用前景。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。