阅读说明：本技术 一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途 (HRas protein targeted alpha-helix polypeptide inhibitor and application thereof ) 是由 李子刚 尹丰 覃伟容 廉晨珊 于 2020-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂,其结构式如下所示：<Image he="188" wi="700" file="DDA0002575402630000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明还提供了上述多肽抑制剂在制备用于靶向HRas蛋白的药物中的用途。本发明的靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂可应用于放疗辐射增敏剂。(The invention relates to an α spiral polypeptide inhibitor targeting HRas protein, which has the structural formula shown as follows: the invention also provides application of the polypeptide inhibitor in preparation of a medicament for targeting HRas protein, and the α helix polypeptide inhibitor for targeting HRas protein can be applied to radiation sensitizer for radiotherapy.)

一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途

技术领域

本发明属于生物工程域，涉及一种多肽，具体来说是一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途。

背景技术

癌症治疗领域有三大主要治疗方式：放射治疗、化疗和手术，放射治疗是治疗癌症的重要的非手术治疗方法之一。放射治疗被称为“隐形的手术刀”，可以保留器官及其功能，达到微创高效地***的目的，例如针对鼻咽癌的治疗，由于鼻咽解剖位置及其特殊、手术治疗非常困难，但鼻咽癌细胞对放射线较为敏感，因此放射治疗是治疗鼻咽癌的理想治疗方式，早期鼻咽癌患者采用放射治疗的策略可以达到很好的治愈率。迄今，放射治疗和化疗联合应用在全球范围内广泛应用于肿瘤治疗。然而，肿瘤细胞产生的辐射抗性可能使放射治疗的效果被削弱。放射治疗增敏剂被证明在一些癌症如***癌中有效，放疗增敏剂可以提高肿瘤细胞对X射线等的辐射敏感性，在高效杀伤肿瘤细胞的同时最大可能保护正常的细胞和组织，各种放射增敏剂例如小分子药物和RNA类药物被开发出来以增强抗肿瘤作用。最近，针对特定靶蛋白的放射治疗增敏剂引起了学术界和工业界的浓厚兴趣。各种研究表明Ras信号通路在调节辐射抗性中起重要作用。研究表明rigosertib是一种抑制Ras-Raf相互作用的调节剂，可中断Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K/AKT信号通路，rigosertib可能可以作为***放射治疗的放射增敏剂，并通过G2/M细胞周期阻滞等机制抑制癌细胞的增殖。2005年，Kim等人发现靶向Ras的siRNA可以下调AKT和ERK激酶(MAPK)水平的磷酸化水平，降低克隆形成实验的细胞存活率，显示出放疗增敏作用。因此，开发有效的抑制剂来阻断Ras信号传导途径可能是开发有效的放射治疗增敏剂的可行策略。

基于Ras-Sos界面的相互作用序列，Patgiri等开发了利用氢键替代策略(HBS)构建了靶向HRas的α螺旋多肽HBS 3，该多肽直接靶向HRas蛋白并成功下调了Ras信号下游的磷酸化级联反应。2015年，Leshchiner等开发了针对野生型和突变型KRas的全碳氢“订书肽”SAH-SOS1A，该多肽有效地下调Ras信号下游磷酸化级联反应中ERK和AKT蛋白的磷酸化水平，并抑制含有KRas突变型基因的癌细胞的生长。HBS 3多肽和SAH-SOS1A多肽都是基于Ras-Sos相互作用界面的关键多肽片段，即模拟Sos蛋白上的αH螺旋(氨基酸残基929-944)进行氨基酸突变和筛选合适关环位置而得到的靶向Ras蛋白的多肽抑制剂，此多肽设计策略对于靶向Ras蛋白的多肽抑制剂的开发提供了思路。2015年，Upadhyaya等开发了一种具有较好的细胞膜穿透性的环肽9A5，该环肽可以阻断Ras-效应因子相互作用，并在后续研究中发现可以诱导癌细胞凋亡。

有研究报道通过在2，3-二氨基丙酸(Dap)和多肽N末端的L-异天冬氨酸之间构建(i，i+3)内酰胺键来开发N-末端天冬氨酸成核策略(TD策略)，这种方法可以将多肽固定成α螺旋结构，用这种策略构建的多肽具有改善的多肽稳定性和细胞膜穿透性。目前开发的多肽抑制剂可能存在着细胞膜穿膜能力弱、与HRas的结合亲和力较低等不足，仍然需要开发更高效的Ras抑制剂或与Ras相关的放射治疗增敏剂。利用N-末端天冬氨酸成核策略构建稳定的α螺旋多肽，以靶向Ras蛋白是一种可行的方案。

甲基澳瑞他汀E简称MMAE，是合成抗肿瘤药。MMAE是一种潜在的有效的X射线辐射放疗增敏剂，可以提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，也是一种强大的多肽类细胞毒素和抑制有丝***的试剂，通过阻断微管蛋白的聚合来抑制细胞***，衍生自存在于海洋无壳软体动物Dolabella auricularia中的称为dolastatin的多肽。MMAE多肽及其抗体偶联物在临床前研究中显示出对多种淋巴瘤，白血病和实体瘤的有效体外和体内活性。MMAE可以作为研究肿瘤细胞对辐射敏感性相关实验的正对照，同时为了验证MMAE与靶向Ras蛋白的多肽联合治疗的潜在的应用前景，本发明进一步评估了抑制Ras信号通路的多肽和MMAE联合用药在X射线辐射放疗增敏方面的研究。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途，所述的这种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途要解决现有技术中的多肽抑制剂存在着细胞膜穿膜能力弱、与HRas的结合亲和力较低的技术问题。

本发明提供了一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂，其结构式如下所示(命名为H5多肽)：

其中isoD是L-异天冬氨酸(L-isoaspartic acid)、Dap代表2，3-二氨基丙酸。

进一步的，本发明还提供了上述的靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂在制备用于靶向HRas蛋白的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了上述的靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂在制备用于治疗HRas高表达***细胞系的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了上述的靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂在制备用于增加癌细胞放疗敏感性的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了一种药物组合物，含有上述靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂与单甲基澳瑞他汀E，在所述的组合物中，所述靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂的浓度10μM，所述的单甲基澳瑞他汀E的浓度为0.5nM。

进一步的，本发明还提供了上述的药物组合物在制备用于在制备用于靶向HRas蛋白的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了上述的药物组合物在制备用于治疗HRas高表达***细胞系的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了上述的药物组合物在制备用于增加癌细胞放疗敏感性的药物中的用途。

本发明基于Ras-Sos复合物晶体结构中相互作用口袋的Sos蛋白上的一段关键多肽序列，即Sos蛋白上的αH螺旋(氨基酸残基929-944)，该多肽序列作为线性对照多肽L1(氨基酸残基929-944：FFGIYLTNILKTEEGN)，再使用N-末端天冬氨酸成核策略制备了一系列关环多肽，用荧光偏振方法检测稳定多肽与Ras蛋白的结合亲和力和相互作用，再进一步在细胞水平评估多肽对癌细胞的杀伤作用及多肽在癌细胞放疗增敏作用方向的应用。

本发明进一步探讨多肽和MMAE联合用药在X射线辐射放疗增敏方面的应用效果。在本发明中，经过一系列的实验筛选确定较有潜力的多肽H5，其与HRas有较高的结合亲和力、较强地细胞膜穿膜能力、较好的细胞活性等优势，然后进一步评估该多肽与MMAE联合用药对HeLa细胞的杀伤效果，以及用克隆形成实验评估了该多肽与MMAE联合用药对诱导HeLa细胞在放疗增敏作用方面的应用。

本发明共设计并合成了H1-H12等系列多肽，具体多肽序列详见表1，多肽序列的表示方式为从N端到C端的氨基酸序列。多肽L1含有Sos1αH-螺旋的原始序列(氨基酸929-944：FFGIYLTNILKTEEGN)，带正电荷的精氨酸Arg被合成到所有多肽的末端，以期望通过增加多肽的正电荷来进一步增加多肽的细胞膜穿透性，从而增强多肽的生物学活性，另外在所有多肽的末端增加色氨酸Trp以便用于多肽的浓度测定。多肽H1/H2多肽基于多肽L1的序列，利用N末端成核模板在多肽的N末端引入Dap和isoD氨基酸，在Dap和isoD氨基酸间通过(i，i+3)酰胺键关环的方式构建稳定的关环多肽，并筛选合适的关环位置。多肽H3和H4基于Patgiri等先前报道的优化多肽序列(FEGIYRLELLKAEEAN)来进行设计，同样是在N末端不同的氨基酸位点进行酰胺键关环。

对于多肽H5、H6和H7，多肽序列上的941位的氨基酸残基谷氨酸Glu被替换为谷氨酰胺Gln以进一步增加多肽总的正电荷以改善细胞膜穿透性。其他多肽根据荧光偏振实验结果，有选择性地替换非必需疏水残基(H8-H12)或在943和944位点处重复重要的氨基酸天冬酰胺Asn以进一步改变或优化多肽序列(H10-H12)。

本发明采用固相合成多肽技术合成线性多肽序列，然后用末端天冬氨酸关环的方法来稳定靶向HRas的α螺旋多肽。

经过实验证明，本发明的多肽H5与HRas有较高的结合亲和力，可以选择性杀伤Ras高表达的癌细胞系，H5能够抑制Ras/MAPK信号通路并下调下游信号ERK等激酶的磷酸化水平，H5还可以有效抑制癌细胞的增殖和提高***细胞的放疗辐射敏感性。单甲基澳瑞他汀E(MMAE)是一种潜在的放疗辐射增敏剂，可以作为放疗辐射增敏研究中的正对照，实验发现多肽H5与MMAE联合用药后可以协同增强细胞凋亡情况，将细胞阻滞在G0/G1期，且在放疗辐射增敏研究中具有比多肽H5或MMAE单独用药更显著的疗效。本发明的实验表明，基于多肽的Ras抑制剂可能可以潜在地应用于放疗辐射增敏剂，该多肽抑制剂拓展了构象约束肽在放射治疗领域的研究，为开发高效的靶向Ras的抑制剂提供了思路，多肽与MMAE联合用药拓展了放射治疗领域中联合治疗的潜在应用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明通过荧光偏振检测、MTT实验等实验，证实该多肽可以很好的结合HRas蛋白，并抑制Ras高表达的***细胞等细胞系的生长。本发明的多肽具有抑制Ras高表达的***细胞等细胞系的生长和增加***细胞对X射线的辐射敏感性的功能，有益于解决癌细胞对X射线放射治疗抵抗性的问题，同时拓宽构象约束肽的应用范围。

附图说明

图1用荧光偏振方法测定H2-FITC和H5-FITC多肽与HRas蛋白的结合亲和力。

图2为多肽在纯水中的圆二色谱。

图3为流式细胞术实验测定FITC修饰的多肽的穿膜能力。

图4为激光共聚焦显微镜成像测定FITC标记的多肽H2、H5的穿膜能力和多肽在HeLa细胞中细胞质或细胞核的大致定位。。

图5为多肽L1H2H5的血清稳定性实验。

图6为多肽H2、H5的溶血活性。

图7使用MTT实验分析多肽L1H2H5对HeLa、A549、HepG2和293T细胞的杀伤能力。

图8为使用MTT实验分析多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药对HeLa细胞的杀伤能力，仅加DMSO的对照组设为Control组。

图9为用多肽H2、H5、MMAE以及H5+MMAE联合用药诱导HeLa细胞产生细胞凋亡情况的流式图。

图10为用多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药诱导HeLa细胞产生细胞凋亡的统计分析。分别统计了Q3(代表早期凋亡细胞)和Q2(代表中晚期凋亡细胞)区域的细胞数比例。细胞凋亡实验至少重复三次实验，实验数据统一作柱状图分析多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药诱导的细胞凋亡的情况。

图11为多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药将HeLa细胞阻滞在G2/M期细胞周期。

图12为多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药对HeLa细胞的细胞周期分布统计图。多肽H2、H5、MMAE以及H5+MMAE联合用药组与control组相比，G2/M期的细胞比例上升，表明各实验组能够将细胞阻滞在G2/M期。数据显示为平均值±标准差，至少重复三次独立实验。标准差在图中显示为误差线。

图13为研究多肽对Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中下游ERK的磷酸化水平的影响。(A)用多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药处理HeLa细胞24小时后，加入20ng/ml EGF刺激10min后，提取细胞裂解液进行western blot实验；(B)对western blot实验的结果进行半定量分析，即对pERK/GAPDH的相对含量进行分析。

图14为HeLa细胞用多肽H2、H5、MMAE以及H5+MMAE联合用药处理后进行X射线照射并进行克隆形成实验。(A)克隆形成存活率曲线；细胞加药后孵育24h，然后在不同剂量下给予X射线照射，将细胞消化，计数，重新种到六孔板中，等待9-11天让细胞长出克隆后，染色晾干并计数；10％存活分数线(SF10％)标注在图中，Vehicle是DMSO对照组；(B)克隆形成实验每个实验组的平均致死剂量D0值。实验数据使用GraphPad Prism 6.0软件通过two-tailed Student’s t检验执行。显著性水平显示为*P<0.05和**P<0.01。图中数据显示为平均值±标准差，标准差在图中显示为误差线。

图15为经过关环修饰后的多肽，用于抑制Ras-Sos相互作用，阻断Ras相关信号通路，增加癌细胞放疗敏感性的示意图。

图16为本发明所示多肽H5:H-WRR-cyclo(isoDFFDap)-IYLTNILKTQEGN-NH₂的HPLC谱图。

图17为本发明所示多肽H5:H-WRR-cyclo(isoDFFDap)-IYLTNILKTQEGN-NH₂的质谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明。

实施例1多肽的制备及分离纯化步骤：

使用固相合成法合成多肽，制备上述稳定多肽的核心步骤如下(以H5多肽为例)：

具体操作步骤为：

(1)多肽固相合成：称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中在接肽管中，用试剂体积比为50％(v/v)的***啉/N，N-二甲基甲酰胺(DMF)脱去树脂上的Fmoc保护基团，在N₂鼓吹下反应，30min/次，共两次，使树脂裸露出自由的氨基。然后用DMF溶剂/二氯甲烷(DCM)/N-甲基吡咯烷酮(NMP)等溶剂分别交替洗涤6-9次。然后加入5eq Fmoc-保护氨基但羧基裸露的氨基酸、5eq HCTU、10eq DIPEA，在N₂鼓吹下进行反应，1h/次，反应2次。然后用DMF/DCM/NMP等交替洗涤6-9次。接着用50％的***啉/DMF脱去氨基酸上的Fmoc保护基团，30min/次，共两次。然后加入5eq Fmoc-保护氨基但羧基裸露的氨基酸、5eq HCTU、10eqDIPEA，在N₂鼓吹下进行反应，1h/次，反应2次。如此循环进行，直到多肽接完。

(2)带有Allyl和Alloc保护基团的氨基酸如isoD和Dap氨基酸(市售产品)，用无水无氧的DCM溶解0.1eq的Pd(PPh₃)₄和4eq的1，3-二甲基巴比妥酸，反应2-3h以脱去Allyl和Alloc基团，用于接下来的关环反应。多肽上的氨基酸侧链上的-COOH和-NH₂的脱水关环反应用化合物六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)/1-羟基苯并三氮唑(HOBt)/N-甲基***啉(NMM)按照反应当量2eq：2eq：2.4eq反应溶液反应2h，反应2次。反应完成的多肽树脂用甲醇缩聚10分钟，用N₂吹干树脂。用剪切液TFA/TIS/H₂O(V_TFA/V_TIS/V_H2O＝95％：2.5％：2.5％)浸泡树脂2h，即可将多肽从树脂上切下来，得到多肽粗产品。用N₂吹干剪切液，利用多肽不易溶于***的特点，用冰***沉淀除去其他杂质，用50％乙腈水溶解多肽粗产品。多肽粗产品使用HPLC高效液相色谱进行分离纯化，得到纯的多肽产物，用质谱技术鉴定目标产物的分子量，本发明的多肽片段是由一个个氨基酸依次连接而成，每接3-5个氨基酸，通过质谱检测一次目标分子量，最终确定产物如前述的氨基酸结构。多肽产物的纯度通过分析型高效液相色谱HPLC和质谱法进行鉴定，本发明所示多肽(命名为H5多肽)的纯度约为96％，HPLC谱图如图16、质谱图如图17所示。

实施例2荧光偏振(FP)实验筛选与HRas结合的多肽

本发明用荧光偏振(FP)实验测定带有FITC标记的多肽与HRas蛋白的结合亲和力，实验结果总结在表1中。根据FP实验的结果可知，线性多肽L1仅显示与HRas蛋白较弱的相互作用，表明线性多肽L1与HRas的亲和力较弱，且作为基于从Sos蛋白关键片段上设计下来原始序列，可以作为后续实验的对照多肽。

基于多肽序列(FEGIYRLELLKAEEAN)进行设计得到的多肽H3、H4与HRas存在一定的相互作用，但结合亲和力都在微摩尔水平以上，结合亲和力较弱，表明基于该多肽序列设计的抑制剂还需要进一步的优化才能有更好的效果，因此后续并未在该序列上深入研究。值得注意的是，基于Sos1αH-螺旋的原始序列(FFGIYLTNILKTEEGN)设计而成的关环多肽H2和H5显示出与HRas蛋白较高的结合亲和力，K_D值分别为528.5nM和127.1nM(图1)，其中多肽H5的序列是在多肽H2序列的基础上，突变其C端上第二个谷氨酸为谷氨酰胺，该结果表明多肽上单个氨基酸的突变也会引起多肽与靶蛋白结合亲和力的明显变化，为设计合理的多肽抑制剂提供了思路。后续研究集中在H5多肽的生物学应用上。

表1 Ras多肽抑制剂的序列和多肽与HRas的结合亲和力

实施例3 Ras多肽的圆二色谱结果

为了测定多肽在水溶液中的二级构象，本发明用圆二色谱仪测定了多肽的圆二色谱(CD)谱图。根据圆二色谱谱图中208nm和222nm附近的特征的负吸收峰以及在190nm附近的特征的正吸收峰，可以判断多肽具有典型的α螺旋构象。CD实验结果表明，用末端天冬氨酸成核模板关环的多肽H2、H3、H5、H8、H10和H11在其圆二色谱(CD)测定实验中显示典型的α螺旋构象(图2)，而未关环的线性多肽L1显示出无规卷曲构象，该结果证实了用TD末端成核模板能够较大效率地将多肽稳定在α螺旋构象。

实施例4流式细胞术实验测定多肽的穿膜能力

多肽对癌细胞的细胞膜穿膜能力是表征多肽是否能发挥细胞内功能的重要因素，本发明进行了流式细胞术实验和激光共聚焦显微镜成像实验探讨了多肽的细胞膜穿膜能力。

首先对多肽进行异硫氰酸荧光素(FITC)修饰，并用5μM FITC标记的多肽处理HeLa细胞1小时，然后用PBS和0.4％台盼蓝洗涤去掉多余的FITC标记的多肽，胰酶消化细胞，洗涤，然后进行流式细胞术分析。实验结果表明，与经典的穿膜肽TAT-FITC(多肽序列为FITC-RKKRRQRRR)相比，多肽H2-FITC、H5-FITC有较好的细胞膜穿膜能力(图3)，其他多肽与TAT-FITC相比显示出较弱的细胞膜穿膜能力。在流式细胞术实验中，TAT-FITC作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。

实施例5激光共聚焦显微镜成像探讨多肽的穿膜能力

为了进一步研究多肽的细胞膜穿膜能力和多肽在细胞内可能的大致定位，本发明对用多肽处理后的细胞进行了激光共聚焦显微镜成像实验。首先将HeLa细胞种在含有细胞圆形爬片的24孔板中生长过夜，接着用5μM FITC标记的多肽处理HeLa细胞1小时，然后用PBS和0.4％台盼蓝交替洗涤去掉多余的附在细胞膜表面的多肽，随后用含DAPI染料(能够与DNA高效结合的染料，可以用来给细胞核染色)的封片剂将细胞爬片固定在载玻片上，自然干燥，最后用激光共聚焦显微镜进行细胞成像，DAPI染料用405nm通道下的激发光激发，FITC染料用488nm通道下的激发光激发。在激光共聚焦显微镜成像实验中，用具有较好穿膜能力的多肽TAT-FITC作为阳性对照，DMSO作为阴性对照，用以相对比较多肽的细胞膜穿膜能力。共聚焦显微镜成像结果表明，与阳性对照组细胞穿膜肽TAT-FITC相比，多肽H2-FITC和H5-FITC处理的细胞均能发现细胞内有明显绿色荧光，表明多肽H2-FITC和H5-FITC显示出较强的细胞膜穿膜能力，且H2-FITC和H5-FITC在细胞质和细胞核中均有分布(图4)。共聚焦显微镜成像的实验结果和上述流式细胞术实验结果相一致，均表明了多肽H2-FITC和H5-FITC显示出较强的细胞膜穿膜能力，可以穿过细胞膜进入到细胞内，从而更好地靶向细胞内的靶点蛋白以发挥其生物学功能。

实施例6多肽的血清稳定性实验

综合以上实验发现，H2和H5多肽具有与HRas较高的结合亲和力，较好的细胞膜穿膜能力，因此在接下来的研究中选取最具代表性的H2、H5多肽进行深入的研究。多肽的稳定性是多肽在体内发挥其生物学功能的重要因素，接下来用体外血清稳定性实验表征多肽的稳定性。实验结果表明，多肽与25％小鼠血清在37℃水浴中共孵育24小时后，大约有60％的多肽H2和H5在25％小鼠血清中保持完整和稳定(图5)，而线性肽L1则被小鼠血清很快地降解，表明用N末端天冬氨酸成核模板关环后的α螺旋多肽具有在血清中更高的稳定性。

实施例7多肽的溶血性实验

小鼠新鲜红细胞的溶血实验是检验多肽对细胞膜的破坏而引起溶血情况的研究实验，多肽具有较低的对红细胞的溶血活性是保证多肽能安全用于细胞实验的前提。在溶血活性测定中，Triton X100是一类非离子型表面活性剂，0.1％Triton X100即可明显破坏细胞膜，在溶血性实验中用作阳性对照。多肽的溶血性实验结果表明，在多肽低于40μM的浓度下，多肽H2和H5表现出较低的溶血性(图6)，说明多肽具有较低的对细胞膜的非特异性毒性，表明多肽可以安全用于下一步的细胞实验。

实施例8MTT实验测定细胞存活率

为了进一步评估这些多肽对癌细胞的杀伤效果，进行了MTT测定细胞存活率实验。本发明系统研究了多肽H2和H5对Ras过表达的癌细胞系(HeLa、A549或HepG2细胞)和普通293T细胞的增殖抑制作用，L1线性多肽作为多肽对照组。MTT实验结果表明多肽H5能够以剂量依赖的方式抑制HeLa、A549和HepG2细胞的增殖，并且显示较低的对293T细胞的毒性，表明多肽H5对Ras过表达的癌细胞系具有较高的选择性(图7)；H2多肽对HeLa、A549和HepG2细胞也有一定的杀伤能力，但是比H5多肽效果要弱一些；H5、H2和L1线性多肽对293T细胞同样具有较低的细胞毒性。

H5对Ras过表达的癌细胞系表现出较高的选择性和杀伤能力，接下来用较具代表性的H5多肽参与和潜在放疗增敏剂单甲基澳瑞他汀E(MMAE)联合用药的研究。首先测试了H2、H5多肽、MMAE以及H5+MMAE联合用药后对HeLa细胞的杀伤能力(图8)。前期实验摸索药物联用的使用比例时发现，MMAE对细胞的杀伤能力较强，5nM的MMAE就能使大部分的细胞死亡，为了合理研究多肽与MMAE联用的效果，降低了MMAE的使用浓度，实验发现，0.5nM的MMAE和10μM H5多肽联合用药可以使约50％HeLa细胞死亡，故联合用药的使用比例设置为10μMH5多肽+0.5nM MMAE。实验结果表明H2、H5多肽在10μM浓度下能明显抑制HeLa细胞的增殖，与MTT实验结果相一致；MMAE在0.5nM的低浓度下也有较明显的抑制HeLa细胞增殖的效果，H5多肽与MMAE联合用药在抑制HeLa细胞增殖方面表现出更强的抑制作用，初步展示了H5+MMAE联合用药发挥协同效应以抑制癌细胞增殖的疗效。

实施例9 Annexin-V/PI双染实验测定细胞凋亡

根据文献调研可知，Ras/MAPK信号通路参与细胞生长发育和细胞凋亡等细胞生理活动的调节，为了评估多肽是否对HeLa细胞的细胞凋亡现象产生影响，本发明接着进行了Annexin-V/PI双染实验测定细胞凋亡情况。实验结果表明，多肽H2、H5可以诱导HeLa细胞产生明显的细胞凋亡现象，即流式细胞图中Q3Q2区域分别代表的早期凋亡和中晚期凋亡的细胞数比例增加(图9)。值得注意的是，多肽H5(10μM)+MMAE(0.5nM)联合用药组可以增强诱导HeLa细胞产生早期凋亡和中晚期细胞凋亡的效果(图10)，与单独多肽加药组或者单独MMAE加药组相比具有较强的诱导细胞产生细胞凋亡的作用，表明了联合加药具有协同增强诱导细胞凋亡的效果。

实施例10细胞周期实验

本发明接着研究了多肽对HeLa细胞的细胞周期产生的影响。在细胞周期实验测定中，首先将HeLa细胞培养在六孔板中，接着用特定浓度的多肽H2、H5、MMAE和H5+MMAE联合用药与HeLa细胞共孵育24小时，消化离心收集全部细胞，用PBS洗涤，用70％冰乙醇固定4小时以上，用PBS洗涤，然后在37℃水浴中进行碘化丙啶PI染色30分钟，最后用流式细胞仪检测HeLa细胞的细胞周期阻滞情况。

根据流式细胞图中，每个实验组的G0/G1期、S期、G2/M期的细胞数比例相对于DMSO对照组的变化，可以判断细胞被阻滞在特定的细胞周期。实验结果表明，H2多肽、H5多肽、MMAE以及H5+MMAE联合用药组处理的HeLa细胞显示G2/M期的细胞数比例相对于对照组明显上升(图11)；根据各个细胞周期的细胞数比例做统计图分析，结果表明H2多肽、H5多肽、MMAE以及H5+MMAE联合用药组的细胞的有丝***细胞周期阻滞在G2/M期，其中H5+MMAE联合用药组表现出比单独加药组更好地效果，表明H5多肽和MMAE可能发挥协同效应将细胞共同阻滞在G2/M期(图12)。

实施例11蛋白质免疫印迹实验测定多肽对Ras信号通路的影响

大量的文献报道表明，抑制Ras蛋白的小分子或多肽抑制剂会影响Ras-Raf-MEK-ERK信号通路下游的磷酸化级联反应，表现为Raf、MEK、ERK蛋白的磷酸化水平会降低。本发明使用蛋白质免疫印迹实验来测试多肽对Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的影响，主要考察了对该信号最下游的ERK蛋白的磷酸化水平的影响。将多肽与HeLa细胞共孵育24h后，加入20ng/ml生长因子(EGF)刺激10min，收集培养基上清细胞和底部细胞，提取细胞裂解液，进行western blot实验测定ERK蛋白磷酸化水平的变化。实验结果表明H5多肽、MMAE以及H5+MMAE联合用药组可以明显抑制ERK蛋白的磷酸化水平(图13)

实施例12克隆形成实验测定多肽的放射增敏性

克隆形成实验可以表征癌细胞对药物的放疗增敏作用。细胞克隆，即单个细胞贴壁后进行增殖并生长形成具有一定细胞数的克隆；能形成克隆的细胞必定是可以贴壁且有较强增殖活力的细胞，经药物处理以及X射线照射后增殖活力较弱的细胞可能无法形成克隆。本发明采用克隆形成实验以测试多肽是否能引起HeLa细胞对X射线的放疗敏感性。MMAE是一个已报道的潜在的放疗增敏剂，可以用作本实验中单组分组加药的阳性对照。D₀值是评估放射增敏性的重要参数之一，D₀值是平均致死剂量，理论上是导致每个细胞被X射线击中的平均辐射剂量。通过对克隆形成存活率数据利用单击多靶模型进行拟合后得到了克隆形成存活率曲线并可以直接得到各实验组的平均致死剂D₀值。

图14A中展示了多肽处理HeLa细胞并经X射线照射后各实验组的克隆形成存活率曲线，与Vehicle(DMSO对照组)相比，多肽H5、MMAE以及H5+MMAE均能明显下调克隆形成存活率曲线。与Vehicle相比，H5多肽和MMAE实验组的D0值显著降低(图14B)，表明H5多肽和MMAE均可降低克隆形成存活率并增加HeLa细胞的放疗辐射敏感性。值得注意的是，10μM H5多肽与0.5nM MMAE的联合用药组显示出具有更小的D₀值，表明H5+MMAE联合用药可以发挥协同效应进一步增强放射治疗增敏作用，充分显示了H5+MMAE联合用药在放疗增敏研究方面的潜在应用。

如图15所示，基于Ras-Sos1蛋白复合物晶体结构中相互作用界面上Sos蛋白上的一段α螺旋多肽，本发明合成了经过TD策略关环修饰后的多肽，并对多肽进行定点氨基酸突变，筛选靶向Ras蛋白的有效多肽抑制剂，用于抑制Ras-Sos相互作用，进一步阻断Ras/MAPK信号通路，以增加癌细胞对X射线的放疗敏感性的示意图。RTK代表受体酪氨酸激酶。

序列表

<110> 北京大学深圳研究生院

深圳湾实验室坪山生物医药研发转化中心

<120> 一种靶向HRas蛋白的α螺旋多肽抑制剂及其用途

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Phe Phe Gly Ile Tyr Leu Thr Asn Ile Leu Lys Thr Glu Glu Gly Asn

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<210> 2

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Leu Thr Asn Ile Leu Lys Thr Glu Glu Gly Asn

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Ile Tyr Leu Thr Asn Ile Leu Lys Thr Glu Glu Gly Asn

1 5 10

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<212> PRT

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Ile Tyr Arg Leu Glu Leu Leu Lys Ala Glu Glu Ala Asn

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Arg Leu Glu Leu Leu Lys Ala Glu Glu Ala Asn

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<212> PRT

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Leu Thr Asn Ile Leu Lys Thr Gln Glu Gly Asn

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